Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của kháng nguyên bám dính K88 tái tổ hợp phân lập từ escherichia coli mang độc tố đường ruột của lợn con cai sữa - Nguyễn Hoàng Lộc

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125 120 NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN BÁM DÍNH K88 TÁI TỔ HỢP PHÂN LẬP TỪ Escherichia coli MANG ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT CỦA LỢN CON CAI SỮA Nguyễn Hoàng Lộc1*, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh3, Hoàng Tấn Quảng2, Trần Thúy Lan2, Lê Mỹ Tiểu Ngọc2, Đinh Thị Bích Lân2, Phùng Thăng Long4 1Trường đại học Khoa học, Đại học Huế, *nhloc@hueuni.edu.vn 2Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế 3Sở Khoa học và Công nghệ Thừa Thiên - Huế 4Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế TÓM TẮT: Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC), từ đó mà vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ. K88 (F4) là kháng nguyên bám dính đầu tiên được phát hiện trong các chủng ETEC phân lập từ lợn và là kháng nguyên bám dính phổ biến nhất ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy trên lợn con sau cai sữa. Chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen faeG mã hóa kháng nguyên bám dính K88-1NT trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3). Kết quả tối ưu hóa các điều kiện sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp K88-1NT cho thấy chúng được sản xuất mạnh nhất sau 6 giờ cảm ứng bằng lactose 0,1%, mật độ tế bào (OD600) đạt 0,5 ở 35oC. Môi trường cảm ứng bao gồm Na2HPO4.12H2O 1%, KH2PO4 0,3%, NaCl 0,05%, (NH4)2SO4 1%, MgSO4.7H2O 0,2%, glucose 1,5%, tryptone 1%, và dịch chiết nấm men 1%. Sản phẩm K88-1NT tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni2+ có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. Từ khóa: Escherichia coli, độc tố đường ruột, kháng nguyên bám dính, lợn con cai sữa. MỞ ĐẦU Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh đường ruột, nhờ các yếu tố bám dính có trên bề mặt như K88, K99, 987P, F17, F18 và F41, vi khuẩn E. coli mới có khả năng bám và xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ để gây bệnh [13]. Hầu hết các bộ phận bám dính đều được tìm thấy trên các vi khuẩn đường ruột và được gọi là fimbriae. Fimbriae là những cấu trúc liên kết có tính đa phân tử, khả năng miễn dịch cao và có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu [14]. Sau khi phát hiện ra kháng nguyên K88 (F4) lần đầu tiên vào năm 1976, đã có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm và vai trò của yếu tố này trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh [12]. Thiry et al. (1989) [16] đã tạo dòng các trình tự DNA mã hóa kháng nguyên F4 và phân tích sự biểu hiện của pili này trong các plasmid pBR322, pACYC184. Nghiên cứu của Van den Broeck et al. (2000) [17] cho thấy, F4 fimbriae được mã hóa bởi một nhóm 10 gen có chức năng riêng biệt, được ký hiệu tương ứng từ faeA-faeJ; trong đó, faeG là tiểu đơn vị chính. Verdonck (2004) [18] đã phân lập gen mã hóa faeG, tạo dòng trong vector pET30Ek-LIC và biểu hiện với đuôi tận cùng His- và S-tag trong tế bào chất của E. coli BL21(DE3). FaeG tái tổ hợp có hoạt tính sinh học giúp lợn con chống lại sự xâm nhiễm của ETEC. Chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện thành công các kháng nguyên bám dính F4 (K88- 1NT) tái tổ hợp trong tế bào E. coli BL21 (DE3) [8]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả tối ưu biểu hiện của kháng nguyên này ở quy mô phòng thí nghiệm. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu sử dụng là chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang gen faeG-1NT [8]. Nuôi cấy vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn E. coli tái tổ hợp trong bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường dinh dưỡng (pH 7) ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút và tỷ lệ cấy giống là 0,1%. Cảm ứng biểu hiện kháng nguyên K88-1NT được thăm dò khi quá trình nuôi cấy đạt OD600 = 0,5- 4,0, nhiệt độ cảm ứng từ 20-37oC với IPTG 0,5 Nguyen Hoang Loc et al. 121 mM. Thăm dò sử dụng lactose thay thế IPTG làm chất cảm ứng với các nồng độ từ 0,1-2%. Các môi trường được sử dụng để sản xuất kháng nguyên K88-1NT là LB [8], TB [15], YJ [9], cải tiến M9ZB [5] và HSG [11]. Điện di SDS-PAGE Thu hồi sinh khối tế bào E. coli tái tổ hợp sau khi cảm ứng bằng ly tâm, phá vỡ tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt và tách chiết protein hòa tan tổng số theo Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit (Invitrogen, Hoa Kỳ). Biểu hiện của kháng nguyên bám dính được kiểm tra bằng điện di polyacrylamide gel 12% có SDS ở 60 V. Sau đó, gel được nhuộm với Coomassie Blue R250 và hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Quality One (ver 4.1, Bio- Rad). Tinh sạch kháng nguyên K88-1NT Sử dụng kit ProBondTM Purification System (Invitrogen, USA) theo nguyên lý sắc ký ái lực giữa đuôi 6×His trên protein dung hợp và phối tử Ni2+ trên cột sắc ký. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nuôi cấy vi khuẩn 0 1 2 3 4 5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Hình 1. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên K88-1NT Đường cong sinh trưởng của tế bào được trình bày ở hình 1 với pha lag kéo dài khoảng 2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài từ 2-10 giờ, pha cân bằng duy trì từ 10-18 giờ và cuối cùng là pha chết. Mật độ tế bào tăng liên tục từ 2-10 giờ và đạt giá trị OD600 cao nhất là 4,45. Các thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của K88-1NT được thiết kế dựa trên đường cong sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng (20-37oC) lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT. M: thang chuẩn khối lượng phân tử protein, NC1: E. coli không mang gen faeG-1NT, NC2: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng sinh trưởng ở 37oC. Nhiệt độ nuôi cấy là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và biểu hiện protein tái tổ hợp của vi sinh vật. Hầu hết các công trình nghiên cứu đều rút ra kết luận về nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của E. coli là 37oC [2, 3, 11]. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật chưa hẳn là nhiệt độ tốt cho sinh tổng hợp enzyme. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhiệt độ thích hợp nhất để sản xuất K88-1NT dao động từ 30-37oC, trong đó, sự biểu hiện ở 35oC là ổn định nhất qua nhiều lần lặp lại thí nghiệm (hình 2), vì vậy chúng tôi sử dụng mức nhiệt độ này cho các nghiên cứu tiếp theo. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt lên quá trình biểu hiện của Thời gian (giờ) M ật đ ộ tế b ào (O D 60 0) M NC1 NC2 20oC 25oC 30oC 35oC 37oC K88-1NT 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125 122 các protein tái tổ hợp khác nhau, cụ thể, nhiệt độ tối ưu cho sản xuất protein dung hợp hBD4 (human beta-defensin-4) trong tế bào E. coli là 34oC [19], trong khi đối với enzyme GDP-L- fucose synthase của E. coli K12 và protein YLR301W của Saccharomyces cerevisiae nhiệt độ tối ưu lại là 25oC [1, 2], thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi. Hình 3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào (OD600 = 0,5-4) trước khi cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT. NC: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng sinh trưởng ở 35oC Ảnh hưởng của mật độ tế bào Nhiều tác giả đã chứng minh giai đoạn sinh trưởng của tế bào mà tại đó protein được cảm ứng biểu hiện có ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp và khả năng hoạt động của protein, vì vậy, cần thiết phải tối ưu mật độ tế bào trước khi bổ sung chất cảm ứng để biểu hiện mạnh protein tái tổ hợp [2]. Ảnh hưởng của mật độ tế bào được khảo sát tại các giai đoạn sinh trưởng khác nhau (OD600 từ 0,5-4), chạy điện di SDS sau 6 giờ cảm ứng bằng IPTG 0,5 mM. Kết quả trình bày ở hình 3 cho thấy, mật độ tế bào ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp K88-1NT. Kháng nguyên K88-1NT chỉ được bắt đầu tổng hợp khi mật độ tế bào đạt OD600 từ 0,5-1, cao nhất khi OD600=0,5, sau đó, gần như không được tổng hợp nữa. Theo Liu et al. (2009) [6], mật độ tế bào đạt OD600 bằng 0,5 là thời điểm thích hợp nhất để bổ sung IPTG, cảm ứng sự biểu hiện aminopeptidase N của lợn trong E. coli BL21 (DE3), kết quả này cũng tương tự với kết quả của chúng tôi. Đối với biểu hiện các loại protein tái tổ hợp khác nhau trên E. coli BL21 (DE3) thì thời điểm thích hợp để cảm ứng là khác nhau. Xu et al. (2006) [19] khi nghiên cứu biểu hiện của beta- defensin-4 của người nhận thấy protein tái tổ hợp được sản xuất mạnh khi cảm ứng ở OD600 = 15. Thời điểm thích hợp nhất cho cảm ứng biểu hiện endoglucanase chịu nhiệt từ Clostridium thermocellum là OD600 từ 0,8-1 [4], của cystein protease từ Porphyromonas gingivalis là OD600=0,6 [10]. Ảnh hưởng của lactose Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ lactose (0,1-2%) lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT. PC: E. coli tái tổ hợp cảm ứng bằng IPTG 0,5 mM ở 35oC; NC: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng sinh trưởng ở 35oC. M NC 0,5 0,8 1 1,5 2 2,5 3 4 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa K88-1NT 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa K88-1NT M PC NC 0,1% 0,5% 1% 1,5% 2% Nguyen Hoang Loc et al. 123 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside thường được sử dụng để cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli, tuy nhiên, chúng cần phải được loại bỏ trong sản phẩm thu được vì có nhiều độc tính. Hơn nữa, đây là hợp chất có giá đắt hơn hàng trăm lần so với lactose (tính theo liều lượng cho hiệu quả cảm ứng tương đương). Vì vậy, sử dụng lactose để thay thế IPTG đã được nhiều tác giả nghiên cứu và thu được kết quả khả quan [5, 7, 20]. Sử dụng lactose để cảm ứng cũng có khi cho hiệu quả cao hơn IPTG [5]. Kết quả trình bày ở hình 4 cho thấy, các nồng độ khác nhau của lactose không ảnh hưởng nhiều đến lượng K88-1NT thu được, so với IPTG, lượng K88-1NT thu được cũng tương đương. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ lactose thấp nhất (0,1%) để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Nồng độ lactose thích hợp cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli BL21 cũng tùy thuộc vào từng loại protein cần tổng hợp, chẳng hạn sản xuất alkaline lipase từ Proteus vulgaris K80 là 1,88% [5], rLTB và rLTKA63 từ Helicobacter pylori là 0,08% [20] hay protease NPRC10 từ E. coli BL21 là 0,5% [7]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi có hiệu quả rất lớn, hàm lượng lactose sử dụng thấp trong khi lượng protein tái tổ hợp thu được không thua kém khi cảm ứng bằng IPTG. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Các loại môi trường tổng hợp thường được sử dụng trong nuôi cấy sản xuất protein tái tổ hợp. Trong đó, môi trường có bổ sung dịch chiết nấm men thích hợp cho nuôi cấy tế bào mật độ cao, vì nó chứa một số khoáng chất, vitamin và amino acid. Cung cấp đầy đủ dịch chiết nấm men sẽ ngăn cản được sự phân cắt các protein tái tổ hợp [3]. Vì thế, chúng tôi đã thăm dò một số môi trường cơ bản để sản xuất protein K88-1NT, kết quả được trình bày trong hình 5. Trong các môi trường được nghiên cứu, môi trường YJ hoặc M9ZB cải tiến thích hợp nhất cho sản xuất protein K88-1NT, trong đó môi trường M9ZB cải tiến có hiệu quả kinh tế hơn. Môi trường LB không tốt cho sản xuất K88-1NT, thể hiện trên hình ảnh điện di (hình 5). Hình 5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT NC1: E. coli không mang gen faeG-1NT, NC: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng sinh trưởng trong môi trường LB ở 35oC 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa K88-1NT M NC1 NC2 LB TB YJ M9ZB HSG Hình 6. Protein kháng nguyên K88-1NT sau khi tinh sạch bằng sắc ký ái lực 1. đệm rửa giải có pH 6,0; 2. đệm rửa giải có pH 5,3. 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa M 1 2 K88-1NT TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125 124 Tinh sạch kháng nguyên K88-1NT Kết quả tinh sạch kháng nguyên K88-1NT bằng ProBondTM Purification System kit (Invitrogen, USA) cho thấy xuất hiện 1 băng đậm ở vị trí khoảng 31 kDa, đúng bằng kích thước của protein dung hợp K88-1NT (hình 6). Vì vậy, có thể khẳng định gen faeG-1NT đã được biểu hiện thành công và đặc hiệu. Vì vậy, có thể sử dụng kháng nguyên K88-1NT trong nghiên cứu sản xuất kháng thể kháng K88 làm nguyên liệu cho sản xuất kit chẩn đoán bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra sau này. KẾT LUẬN Kết quả tối ưu hóa các điều kiện sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp K88-1NT cho thấy, chúng được sản xuất mạnh nhất sau 6 giờ cảm ứng bằng 0,1% lactose, mật độ tế bào (OD600) đạt 0,5 ở 35oC trên môi trường M9ZB cải tiến. Sản phẩm K88-1NT tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni2+ có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahn W. S., Ahn J. Y., Jung C. H., Wang K. Y., Kim E. E., Kim J., Im H., Kim J. O., Yu M. H., Lee C., 2007. Optimization of expression conditions for soluble protein by using a robotic system of multi-culture vessels. J. Microbiol. Biotechnol., 17: 1868- 1874. 2. Byun S. G., Kim M. D., Lee W. H., Lee K. J., Han N. S., Seo J. H., 2007. Production of GDP-L-fucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis, in recombinant Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 74: 768-775. 3. Goyal D., Sahni G., Sahoo D. K., 2009. Enhanced production of recombinant streptokinase in Escherichia coli using fed- batch culture. Biores. Technol., 100: 4468- 4474. 4. Juhasz T., Szekely E., Simandi B., Szengyel Z. S., Reczey K., 2003. Recovery of a recombinant thermostable endoglucanase from E. coli using supercritical carbon dioxide cell disruption. Chem. Biochem. Eng. Q., 17(2): 131-134. 5. Lee H. W., Yoon S. J., Kim H. K., Park K. M., Oh T. K., Jung J. K., 2000. Overexpression of an alkaline lipase gene from Proteus vulgaris K80 in Escherichia coli BL21/pKLE. Biotechnol. Lett., 22: 1543-1547. 6. Liu B., Li G., Sui X., Yin J., Wang H., X. R., 2009. Expression and functional analysis of porcine aminopeptidase N produced in prokaryotic expression system. J. Biotechnol., 10: 95-101. 7. Loc N. H., Giap D. V., Quang H. T., 2011. Production of NPRC10 protease by recombinant Escherichia coli through submerged culture in 40-L fermenter. Ann. Biol. Res., 2(6): 62-68. 8. Loc N. H., Ngoc L. M. T., Lan T. T., Viet L. Q., Thao L. D., Quang H. T., Lan D. T. B., Long P. T., 2013. Cloning and expression of genes encoding F107-C and K88-1NT fimbrial proteins of enterotoxigenic Escherichia coli from piglets. Indian J. Microbiol., 53(4): 488-491. 9. Loc N. H., Quang H. T., Lam B. T. H., Trang D. T. T., 2011. The effects of culture conditions on neutral protease (NPRC10) in a recombinant Escherichia coli BL21 (DE3). Ann. Biol. Res., 2(3): 474-485. 10. Margetts M. B., Barr I. G., Webb E. A., 2000. Overexpression, purification, and refolding of a Porphyromonas gingivalis cysteine protease from Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 18: 262-268. 11. Miksch G., Ryu S., Risse J. M., 2008. Factors that influence the extracellular expression of streptavidin in Escherichia coli using a bacteriocinrelease protein. Appl. Gene Mol. Biotechnol., 10: 124-129. 12. Mooi F. R., Claassen I., Baker D., Kuipers H., De Graaf F. K., 1986. Regulation and structure of an Esciherichia coli gene coding for an outer membrane protein involved in export of K88ab fimbrial subunits. Nucleic Acids Res., 14: 2443- 2457. 13. Mulvey M. A., 2002. Adhesion and entry of Nguyen Hoang Loc et al. 125 uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology, 4(5): 257-271. 14. Sellwood R., Gibbons R. A., Jones G. W., Rutter J. M., 1975. Adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to pig intestinal brush borders: the existence of two pig phenotypes. J. Med. Microbiol., 8: 405-411. 15. Shen Y., Lao X. G., Chen Y., Zhang H. Z., Xu X. X., 2007. High-level expression of cecropin X in Escherichia coli. Int. J. Mol. Sci., 8: 478-491. 16. Thiry G., Andre C., Thierry S., Jean P., 1989. Cloning of DNA sequences encoding foreign peptides and their expression in the K88 pili. Appl. Environ. Microbiol., 55: 984-993. 17. Van den Broeck W., Cox E., Oudega B., Goddeeris B. M. L., 2000. The F4 fimbrial antigen of Escherichia coli and its receptors. Vet. Microbiol., 71(3-4): 223-244. 18. Verdonck F., 2004. Oral immunization ofpiglets with recombinant F4 fimbrial adhesin FaeG monomers induces a mucosal and systemic F4-specific immune response. Vaccine: 4291-4299. 19. Xu Z., Zhong Z., Huang L., Peng L., Wang F., Cen P., 2006. High-level production of bioactive human beta-defensin-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression. Appl. Microbiol. Biotechnol., 72: 471-479. 20. Yan J., Zhao S. F., Mao Y. F., Luo Y. H., 2004. Effects of lactose as an inducer on expression of Helicobacter pylori rUreB and rHpaA, and Escherichia coli rLTKA63 and rLTB. World J. Gastroenterol., 10(12): 1755-1758. ENHANCING EXPRESSION OF RECOMBINANT FIMBRIAL ADHESIN K88 ISOLATED OF ENTEROTOXIGENIC Escherichia coli FROM PIGLET Nguyen Hoang Loc1, Nguyen Thi Khanh Quynh3, Hoang Tan Quang2, Tran Thuy Lan2, Le My Tieu Ngoc2, Dinh Thi Bich Lan2, Phung Thang Long4 1College of Sciences, Hue University 2Institute of Biotechnology, Hue University 3Thua Thien - Hue Department of Science and Technology 4College of Agriculture and Forestry, Hue University SUMMARY Fimbrial adhesins are important toxic factors of enterotoxigenic E. coli (ETEC) strains, whereby they have the ability to adhere to small intestine of the host. K88 (F4) is the first fimbrial adhesin was detected in ETEC strains from piglet, and it is the most popular fimbrial adhesin of E. coli strains causes diarrhea in weaned piglets. In previous report, we successful expressed the faeG gene encoding fimbrial adhesin K88- 1NT in recombinant E. coli BL21 (DE3). Highest level of K88-1NT was determined after induction by 0.1% lactose for 6 h at 35oC when cell density (OD600) reached a value of 0.5. Induction medium including Na2HPO4.12H2O 1%, KH2PO4 0.3%, NaCl 0.05%, (NH4)2SO4 1%, MgSO4.7H2O 0.2%, glucose 1.5%, tryptone 1% and yeast extract 1%. Purified K88-1NT protein from Ni2+ affinity chromatography had a molecular weight of 31 kDa. Keywords: Escherichia coli, enterotoxin, fimbrial adhesin, weaned piglet. Ngày nhận bài: 15-7-2013