Nghiên cứu chế độ thủy phân thu dịch đạm hòa tan giàu axit amin từ protein cá tạp

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 138 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ THỦY PHÂN THU DỊCH ĐẠM HÒA TAN GIÀU A XÍT AMIN TỪ PROTEIN CÁ TẠP STYDY MODE OF HYDROLYSIS TO OBTAIN SOLUBLE PROTEIN SOLUTION THAT RICH IN AMINO ACIDS FROM TRASHFISH PROTEIN Đỗ Thị Thanh Thủy1, Nguyễn Anh Tuấn2 Ngày nhận bài: 20/5/2013; N gày phản biện thông qua: 02/6/2013; Ngày duyệt đăng: 10/12/2013 TÓM TẮT Dịch đạm hòa tan đã được nghiên cứu sản xuất từ protein cá nục gai bằng hỗn hợp Protamex và Flavourzyme ở pH tự nhiên với tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện thủy phân thích hợp là: tỷ lệ Protamex - Flavourzyme 1:1, tỷ lệ hỗn hợp enzyme - cơ chất là 0,3%, nhiệt độ 55oC, thời gian 6 giờ. Độ thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ và tổng nitơ bazơ bay hơi trong dịch thủy phân thu được lần lượt đạt là 60,50%, 83% và 0,98 g/l. Sản phẩm thu được chứa hàm lượng nitơ a xít amin 13,27 g/l, histamine 0,62 mg/100 g, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Từ khóa: cá nục gai, Protamex, Flavourzyme, dịch đạm thủy phân ABSTRACT Soluble protein solution was studied to produce from Decapterus russelli by the combination of Protamex and Flavourzyme at natural pH with a water/material of 1/1. Results showed that the optimal hydrolysis condition as followed: Protamex - Flavourzyme ratio, the ratio between enzyme mixture and material, hydrolysis temperature, hydrolysis time were 1/1 (w/w), 0.3(w/w), 55oC, 6 hours, respectively. Degree of hydrolysis, nitrogen recovery and total volatile basic nitrogen in obtained hydrolysate solution were 60,50%, 83% và 0,98 g/l, repectively. The protein hydrolysate included amino acids content of 13.27 g/l and histamine content of 0.62 mg/g, have the potential applications in many fi elds. Keywords: Decapterus russelli, Protamex, Flavourzyme, protein hydrolysate 1 Đỗ Thị Thanh Thủy: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 - Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Nguyễn Anh Tuấn: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong các loài cá kém giá trị kinh tế, cá nục gai là loài có sản lượng rất lớn. Hiện nay, cá nục gai chỉ được sử dụng để ăn tươi, làm khô, làm nước mắm, làm thức ăn trong chăn nuôi, một ít xuất khẩu dưới dạng đông lạnh để làm mồi câu, đem lại hiệu quả kinh tế chưa cao. Vấn đề nghiên cứu tạo ra sản phẩm giá trị gia tăng từ nguồn cá nục gai tuy nhiều nhưng chưa được chế biến hợp lý là rất cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng tài nguyên, mang lại thu nhập nhiều hơn cho người dân. Nghiên cứu tìm ra chế độ thủy phân thích hợp để thu dịch đạm hòa tan giàu a xít amin từ protein cá nục gai là cơ sở quan trọng để tiếp tục phát triển sản xuất ra nhiều dòng sản phẩm giá trị gia tăng như: các loại nước chấm cao cấp, bổ sung dinh dưỡng cho nhiều loại thực phẩm, ứng dụng trong nông học, y dược... II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu 1.1. Cá nục gai Đối tượng cá nục gai được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ, thành phố Nha Trang. Cá còn tươi nguyên, sáng bóng, mùi tanh đặc trưng, không bị dập nát tổn thương, kích cỡ 21 ÷ 22 con/kg, cá được rửa, loại bỏ tạp chất, bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp cách nhiệt ở 0 ÷ 4oC. Tại phòng thí nghiệm, để đảm bảo tính đồng nhất, cá được rửa, để ráo, xay nhỏ, trộn đều, phân chia, bao gói bằng bằng bao PA hút chân không, lạnh đông và bảo quản ở nhiệt độ -20 ± 2oC. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 139 1.2. Enzyme Protamex và Flavourzyme Protamex (EPro) và Flavourzyme (EFla) là các enzyme protease được cung cấp bởi Công ty Novozyme của Đan Mạch. EPro là một endopeptidase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus có hoạt độ ghi trên nhãn là 1,5 AU (Anson Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp là nhiệt độ 35 ÷ 60oC, pH = 5,5 ÷ 7,5. EFla có cả hoạt tính của endopeptidase và của exopeptidase nhưng chủ yếu là exopeptidase, có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae, (Kamnerdpetch và cộng sự, 2007), hoạt độ ghi trên nhãn là 500 LAPU (Leucine Aminopeptidase Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp là 50 ÷ 55°C, pH = 5,0 ÷ 7,0. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Sơ đồ quy trình và bố trí thí nghiệm - Nguyên liệu cá nục: là mẫu được thu và xử lý như mục 1.1, rã đông ở độ 0 ÷ 4oC, 15 giờ. - Các thông số thích hợp được xác định bằng thực nghiệm cổ điển: xác định thông số thứ nhất bằng thí nghiệm cố định các thông số khác (dựa trên vào sự kế thừa), cho thông số cần tìm biến đổi để tìm giá trị thích hợp. Sau khi tìm được thông số thứ nhất thì cố định thông số này và làm tương tự để tìm thông số thứ hai. Tiếp tục như vậy đến khi tìm được tất cả thông số cần tìm. - Xác định tỷ lệ giữa 2 enzyme thích hợp: bố trí EPro:EFla = 1:0, 1:2, 1:3, 1:1, 2:1, 3:1, 0:1; W/NL = 1/1, pH tự nhiên của cá, (EPro + EFla)/S = 0,3%, nhiệt độ 50oC, thời gian 3 giờ. - Xác định tỷ lệ hỗn hợp enzyme - cơ chất thích hợp: bố trí (EPro + EFla)/S = 0,1 ÷ 0,5%, bước nhảy δ = 0,1%; tỷ lệ giữa 2 enzyme tìm được ở thí nghiệm trước, nhiệt độ 50oC, thời gian 3 giờ. - Xác định nhiệt độ độ thủy phân thích hợp: bố trí ttp = 45 ÷ 65oC, bước nhảy δ = 5oC; tỷ lệ giữa hai loại enzyme, (EPro + EFla)/S tìm được ở 2 thí nghiệm trước, thời gian 3 giờ. - Xác định thời gian thủy phân thích hợp: bố trí T = 3 ÷ 7 giờ, bước nhảy δ = 1 giờ; tỷ lệ giữa hai loại enzyme, (EPro + EFla)/S, nhiệt độ tìm được ở 3 thí nghiệm trước, W/NL = 1/1, pH tự nhiên của cá. - Bất hoạt enzyme ở 95oC trong vòng 15 phút. - Các chỉ tiêu đánh giá: tỷ lệ nitơ a xít amin/ nitơ tổng số (Naa/NTS), độ thủy phân (DH), hiệu suất thu hồi nitơ (HSTH), tổng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N). - Thông số được chọn là thích hợp trong thí nghiệm phải thỏa mãn tốt nhất 4 điều kiện đồng thời: tỷ lệ Naa/NTS là cao nhất, HSTH cao nhất, DH cao nhất, TVB-N ở mức hợp lý. 2.2. Phương pháp phân tích Độ ẩm: theo TCVN 3700-90; Tro: phương pháp nung ở 600oC; Hàm lượng lipid: theo TCVN 3703:2009; Hàm lượng nitơ tổng số: theo TCVN 3705-90; Hàm lượng NH3 và TVB-N: theo TCVN 9215:2012; Hàm lượng nitơ a xít amin: theo phương pháp formon; thành phần a xít amin: sắc ký hiệu năng cao HPLC; Độ thủy phân DH: theo phương pháp DNFB; HSTH = Lượng nitơ tổng số trong sản phẩm thủy phân (g) x 100/Lượng nitơ tổng số trong nguyên liệu đem thủy phân (g). 2.3. Phương pháp xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm được thực hiện song song ba lần, mỗi lần ba mẫu. Số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0, tính toán trên phần mềm Microsoft Offi ce Excel 2007 (giá trị của p < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê). Hình 1. Sơ đồ quy trình và bố trí thí nghiệm Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 140 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hình 2 và 3 cho thấy: Hỗn hợp Protamex và Flavourzyme tỷ lệ khác nhau có hiệu lực thủy phân khác nhau đối với protein của cá nục gai. Không có tỷ lệ nào thỏa mãn được đồng thời 4 điều kiện đặt ra theo mục tiêu của thí nghiệm. Tuy nhiên tỷ lệ EPro:EFla = 1:1 là điểm thí nghiệm đáng chú ý nhất, đạt giá trị DH = 45,19% cao hơn các tỷ lệ khác (trừ tỷ lệ 1:0; 1:3 vì khác biệt không có ý nghĩa thống kê), HSTH = 66,57% cũng cao hơn hẳn so với các tỷ lệ khác (trừ tỷ lệ EPro:EFla là 1:0 và 1:1 vì khác biệt không có ý nghĩa thống kê), Naa/NTS = 59,60% là cao nhất và TVB-N= 0,86 g/l cao hơn các tỷ lệ khác. Tỷ lệ EPro:EFla = 1:1 tuy có chỉ tiêu TVB-N cao hơn các tỷ lệ khác, nhưng là tỷ lệ thỏa mãn nhiều nhất các điều kiện đã đặt ra (đạt 3/4 điều kiện), vì vậy được chọn là tỷ lệ 2 enzyme thích hợp để thủy phân protein cá nục gai. 2.2. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giữa hỗn hợp enzyme với cơ chất đến hiệu quả thủy phân III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của cá nục gai Thành phần khôi lượng và thành phần hóa học cơ bản của cá nục gai thể hiện trong bảng 1 và 2. Bảng 1. Thành phần khối lượng của cá nục gai (%) Thịt Đầu Xương Vây Nội tạng 56,36 ± 0,03 18,33 ± 0,02 13,60 ± 0,02 5,69 ± 0,02 6,02 ± 0,01 Bảng 2. Thành phần hóa học cơ bản của cá nục gai Thành phần Tỷ lệ (%) so với khối lượng ướt Nước 71,91 ± 0,01 Protein 18,28 ± 0,06 Tro 3,90 ± 0,02 Lipid 2,78 ± 0,01 Hình 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ E Pro :E Fla đến độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi nitơ (HSTH) Hình 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ E Pro :E Fla đến tỷ lệ N aa /N TS và TVB-N của dịch đạm thủy phân Hình 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ (E Pro + E Fla )/S đến độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi nitơ (HSTH) Hình 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ (E Pro + E Fla )/S đến tỷ lệ N aa /N TS và TVB-N của dịch đạm thủy phân Bảng 1 và 2 cho thấy cá nục gai có tỷ lệ phần ăn được khá cao (56,36%); hàm lượng protein tổng số cao (18,28%) tương đương so với mực (17÷21%), cao hơn hẳn so với một số loài thủy sản khác như sò (8÷9%), moi (13÷16%) và ốc (11÷12%); hàm lượng lipid thấp (2,78%), xếp vào loại cá gầy rất thích hợp cho việc sản xuất dịch đạm thủy phân. 2. Kết quả xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein của cá nục gai bằng hỗn hợp EPro và EFla 2.1. Kết quả xác định tỷ lệ EPro:EFla thích hợp cho quá trình thủy phân Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 141 Hình 4 và 5 cho thấy: giá trị của các chỉ tiêu DH, HSTH, Naa/NTS và TVB-N tăng khi (EPro + EFla)/S tăng từ 0 ÷ 0,3%. Tiếp tục tăng (EPro + EFla)/S lên tới 0,5% thì các chỉ tiêu này không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) và có xu hướng đi đến cân bằng. Các công trình nghiên cứu trước đây cũng đã cho thấy có sự hòa tan nitơ dưới tác dụng của enzyme trong quá trình thủy phân và tỷ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân, cũng như sự cắt đứt các liên kết peptide tăng theo nồng độ enzyme (Wachirattanapongmetee và cộng sự, 2009; Motamedzadegan và cộng sự, 2010). Điều này có thể giải thích: Khi tăng (EPro + EFla)/S từ 0 ÷ 0,3%, quá trình thủy phân protein (cắt mạch polypeptide) xảy ra mãnh liệt do cơ chất thừa, dẫn đến DH tăng, kéo theo HSTH và Naa/NTS tăng. Sau đó, tiếp tục tăng (EPro + EFla)/S thì vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi vì nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất. Tỷ lệ (EPro + EFla)/S = 0,3 (tương ứng với DH = 44,33%; HSTH = 66,58%; Naa/NTS = 59,72% và TVB-N = 0,88 g/l) cho kết quả thỏa mãn nhiều nhất các điều kiện đã đặt ra nên được chọn là thích hợp cho quá trình thủy phân protein cá nục gai. 2.3. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân bằng hỗn hợp (EPro + EFla) Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi nitơ (HSTH) Hình 7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ N aa /N TS và TVB-N của dịch đạm thủy phân Hình 6 và 7 cho thấy, khi nhiệt độ tăng từ 45oC lên 55oC thì 3 chỉ tiêu DH, HSTH và Naa/NTS đều tăng và đạt cực đại tại 55oC; nếu tiếp tục tăng 55oC lên 65oC thì bị giảm. Còn hàm lượng TVB-N thì giảm liên tục khi tăng nhiệt độ tăng 45oC đến 65oC. Điều này có thể giải thích như sau: khi tăng nhiệt độ từ 45oC lên 55oC thì hoạt động của hỗn hợp (EPro + EFla) tăng do năng lượng hoạt hóa cho phản ứng được tăng cường, sau đó tiếp tục tăng nhiệt độ lên đến 65oC thì hoạt tính của hỗn hợp (EPro + EFla) giảm do nhiệt độ cao gây ức chế hoạt động của hỗn hợp (EPro + EFla). Khi tăng nhiệt độ từ 45 ÷ 65oC thì hoạt động của vi sinh vật giảm do hệ VSV trong cá nục gai có topt ≤ 45 oC nên khi tăng nhiệt độ từ 45 ÷ 65oC chúng bị ức chế hoạt động, dẫn đến TVB-N sinh ra giảm dần theo nhiệt độ thủy phân. Nhiệt độ 55oC (tương ứng DH, HSTH, Naa/NTS và TVB-N theo thứ tự là 48,45%; 70,49%; 62,65% và 0,72 g/l) cho kết quả thỏa mãn nhiều nhất các điều kiện đã đặt ra nên được chọn là nhiệt độ thích hợp để thủy phân protein cá nục gai. 2.4. Kết quả ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân bằng hỗn hợp (EPro + EFla) Hình 8. Ảnh hưởng của thời gian đến độ thủy phân (DH) và hiệu suất thu hồi nitơ (HSTH) Hình 9. Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ N aa /N TS và TVB-N của dịch đạm thủy phân Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 142 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hình 8 và 9 cho thấy, khi thời gian thủy phân tăng từ 3 đến 7 giờ, tất cả các chỉ tiêu DH, HSTH, Naa/NTS, TVB-N đều tăng. Tuy nhiên sau 6 giờ thì mức tăng không đáng kể (p < 0,05). Các công trình nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng DH tăng theo thời gian thủy phân (Souissi và cộng sự, 2007; Chun và cộng sự, 2006; Amiza và cộng sự, 2012; Wachirattanapongmetee và cộng sự, 2009; Ovissipour và cộng sự, 2010; Shamloo và cộng sự, 2012). Điều này được giải thích như sau: Thời gian thủy phân phải đảm bảo để enzyme có thể phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo được sản phẩm cuối cùng mong muốn theo mục tiêu của đề tài. Thời gian tác động kéo dài thì enzyme có điều kiện thủy phân protein cá nục gai triệt để. Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật gây thối hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Thời gian thủy phân 6 giờ cho kết quả thỏa mãn nhiều nhất các điều kiện đã đặt ra nên được chọn là thời gian thích hợp để thủy phân protein cá nục gai bằng hỗn hợp (EPro + EFla), tương ứng với DH = 60,26%; HSTH = 79,99%; Naa/NTS = 77,47% và TVB-N = 0,96 g/l. 2.5. Đề xuất chế độ thủy phân thích hợp Kết quả thí nghiệm từ 3.2.1 đến 3.2.4, cho phép đề xuất: dùng hỗn hợp Protamex và Flavourzyme tỷ lệ 1:1; tỷ lệ hỗn hợp enzyme - cơ chất = 0,3; nhiệt độ 55oC; thời gian 6 giờ để thủy phân protein của cá nục gai là chế độ thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu a xít amin từ protein của cá nục gai theo quy trình thể hiện trên 2.1. 3. Xác định hiệu quả của chế độ thủy phân tìm được Áp dụng thử nghiệm chế độ thủy phân thích hợp theo đề xuất ở mục 3.2.5, kết quả như sau: dịch đạm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu a xít amin không thay thế, như trong bảng 3. Bảng 3. Thành phần a xít amin của dịch đạm thủy phân thu được từ protein cá nục gai Tên a xít amin Hàm lượng (g/l) Tên a xít amin Hàm lượng (g/l) Aspartic 1,22 Tyrosine 0,54 Serine 0,81 Valine* 0,66 Glutamine 0,36 Methionine* 0,40 Glycine 0,25 Lysine* 1,36 Histidine* 0,80 Isoleucine* 0,37 Arginine 1,31 Leucine* 0,91 Threonine* 0,61 Phenylalanine* 0,55 Alanine 0,53 TAA 10,93 Proline 0,08 TEAA 5,66 Cysteine 0,17 TEAA/TAA 51,78 (*): A xít amin không thay thế, TAA (Total amino acids): Tổng a xít amin, TEAA (Total essential amino acids): Tổng a xít amin không thay thế. Về cảm quan, dịch đạm có màu vàng nhạt, nhẹ hơn hẳn so với nước mắm sản xuất theo phương pháp truyền thống; mùi dễ chịu, hàm lượng TVB-N/NTS 5,79%, histamine 0,62 mg/100g đặc biệt thấp. Đối chiếu với TCVN 5107:2003 của sản phẩm nước mắm đặc biệt (NNH3/NTS < 20%) và histamine theo Codex alimentairius (≤ 40 mg/100g) thì dịch đạm thu được hoàn toàn có thể đưa vào sử dụng trong lĩnh vực thực phẩm. IV. KẾT LUẬN Chế độ thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu a xít amin từ protein của cá nục gai bằng hỗn hợp Protamex và Flavourzyme là: tỷ lệ Protamex - Flavourzyme 1:1, tỷ lệ hỗn hợp enzyme - cơ chất 0,3%, nhiệt độ 55oC, thời gian 6 giờ. Sản phẩm thu được có thể ứng dụng tốt vào lĩnh vực thực phẩm để sản xuất nhiều dòng nước chấm và bổ sung dinh dưỡng cho nhiều loại thực phẩm khác. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 143 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amiza, M.A., Kong, Y.L., Faazaz, A.L., 2012. Effects of degree of hydrolysis on physicochemical properties of Cobia (Rachycentron canadum) frame hydrolysate. International Food Research Journal, 19(1): 199-206. 2. Kamnerdpetch, C., Weiss, M., Kasper, C., Scheper, T., 2007. An improvement of potato pulp protein hydrolyzation process by the combination of protease enzyme systems. Enzyme and Microbial Technology, 40: 508-514. 3. Liaset, B., Nortvedt, R., Lied, E., Espe, M., 2002. Studies on the nitrogen recovery in enzymatic hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar, L.) frames by ProtamexTM protease. Process Biochemistry, 37: 1263-1269. 4. Motamedzadegan, A., Davarniam, B., Asadi, G., Abedian, A., 2010. Optimization of enzymatic hydrolysis of yellowfi n tuna Thunnus albacares viscera using Neutrase. Int Aquat Res, 2: 173-181. 5. Ovissipour, M., Benjakul, S., Safari, R., Motamedzadegan, A., 2010. Fish protein hydrolysates production from yellowfi n tuna Thunnus albacares head using Alcalase and Protamex. Int Aquat Res, 2: 87-95. 6. Shamloo, M., Bakar, J., Mat Hashim, D. and Khatib, A., 2012. Biochemical properties of red tilapia (Oreochromis niloticus) protein Hydrolysates. International Food Research Journal, 19(1): 183-188. 7. Santhivel, S., Smiley, S., Prinyawiwatkul, W., Bechtel, P.J., 2005. Functional and Nutritional Properties of Red Salmon (Oncorhynchus nerka) Enzymatic Hydrolysates. Journal of Food Science, 70(6): 401-406. 8. Souissi, N., Bougatef, A., Triki-Ellouz, Y., Nasri, M., 2007. Biochemical and Functional Properties of Sardinella (Sardinella aurita) By-Product Hydrolysates. Food Technol. Biotechnol. 45 (2): 187–194. 9. Wachirattanapongmetee, K., Wachirattanapongmetee, K., Thawornchinsombut, S., Pitirit, T., Yongsawatdigul, J., Park, J.W., 2009. Functional Properties of Protein Hydrolysates Prepared from Alkali-Aided Protein Extraction of Hybrid Catfi sh Frame. Trends Research in Science and Technology, (1): 71-81.