Nghiên cứu áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9 NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHẢN ỨNG FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA FENTON REACTION APPLIED FOR DETERMINING ANTIOXIDATIVE ACTIVITY Huỳnh Nguyễn Duy Bảo1, Ngô Thị Hoài Dương2, Phạm Thị Hiền3 Ngày nhận bài: 08/5/2013; Ngày phản biện thông qua: 04/12/2013; Ngày duyệt đăng: 13/8/2014 TÓM TẮT Nghiên cứu này đã xây dựng phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton. Hệ phản gồm 50 µM eicosapentaenoic (EPA), 50 µM metmyoglobin (metMb) và 100 µM H 2 O 2 . Thời gian phản ứng để tạo ra gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) nhiều nhất từ metMb và H 2 O 2 là 180 giây. Thời gian thích hợp để oxy hóa EPA kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylMb ở 300C là 30 phút. Hoạt tính chống oxy hóa của ESH phân tích bằng hệ phản ứng Fenton có mối tương quan rất cao với kết phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH (R2 = 0,99), tổng năng lực khử (R2 = 0,98) và khả năng khử H 2 O 2 (R2 = 0,99). Từ khóa: phản ứng Fenton, chống oxy hóa, gốc tự do, myoglobin, lipid ABSTRACT This study was to develop new method for determining antioxidant activity based on Fenton reaction. The reaction system included 50 µM eicosapentaenoic (EPA), 50 µM metmyoglobin (metMb) and 100 µM H 2 O 2 . The maximum ferrylmyoglobin (ferrylMb) radical level was generated from the reaction between metMb and H 2 O 2 after 180 sec. The incubation time for oxidation of EPA initiated by ferrylMb radical at 370C was 30 min. Antioxidant activity of ESH determined by the Fenton reaction system was in correlation with those of DPPH radical scavenging activity (R2 = 0,99), total reducing power (R2 = 0,98) and H 2 O 2 scavenging activity (R2 = 0,99). Keywords: Fenton reaction, antioxidation, free radical, myoglobin, lipid 1 TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, 2 TS. Ngô Thị Hoài Dương, 3 ThS. Phạm Thị Hiền: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo xu thế phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm trên thế giới hiện nay, người tiêu dùng ngày càng ưa chuộng các loại thực phẩm chức năng, thực phẩm thuốc (thực phẩm có tác dụng chữa bệnh) và thực phẩm bổ sung các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Một trong những hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học đó là hoạt tính chống oxy hóa. Các phản ứng oxy hóa thường xảy ra rất nhanh khi bị kích hoạt bởi các gốc tự, khi quá trình oxy hóa diễn ra lại tạo thành các gốc tự do khác, các gốc tự do này tiếp tục tham gia vào quá trình oxy hóa làm cho phản ứng diễn ra mãnh liệt. Các chất chống oxy hóa là những chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa bằng cách khử đi các gốc tự do. Vì vậy, các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa thường dựa vào khả năng khử gốc tự do. Các phản ứng oxy hóa bằng H2O2 với xúc tác bởi ion Fe2+ hoặc Fe3+ tạo thành các gốc tự do hydroxyl (HO•) và ferryl (FeO2+) được gọi là phản ứng Fenton vì đã được H. J. H. Fenton khám phá ra vào năm 1894 khi oxy hóa acid tartaric bởi H2O2 với sự có mặt của ion Fe2+ [1]. Các phản ứng diễn ra như sau: Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + HO- + HO• Fe3+ + H2O2 → FeO 2+ + H2O + H + Phản ứng Fenton tạo ra gốc tự do hydroxyl và ferryl nên đã được áp dụng để phân tích hoạt tính Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG chống oxy hóa. Re và cs [12] đã phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do ABTS•+ (2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic acid)) tạo ra nhờ kích hoạt bởi phản ứng Fenton. Caillet và cs [2] đã áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên dựa vào khả năng khử gốc tự do hydroxyl được tạo ra bằng cách oxy hóa acid ethylenediamine tetraacetic bởi Fe2+ và H2O2. Mặc dù đã có những nghiên cứu đã áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa, nhưng các phương pháp này chỉ đánh giá hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp dựa vào khả năng khử gốc tự do nên kết quả chưa phản ánh đúng bản chất và năng lực của chất chống oxy hóa. Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp trên, nghiên cứu này đã xây dựng phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ eicosapentaenoic (EPA)/metmyoglobin (metMb)/ H2O2 nhằm đánh giá trực tiếp tác dụng chống oxy hóa lipid khi bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylMb tạo ra từ phản ứng giữa Mb và H2O2. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Hóa chất Gốc tự do 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), ergothioneine (ESH), acid eicosapentaenoic (EPA), metmyoglobin (metMb) được mua từ Công ty Sigma - Aldrich, Hoa Kỳ. Tween 20 được mua từ Công ty Loba Chemie, Ấn Độ. Acid thiobarbituric (TBA) được mua từ Công ty Wako, Nhật Bản. Các hóa chất còn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hóa học, được mua từ Công ty Hóa chất Guanghua, Trung Quốc. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Thiết lập hệ phản ứng Trong hệ EPA/metMb/H2O2, phản ứng oxy hóa EPA bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metMb và H2O2. EPA bị oxy hóa tạo thành malondialdehyde (MDA) phản ứng với TBA tạo thành phức màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535 nm. Cơ chế phản ứng xảy ra như sau: Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa EPA nên cường độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa. 2.2. Cách tiến hành thí nghiệm 2.2.1. Thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho phản ứng tạo gốc tự do ferrylMb từ metMb và H2O2 Theo nghiên cứu của Menna và cs [7], phản ứng giữa metMb và H2O2 tạo ferrylMb đạt hiệu suất cao nhất và ổn định nhất khi tỷ lệ metMb/H2O2 là 1/2 (50 µM metMb/100 µM H2O2) trong hệ đệm phosphate 50 mM, pH = 7,4. Nghiên cứu của Egawa và cs [3] cũng đã chứng minh rằng gốc tự do ferrylMb tạo thành theo thời gian phản ứng giữa metMb và H2O2 làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 421 nm và độ hấp thụ của metMb ở bước sóng 409 nm giảm đi (hình 1). Lượng ferrylMb tạo thành trong hỗn hợp phản ứng càng nhiều thì độ hấp thụ ở bước sóng 421 nm càng tăng. Hình 1. Sự biến đổi độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 409 nm và 421 nm (Egawa và cs, 2000) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 11 Do vậy, trong thí nghiệm này đã xác định gốc tự do ferrylMb tạo thành theo thời gian phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H2O2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) dựa vào độ hấp thụ ở bước sóng 421 nm. Thời gian thích hợp cho phản ứng được chọn khi độ hấp thụ ở bước sóng 421 nm đạt cực đại. Gốc tự do ferrylMb tạo thành từ phản ứng giữa metMb và H2O2 được kiểm chứng bằng phổ cộng hưởng điện tử thuận từ (Electron paramagnetic resonance) theo phương pháp của Viriyarattanasak và cs [16]. 2.2.2. Thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho phản ứng oxy hóa lipid kích hoạt bởi gốc tự do ferrylMb Theo nghiên cứu của Min và cs [8], nhiệt độ thích hợp để gốc tự do ferrylMb kích hoạt phản ứng oxy hóa lipid là 370C. Nghiên cứu này đã chọn EPA làm cơ chất cho phản ứng vì EPA là acid béo không no cao phân tử rất dễ bị oxy hóa. Sử dụng chất nhũ hóa Tween 20 để hòa tan EPA. Mức độ oxy hóa lipid trong hệ phản ứng được xác định thông qua chỉ số TBARS. Trên cơ sở đó, thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho phản ứng oxy hóa lipid kích hoạt bởi gốc tự do ferrylMb được tiến hành như sau: Cho 0,1 ml dung dịch metMb 50 µM và 0,1 ml dung dịch H2O2 100µM trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy kín thể tích 20 ml rồi để cho phản ứng xảy ra trong 180 giây ở nhiệt độ thường. Sau đó, bổ sung vào ống nghiệm 0,2 ml Tween 20 có chứa 50 µM EPA và 1 ml nước cất. Trộn đều hỗn hợp trên máy votex rồi đem ủ ở 370C để phản ứng oxy hóa lipid xảy ra. Sau mỗi 15 phút lấy mẫu xác định chỉ số peroxide theo phương pháp của Sohn và cs [13] và chỉ số TBARS theo phương pháp của Uchiyama và Mihara [15] để đánh giá mức độ oxy hóa lipid theo thời gian. 2.2.3. Thí nghiệm kiểm chứng tính phù hợp của mô hình phản ứng Fenton đã được thiết lập cho việc phân tích hoạt tính chống oxy hóa Tính phù hợp của mô hình phản ứng Fenton được kiểm chứng dựa vào mối tương quan giữa kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton với các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến gồm: khả năng khử gốc tự do DPPH của Fu và cs [4], tổng năng lực khử của Oyaizu [11] và khả năng khử H2O2 của Nabavi và cs [9]. Chất chống oxy hóa chuẩn ESH được chọn để thí nghiệm kiểm chứng mô hình. 3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trình bày trong bài báo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Tính giá trị trung bình và vẽ đồ thị sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003. Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích trên phần mềm thống kê R phiên bản 2.13.1. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Xác định thời gian thích hợp cho phản ứng tạo gốc tự do ferrylMb từ metMb và H2O2 Gốc tự do ferrylMb tạo thành theo thời gian phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H2O2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) được trình bày trên đồ thị hình 2. Hình 2. Gốc tự do ferrylMb tạo thành theo thời gian phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H 2 O 2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) Kết quả trên đồ thị hình 2 cho thấy tốc độ phản ứng giữa metMb và H2O2 xảy ra rất nhanh, lượng ferrylMb tạo thành trong hỗn hợp phản ứng tăng lên đáng kể trong 60 giây đầu của quá trình phản ứng và đạt cực đại sau 130 giây phản ứng. Lượng ferrylMb tạo thành duy trì ở giá trị cực đại trong 70 giây phản ứng tiếp theo và sau đó giảm dần. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Svistunenko [14] khi chứng minh rằng ferrylMb tạo thành trong hỗn hợp phản ứng giữa metMb và H2O2 chỉ sau 65 giây. Lượng ferrylMb tạo thành trong hỗn hợp giảm dần sau 200 giây phản ứng là do gốc tự do ferrylMb kém bền nên chỉ tồn tại được trong một thời gian ngắn và xảy ra quá trình tự khử tạo thành metMb [17]. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy thời gian cần thiết để thu được lượng ferrylMb cực đại từ phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H2O2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) là từ 130 giây đến 200 giây. Vì vậy, thời gian phản ứng thích hợp Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 12 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG được chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là 180 giây (3 phút). 2. Kiểm chứng gốc tự do ferrylMb tạo thành từ phản ứng giữa metMb và H2O2 Phổ cộng hưởng điện tử thuận từ của metMb và gốc tự do ferrylMb được tạo thành sau 180 giây phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H2O2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) được thể hiện trên hình 3. Hình 3. Phổ cộng hưởng điện tử thuận từ của metMb (A) và gốc tự do ferrylMb (B) được tạo thành sau 180 giây phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H 2 O 2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4) Kết quả ở hình 3 cho thấy khi phản ứng với H2O2, tín hiệu của metMb bị giảm đi và tín hiệu gốc tự do ferrylMb hình thành xuất hiện trong vùng đánh dấu Mn2+. Kết quả này đã khẳng định sự tạo thành gốc tự do ferrylMb trong hỗn hợp sau 180 giây phản ứng giữa 50 µM metMb và 100 µM H2O2 trong hệ đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4). 3. Xác định thời gian thích hợp cho phản oxy hóa lipid kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylMb Sự biến đổi hàm lượng lipid hydroperoxide và TBARS trong hỗn hợp phản ứng oxy hóa EPA bị kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylMb ở 370C được thể hiện trên đồ thị hình 4. Hình 4. Sự biến đổi hàm lượng lipid hydroperoxide (A) và TBARS (B) trong hỗn hợp phản ứng oxy hóa EPA kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylMb ở 370C Từ kết quả trên đồ thị hình 4A cho thấy khi bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylMb phản ứng oxy hóa EPA xảy ra mãnh liệt, hàm lượng lipid hydroperoxide trong hỗn hợp phản ứng tăng nhanh và đạt giá trị cực đại sau 30 phút phản ứng ở 370C. Hàm lượng lipid hydroperoxide giảm xuống đáng kể khi kéo dài thời gian phản ứng đến 45 phút và tiếp tục giảm nhanh sau 60 phút phản ứng. Điều này có thể giải thích dựa vào phản ứng kích hoạt oxy hóa lipid bởi gốc tự do ferrylMb [6] và 3 giai đoạn của quá trình phản ứng oxy hóa lipid [10] như sau: Ở giai đoạn khơi mào, gốc tự do ferrylMb kích hoạt phản ứng oxy hóa lipid bằng cách lấy đi nguyên tử hydrogen trong nhóm methylen của lipid hình thành Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13 gốc tự do lipid. Gốc tự do lipid tạo thành sẽ tiếp tục phản ứng với oxygen tạo gốc tự do lipid peroxyl. Ở giai đoạn lan truyền, gốc tự do lipid peroxyl sẽ hình thành hợp chất lipid hydroperoxide bằng các lấy đi nguyên tử hydrogen từ phân tử lipid khác và lại tạo ra gốc tự do lipid. Các phản ứng này tiếp diễn nên hàm lượng lipid hydroperoxide tăng nhanh ở giai đoạn này. Kết quả nghiên cứu này cho thấy hàm lượng lipid hydroperoxide tạo thành trong hỗn hợp phản ứng tăng nhanh từ 294,02 ± 25,28 nmol/g sau 5 phút phản ứng đến 1561,90 ± 97,36 nmol/g sau 30 phút phản ứng. Hàm lượng lipid hydroperoxide giảm xuống đáng kể sau 45 phút phản ứng và tiếp tục giảm nhanh sau 60 phút phản ứng là do lúc này lượng cơ chất (EPA) trong hỗn hợp phản ứng còn lại ít và quá trình oxy hóa dần chuyển sang giai đoạn kết thúc nên lượng lipid hydroperoxide tạo thành ít hơn lượng lipid hydroperoxide bị phân hủy. Lipid hydroperoxide hình thành trong quá trình oxy hóa tiếp tục bị phân hủy tạo ra các hợp chất aldehyde [5], hàm lượng các hợp chất aldehyde tạo thành được xác định thông qua chỉ số TBARS. Kết quả nghiên cứu này cho thấy hàm lượng TBARS của hỗn hợp phản ứng tăng nhanh theo thời gian phản ứng (hình 4B). Từ đồ thị hình 4 còn cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình phản ứng hàm lượng TBARS tăng tỷ lệ thuận với hàm lượng lipid hydroperoxide, hệ số tương quan (R2) giữa hàm lượng TBARS với hàm lượng lipid hydroperoxide trong 30 phút đầu của quá trình phản ứng là 0,99. Chất chống oxy hóa là những chất làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa nhờ có khả năng chuyển các gốc tự do thành phân tử ổn định, tác dụng tạo phức với ion kim loại làm ức chế xúc tác cho quá trình oxy hóa hoặc phân hủy hydroperoxide thành các phân tử không phải là gốc tự do. Chính vì vậy, để áp dụng hệ phản ứng này vào việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thì thời gian thích hợp cho phản ứng oxy hóa EPA kích hoạt bởi gốc tự do ferrylMb ở 370C là 30 phút. Kiểm chứng tính phù hợp của hệ phản ứng Fenton đã được thiết lập cho việc phân tích hoạt tính chống oxy hóa Mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa xác định bằng hệ phản ứng Fenton với hoạt tính chống oxy hóa xác định dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2 của ESH ở các nồng độ khác nhau được thể hiện trên đồ thị hình 5. Hình 5. Tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid với khả năng khử gốc tự do DPPH (A), tổng năng lực khử (B), khả năng khử H 2 O 2 (C) của ESH Từ đồ thị hình 5 cho thấy kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của ESH bằng hệ phản ứng Fenton có mối tương quan rất cao với kết quả phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH (R2 = 0,99), tổng năng lực khử (R2 = 0,98) và khả năng khử H2O2 (R 2 = 0,99) của ESH. Từ những kết quả trên cho thấy, hệ phản ứng Fenton thiết lập được có thể áp dụng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa và đề xuất phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton trong hệ EPA/metMb/H2O2 (hình 6). Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 0,1 ml metmyoglobin 50 µM và 0,1 ml H2O2 100 µM trong đệm phosphate (50 mM, pH = 7,4). Lắc đều để phản ứng xảy ra trong 3 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm 0,2 ml Tween 20 có chứa 50 µM EPA và 0,1 ml chất chống oxy hóa. Đậy nắp ống nghiệm, trộn đều trên máy (votex) rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Sau đó, lấy 0,2 ml hỗn hợp các chất phản ứng cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy khác và cho thêm vào 0,3 ml KCl 1,15%, 0,5 ml H3PO4 1%, 1 ml thiobarbituric (TBARS) 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 950C trong 45 phút. Sau đó, làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng và tiếp tục cho vào ống nghiệm 4 ml Butanol, lắc đều rồi để yên trong 10 phút. Tách lớp butanol màu đỏ bên trên đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535 nm trên quang phổ kế UV-VIS. Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự nhưng thay 0,1 ml chất chống oxy hóa bằng 0,1 ml dung môi dùng để hòa tan chất chống oxy hóa. Tính kết quả: Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Trong đó: Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 535 nm; A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bước sóng 535 nm. IV. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã thiết lập được hệ phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp này có mối tương quan rất cao (R2 ≥ 0,98) với kết quả phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2. Hỗn hợp phản ứng là hệ nhũ tương dầu - nước nên có thể áp dụng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất có độ phân cực khác nhau. Hình 6. Sơ đồ minh họa phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton trong hệ EPA/metMb/H 2 O 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Barbusinsky, K., 2009. Fenton Reaction - Controversy concerning the chemistry. Ecological Chemistry and Engineering, 16 (3): 347-358. 2. Caillet, S., Yu, H., Lessard, S., Lamoureux, G., Ajdukovic, D., Lacroix, M., 2007. Fenton reaction applied for screening natural antioxidants. Food Chemistry, 100 (2): 542-552. 3. Egawa, T., Shimada, H., Ishimura, Y., 2000. Formation of compound I in the reaction of native myoglobins with hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry, 275 (45): 34858-34866. 4. Fu, H. Y., Shieh, D. E., Ho, C. T., 2002. Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms. Journal of Food Lipids, 9: 35-46. 5. Frankel, E. N., 1984. Lipid Oxidation: Mechanisms, Products and Biological Signifi cance. JAOCS, 61 (12): 1908-1917. 6. Kanner, J., Harel, S., 1985. Initiation of membranal lipid peroxidation by activated metmyoglobin and methemoglobin. Archives of Biochemistry and Biophysics, 237: 314-321. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15 7. Menna, P., Salvatorelli, E., Giampietro, R., Liberi, G., Teodori, G., Calafi ore, A. M., Minotti, G., 2002. Doxorubicin- dependent reduction of ferrylmyoglobin and inhibition of lipid peroxidation: implications for cardiotoxicity of anticancer anthracyclines. Chemical Research in Toxicology, 15 (9): 1179-1189. 8. Min, B., Nam, K. C., Ahn, D. U., 2010. Catalytic mechanisms of metmyoglobin on the oxidation of lipids in phospholipid liposome model system. Food Chemistry, 123 (2): 231–236. 9. Nabavi, S. M., Ebrahimzadeh, M. A., Nabavi, S. F., Fazelian, M., Eslami, B., 2009. In vitro antioxidant and free radical scavenging activity of Diospyros lotus and Pyrus boissieriana growing in Iran. Pharmacognosy Magazine, 4 (18): 123-127. 10. Nawar, W. W., 1996. Lipids. In Food Chemistry. (Fennema, O. R. ed.). Marcel Dekker, Inc. New York: 225-319. 11. Oyaizu, M., 1986. Studies on products of browing reactions: antioxidative activities of productions of browning reaction prepared from glucosamine. Japanese Journal Nutrition, 44: 307-315. 12. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C., 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26 (9-10): 1231-1237. 13. Sohn, J. H., Taki, Y., Ushio, H., Ohshima, T., 2005. Quantitative determination of total lipid hydroperoxides by a fl ow injection analysis system.. Lipids, 40 (2): 203-209. 14. Svistunenko, D. A., 2005. Reaction of haem containing proteins and enzymes with hydroperoxides: the radical view. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1707 (1): 127-155. 15. Uchiyama, M., Mihara, M., 1978. Determination of malonaldehyde precursor in tissue by thiobarbituric acid test. Analytical Biochemistry, 86: 271-278. 16. Viriyarattanasak, C., Matsukawa, S., Hamada-Sato, N., Watanabe, M., Suzuki, T., 2008. Quantitative measurement of metmyoglobin in tuna fl esh via electron paramagnetic resonance. Food Chemistry, 111 (4): 1050-1056. 17. Wazawa, T., Matsuoka, A., Tajima, G., Sugawara, Y., Nakamura, K., Shikama, K., 1992. Hydrogen peroxide plays a key role in the oxidation reaction of myoglobin by molecular oxygen. A computer simulation. Biophysical Journal, 63 (2): 544–550.