Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng Agrobacterium tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10 - Nguyễn Việt Phương

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 105-110 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG Agrobacterium tumefaciens DPXS12 TÁI TỔ HỢP SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 Nguyễn Việt Phương, Đặng Thị Thu, Trương Quốc Phong* Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, *phong.truongquoc@hust.edu.vn TÓM TẮT: Coenzyme Q10 (CoQ10) ngày càng được sử dụng nhiều làm thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe; ngoài ra CoQ10 cũng được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp và được đưa vào mỹ phẩm như một tác nhân chống lão hóa da. Vì vậy, nhu cầu về CoQ10 ngày càng tăng lên. Việc sản xuất CoQ10 được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và công nghệ sinh học, trong đó việc sản xuất bằng con đường công nghệ sinh học có nhiều ưu điểm và ngày càng được ưu tiên. Trong bài báo này, một số điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 đã được nghiên cứu. Với các nguồn carbon được khảo sát (sucrose, lactose, glucose, galactose, mannose, xylose), chủng A. tumefaciens DPXS12 có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất trên nguồn sucrose với nồng độ 5%. Cao ngô (1%) phối trộn với (NH4)2SO4 (2%) là nguồn nitơ thích hợp nhất trong số các nguồn nitơ được khảo sát cho chủng A. tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp CoQ10 hiệu quả. Chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất ở nhiệt độ 28oC, pH 7,0. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10 đạt cao nhất sau 96 giờ nuôi cấy. Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Coenzyme Q10, nuôi cấy, tái tổ hợp, tối ưu. MỞ ĐẦU Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10) là hợp chất sinh học có tính chất chống oxy hóa mạnh, trung hòa các gốc tự do nên ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp [1, 9-11]. Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để đáp ứng nhu cầu đó đã có nhiều phương pháp được sử dụng như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay nhiều nghiên cứu đã và đang tập trung vào sử dụng vi sinh vật như là đối tượng để sản xuất CoQ10 [4, 8, 12, 13, 15-17]. Trong số những vi sinh vật được nghiên cứu, Agrobacterium tumefaciens được xem như là vi sinh vật có tiềm năng nhất vì chúng này có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 cao nhất so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp [8, 17]. Hiện nay giá thành của CoQ10 còn cao do hiệu suất thu nhận CoQ10 từ vi sinh vật còn thấp. Để góp phần nâng cao hiệu suất thu nhận CoQ10 từ vi sinh vật, chúng tối đã tạo được chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp có khả năng tổng hợp COQ10 cao hơn khoảng 1,8 so với chủng tự nhiên. Mục đích của nghiên cứu này nhằm xác định một số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp phù hợp quy mô sản xuất lớn tạo CoQ10 ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu là chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Môi trường nhân giống: glucose 6%; cao nấm men 1,5%; peptone 1,5%; NaCl 0,75%. Môi trường tổng hợp CoQ10 ban đầu: Sucrose 5,0%; cao nấm men 2,0%; peptone 2,0%; KH2PO4 0,025%; K2HPO4 0,05%; (NH4)2SO4 2,0%; MgSO4.7H2O 0,025; CaCO3 0,2%. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sự tổng hợp CoQ10 được nghiên cứu sử dụng các nguồn cacbon khác nhau bao gồm sucrose, lactose, glucose, galactose, mannose và xylose. Nồng độ đường sucrose lựa chọn khảo sát với các tỷ lệ như sau: 0; 2,5; 5; 7,5 và 10%. Nguồn nitơ được nghiên cứu bao gồm dịch cao ngô (CSL), cao nấm men, peptone, tryptone, malt extract, (NH4)2SO4 và ure với nồng độ dịch cao ngô lựa chọn được khảo sát: 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5%. Chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp được khảo sát lên men ở các dải nhiệt độ khác nhau: 20, 25, 28, 30 và 37oC; pH ban đầu 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0. Phương pháp tách chiết CoQ10 CoQ10 được tách chiết theo quy trình mô tả bởi Ranadive et al. (2011) [12] với một số biến đổi và được mô tả tóm tắt như sau: trộn sinh khối với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở 37oC trong 24 giờ, ly tâm thu dịch, chiết với hexan(1:1), cô đặc đến khô hoàn toàn và hòa tan CoQ10 trong ethanol 100%. Phương pháp xác định hàm lượng Coenzyme Q10 Hàm lượng CoQ10 được xác định dựa trên phản ứng Craven như mô tả bởi Shimada et al. (2007) [13]. Quy trình có thể tóm tắt như sau: Bổ sung 500 µl 100 mM Ethylcyanoacetate vào 500 µl dung dịch CoQ10, trộn đều ủ trong 6 phút, bổ sung 100 µl 0,4 M KOH. Cường độ màu được xác định ở bước sóng 625 nm. CoQ10 được định lượng dựa vào phương trình tuyến tính giữa cường độ màu và hàm lượng CoQ10 chuẩn và kiểm nghiệm bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC). Dịch chiết CoQ10 được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột C18 (250 mm × 4,6 mm), sử dụng ethanol và methanol là pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là 35oC. Hàm lượng CoQ10 trong mẫu được xác định dựa vào phương trình tuyến tính giữa diện tích đỉnh hấp thụ của CoQ10 tại bước sóng 275 nm và hàm lượng CoQ10 chuẩn. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 Để xác định nguồn cacbon thích hợp cho tổng hợp CoQ10, canh trường nuôi cấy được chuẩn bị với các nguồn cacbon khác nhau. Kết quả cho thấy, trong 6 nguồn cacbon khảo sát gồm sucrose; lactose; glucose; mannose galactose và xylose, hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất (16 mg/L) khi sử dụng nguồn cacbon là sucrose (hình 1A). A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp có khả năng sinh trưởng và tổng hợp CoQ10 thấp nhất trên nguồn xylose và chỉ bằng 57% so với đường sucrose. Kết quả nghiên cứu này hoàn phù hợp với nghiên cứu trước đây của Ha et al. (2007) [7]. Từ kết quả trên, đường sucrose được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tối ưu. Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ sucrose ban đầu đến sự sinh trưởng và tổng hợp CoQ10, các nồng độ sucrose khác nhau 0; 2,5; 5; 7,5; 10 % đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên khi nồng độ sucrose tăng và đạt cao nhất 18,42 mg/L ở nồng độ sucrose 5%. Hàm lượng CoQ10 thu được giảm đi khi nồng độ sucrose tăng lên đến 7,5 và 10% (hình 1B). Khi nồng độ đường tăng cao đã làm giảm mức độ sinh trưởng của A. tumefaciens tái tổ hợp dẫn đến giảm hàm lượng CoQ10 thu nhận. Vì vậy, sucrose với nồng độ 5% được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 Tương tự nguồn cacbon, các nguồn nitơ khác nhau bao gồm cao ngô (CSL), cao nấm men, peptone, tryptone, dịch chiết malt, (NH4)2SO4 và ure đã được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10. Kết quả cho thấy, hàm lượng CoQ10 thu được khác nhau; cụ thể, trong số 7 nguồn nitơ được khảo sát CoQ10 thu được cao nhất đạt 26,68 mg/L khi sử dụng CSL (hình 1C). CSL chứa các thành phần hòa tan trong nước, trong đó chủ yếu là các axit amin, peptide, carbohydrate và muối; ngoài ra CSL còn rất giàu vitamin và các hợp chất kích thích sinh trưởng khác [5]. Vì vậy, CSL được sử dụng như một nguồn nitơ hiệu quả trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [3, 8, 14]. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, khi sử dụng (NH4)2SO4 làm nguồn nitơ hàm lượng CoQ10 thu được cũng tương đối cao, đạt 17,95 mg/L. Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Yuan et al. (2012) [15]. Vì vậy, CSL và (NH4)2SO4 đã được sử dụng đồng thời làm nguồn nitơ cho nghiên cứu tiếp theo. Các nồng độ CSL khác nhau 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5% kết hợp với 2% (NH4)2SO4 đã được nghiên cứu và kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được đạt cao nhất ở nồng độ CSL là 1% đạt 54,19 mg/L (hình 1D). Khi nồng độ CSL tăng lên, hàm lượng CoQ10 giảm dần, tại nồng độ CSL 5%, hàm lượng CoQ10 chỉ còn 40% (giảm 32.12 mg/L) so với nồng độ CSL là 1%. Vì vậy, nồng độ CSP 1% phối trộn cùng 2% (NH4)2SO4 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. A CA B D Hình 1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nồng độ sucrose (B), nguồn nitơ (C), nồng độ CSL (D) đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 Để đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp, quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp CoQ10 được tiến hành ở các giá trị pH ban đầu 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 và giá trị pH được xác định lại ở thời điểm cuối. Kết quả cho thấy với pH đầu là 7,5-8,0 và pH cuối đạt 7,0 hàm lượng CoQ10 thu được là cao nhất đạt 68,8 mg/L sau 96 giờ (hình 2A). Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 giảm đi khi pH ban đầu từ 6,0-7,0 và pH cuối khoảng 6,5. Theo kết quả nghiên cứu của Ha et al. (2007) [8], pH lên men tối ưu là 7,0 và từ kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 bởi A. tumefaciens nên thực hiện với pH 7,0. C A BA Hình 2. Ảnh hưởng của pH ban đầu (A), nhiệt độ (B), thời gian (C) lên men đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens tái tổ hợp Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 A. tumefaciens được xem là vi khuẩn tương đối nhạy cảm với điều kiện nuôi cấy [2]. Trong nghiên cứu này, chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp đã được lên men ở các nhiệt độ khác nhau 20, 25, 28, 30 và 37oC. Kết quả cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens DPXS12. Hàm lượng CoQ10 đạt cao nhất ở 28oC (125 mg/L) (hình 2B). Ở nhiệt độ nuôi cấy 20 và 37oC, hàm lượng CoQ10 giảm mạnh, tương ứng chỉ còn 36,6% và 10,8% so với 28oC. Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 28oC là phù hợp để lên men sinh tổng hợp CoQ10. Ảnh hưởng của thời gian Kết quả cho thấy, hàm lượng CoQ10 thuđược tăng lên theo thời gian lên men (hình 2C). So sánh hàm lượng CoQ10 theo thời gian, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% (tăng 2,57 mg/L) so với 96 giờ lên men. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu các tác giả khác [3, 6, 8]. Từ kết quả nhận được thời gian 96 giờ được lựa chọn để thu nhận CoQ10 trong quá trình lên men. KẾT LUẬN Đã nghiên cứu được sự ảnh hưởng của một số yếu tố như nguồn cacbon, nitơ, pH, nhiệt độ, thời gian đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp. Xác định được một số điều kiên thích hợp để lên men sinh tổng hợp CoQ10 bao gồm sử dụng nguồn sucrose 5%, cao ngô 1% kết hợp với (NH4)2SO4, pH 7,0, nhiệt độ 28oC, thời gian thu nhận CoQ10 là sau 96 giờ lên men. Lời cảm ơn: Công trình này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB của Bộ Công thương. TÀI LIỆU THAM KHẢO Alan R. G., 1996. The Role of Coenzyme Q10 in Clinical Medicine. Alt. Med. Rev., 1: 11-17. Baron C., Domke N., Beinhofer M., Hapfelmeier S., 2001. Elevated temperature differentially affects virulence, VirB protein accumulation, and T-Pilus formation in different Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium vitis strains. J. Bacteriol., 183(23): 6852-6861. Cheong S. R., Kim S. Y., Kul J., Cheol H., Ha S. J., 2008. Fermentation process for preparing Coenzyme Q10 by the recombinant Agrobacterium tumefaciens”. Patent Application Publication US 2008/0261282 A1. Choi J. H., Ryu Y. W., Seo J. H., 2005. Biotechnological production and applications of coenzyme Q10. Appl. Microbiol. Biotechnol., 68: 9-15. Daniels R.S., 2012. Corn Steep Liquor as a biostimulant composition. Patent Number US20120028801 A1. Gu S. B., Yao J. M., Yuan Q. P., Xue P. J., Zheng Z. M., Yu Z. L., 2006. Kinetics of Agrobacterium tumefaciens ubiquinone-10 batch production. Process Biochem., 41: 1908-1912. Ha S. J., Kim S. Y., Seo J. H., Moon H. J., Lee K. M., Lee J. K., 2007. Controlling the sucrose concentration increases coenzyme Q10 production in fed-batch culture of Agrobacterium tumefaciens. Appl. Microbiol. Biotechnol., 76: 109-116. Ha S. J., Kim S. Y., Seo J. H., Oh D. K., Lee J. K., 2007. Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens. Appl.Microbiol. Biotechnol., 74: 974-980. Munkholm H., Hansen H. H. T., Rasmussen K., 1999. Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure. Biofactors, 9: 285-289. Overvad K., Diamant B., Holm L., Holmer G., Mortensen S. A., Stender S., 1999. Q10 in health and disease. Europ. J. Clin. Nutr., 53: 764-770. Prakash S., Sunitha J., Hans M., 2010. Role of coenzyme Q10 as an antioxidant and bioenergizer in periodontal diseases. Indian J. Pharmacol., 42(6): 334-337. Ranadive P., Mehta Alka., George Saji., 2011. Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii-ATCC. Int. J. Chem. Eng. Appl., 2(3): 216-220. Shimada H., Kodjabachian D., Ishida M., 2007. Specific and rapid analysis of ubiquinones using Craven’s reaction and HPLC with postcolumn derivatization. J. Lipid Res., 48: 2079-2085. Urakami T., Yoshida T., 1993. Production of ubiquinone and bacteriochlorophyl a by Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter sulfidophilus. J. Ferment. Bioeng., 76(3): 191-194. Yuan Y., Tian Y., Yue T., 2012. Improvement of Coenzyme Q10 Production: Mutagenesis Induced by High Hydrostatic Pressure Treatment and Optimization of Fermentation Conditions. J. Biomed. Biotechnol. Doi: 10.1155/2012/ 607329. Yoshida H., Kotani Y., 1998. Production of ubiquinone-10 using bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol., 44: 19-26. Zahiri H. S., Yoon S. H., Keasling J. D., 2006. Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway. Metab. Eng., 8: 406-416. Zahiri H. S., Noghabi K. A., Samoodi M., Yeganeh N. O., Rad S. A., Safari A., Hoseini F., Hajhosseini R., 2009. Effect of concomitant lycopene biosynthesis on CoQ10 accumulation in transformed Escherichia coli strains. Iranian. J. Biotechnol., 7(4): 224-232. OPTIMIZATION OF CULTURE CONDITIONS FOR COQ10 BIOSYNTHESIS BY RECOMBINANT Agrobacterium tumefaciens Nguyen Viet Phuong, Dang Thi Thu, Truong Quoc Phong School of Biotechnology and Food Technology, Hanoi University of Science and Technology SUMMARY Coenzyme Q10 (CoQ10) is increasingly being used as the functional foods, improving the health; furthermore CoQ10 also can be used in treatment of several severe diseases such as cardiovascular disease, diabetes, Parkinson and added to cosmetic as an anti-aging agent for skin. Therefore CoQ10 demand is greatly increased. Production of CoQ10 can be performed by several ways such as chemical synthesis, semi-chemical synthesis and biotechnology, in which biosynthesis is more advantages and increasingly prioritized. In the present study, some optimal culture conditions for CoQ10 producing recombinant Agrobacterium tumefaciens DPXS12 strain were investigated. For investigated sugars (sucrose, lactose, glucose, galactose, mannose, xylose), the highest level of CoQ10 was obtained from A. tumefaciens DPXS12 using 5% sucrose as carbon source. Corn steep liquor (1%) in combination with (NH4)2SO4 (2%) was an appropriate nitrogen source for CoQ10 production by A. tumefaciens DPXS12. Optimal conditions for CoQ10 production by recombinant A. tumefaciens DPXS12 were 28oC and pH 7.0. The growth and CoQ10 production dynamics indicated that the highest CoQ10 level was 96 h fermentation. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Coenzyme Q10, culture, optimization, recombinant. Ngày nhận bài: 22-10-2014