Một số thành phần hóa học có trong cây hàn the (Desmdium heterophylum) họ cánh bướm (Papilionaceae)

Nghiêm Thị Hƣơng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 65(03): 103 - 107 103 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY HÀN THE (DESMDIUM HETEROPHYLUM) HỌ CÁNH BƯỚM (PAPILIONACEAE) Nghiêm Thị Hương, Phạm Văn Thỉnh* Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Cây hàn the đã đƣợc Y học dân tộc dùng làm thuốc Nam chữa các bệnh cảm sốt, sỏi thận, tiêu viêm rất hiệu quả. Nghiên cứu về hoá học thực vật hàn the (Desmodium heterophyllum) cho thấy trong cây hàn the chứa 7 nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao đó là: các đƣờng khử, ancaloit, steroit, flavonoit, cumarin, poliphenol và các saponin. Từ dịch chiết bằng n-hexan đã tách đƣợc steroit và glucozit của nó là stigmatsterol và 3-O--D- glucopyranozyl stigmasterol, còn từ dịch chiết bằng CHCl3 tách đƣợc -sitosterol-3--D-glucopyranozit. Trong dịch chiết bằng etyl axetat đã tách đƣợc một flavonoit. Cấu trúc hoá học của nó đã đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ IR, MS, 1D và 2D-NMR cho biết flavonoit ấy chính là 8-C--D- glucopyranozyl apigenin (vitexin). Vitexin là chất có hoạt tính sinh học cao đã đƣợc sử dụng làm thuốc chống viêm và hạn chế sự phát triển của các khối u. Từ khoá: Cây hàn the, Desmodium heterophyllum, steroit, flavonoit, vitex. MỞ ĐẦU Cây hàn the là thuộc loại cây cỏ mọc hoang ở khắp nơi, có tên khoa học là Desmdium heterophylum thuộc họ Cánh bƣớm - Papilionaceae. Trong Y học dân tộc, cây hàn the đƣợc nhân dân dùng nhƣ cây thuốc để chữa nhiều loại bệnh: chữa bệnh cảm sốt nóng, ho có đờm, tiêu sƣng, tiêu viêm, chữa các bệnh đái buốt, sỏi thận, sỏi mật, thông hơi, lợi tiểu, toàn cây giã nát đắp ngoài vết thƣơng [1]. Có nhiều ứng dụng nhƣ vậy song hầu nhƣ ở nƣớc ta còn chƣa có công trình nào nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây hàn the. Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi giới thiệu một số kết quả nghiên cứu thành phần hoá học cây hàn the . NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Cây hàn the thu toàn cây ở các bãi hoang trong khu vực trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên vào tháng 2 năm 2009 và đƣợc Bộ môn phân loại thực vật khoa Sinh xác định tên khoa học là Desmdium heterophylum. Thiết bị nghiên cứu: Điểm chảy đƣợc đo trên máy Electrothermal IA-9200, Phổ IR đƣợc ghi trên máy IMPACT-410 dạng viên nén tinh thể KBr. Phổ MS ghi trên máy HP-1100 LS/MS. Trap. Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) đƣợc ghi trên máy Bruker AM 500 FT-NMR và TMS đƣợc dùng  Tel: 0912132563, Email: phamvanthinhsptn@gmail.com làm chất chuẩn nội. Sắc kí lớp mỏng tráng sẵn trên đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60 F254. Sắc kí cột sử dụng chất nhồi Silica gel (Kieselgel 63-230 mesh) PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thực vật tƣơi đƣợc diệt men bằng cách sấy nóng ở 1100C trong 10 phút sau đó sấy khô ở nhiệt độ 600C đến khối lƣợng không đổi. Mẫu khô đƣợc nghiền nhỏ thành bột, ngâm chiết phân lập bằng các dung môi với độ phân cực khác nhau. Các chất tinh khiết đƣợc phân lập bằng phƣơng pháp sắc kí cột với các hệ dung môi thích hợp và làm sạch bằng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn lặp lại nhiều lần theo sơ đồ 1. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trên cơ sở phân tích định tính bằng các phản ứng màu để nhận dạng các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao, đã phát hiện thấy trong cây hàn the có chứa 7 nhóm chất có hoạt tính sinh học, kết quả đƣợc nêu ra ở bảng 1. Nghiêm Thị Hƣơng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 65(03): 100 - 104 104 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 1: Nhận dạng các nhóm chất có hoạt tính sinh học trong cây hàn the. TT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Kết quả 1 Đƣờng khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gach ++ 2 Ancaloit Dragendooc Màu vàng da cam + 3 Steroit Libecman - Bocsa Màu hồng đến xanh lá cây ++ 4 Flavonoit Xianiđin Màu hồng ++ NH3 đặc Vàng đậm ++ 5 Poliphenol FeCl3 Màu xanh đen ++ 6 Cumarin Axit – Kiềm Kết tủa bông ++ 7 Glicozit tim Kelle -Kiliani Không có hiện tƣợng gi - 8 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong môi trƣờng kiềm ++ Ghi chú: Dấu (+) là cho phản ứng dương tính, dấu (++) là phản ứng dương tính rất rõ, dấu (-) là không có phản ứng Chất PH1 Thu đƣợc từ cặn n-hexan của cây hàn the là chất rắn ở dạng tinh thể hình kim, không màu, khối lƣợng 25 mg. Nhiệt độ nóng chảy đo đƣợc là 156-1580C, Rf = 0,8 trong hệ dung môi n-hexan – etylaxetat (85:15). Phổ FT-IR cho phép khẳng định sự có mặt của nhóm OH axm = 3406 cm-1, còn phổ 1 H-NMR cho 3H   = 3,58 ppm. Có 2 nối đôi không liên hợp với axm = 1621 cm-1, còn trong phổ 1H-NMR có 3H ở các nhóm metin (C-H) liên kết với cacbon chƣa no ở các nối đôi trên đó là  H-6 = 5,37ppm và  H-22 = 5,15 ppm, J = 15HZ và 7 HZ và  H-23 = 5,02 ppm, J = 15 và 7 HZ). So sánh các dữ liệu phổ FT-IR, phổ 1H- NMR, nhiệt độ nóng chảy, các hằng số vật lí khác của chất PH1 với stigmasterol của phòng thí nghiệm [2] chúng tôi nhận thấy chúng hoàn toàn tƣơng tự nhau. Vì vậy có thể quy kết chất PH1 là stigmasterol (hay stigmast-5,22-dien-24R-3-ol). Stigmast-5,22-dien-24R-3 -ol (stigmasterol) Chất PH2: Chất PH2 là chất rắn vô định hình, tan đƣợc trong etylaxetat, trong metanol, dễ tan trong hỗn hợp dung môi n- hexan - etyl axetat (20:80) có nhiệt độ nóng chảy ở 288-2900C. Nghiêm Thị Hƣơng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 65(03): 100 - 104 105 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Thuỷ phân chất PH2 trong dung dịch HCl 2N thu đƣợc stigmasterol, phổ 1H-NMR của sản phẩm sau thuỷ phân không còn những tín hiệu của phần đƣờng và hoàn toàn tƣơng tự nhƣ phổ của stigmasterol. Phần dung dịch đƣợc phân tích bằng sắc kí, so sánh với các đƣờng mẫu chuẩn của của phòng thí nghiệm cho thấy tƣơng ứng với đƣờng glucozơ. Phân tích phổ 1H-NMR của chất PH2 cũng cho thấy các phần rõ rệt tƣơng ứng với phổ 1 H-NMR của stigmasterol và phần đƣờng tƣơng ứng với các độ chuyển dịch hoá học của các H trong phần đƣờng ( 3H   từ 3,24 đến 4,5 ppm). Từ các dữ kiện thực nghiệm trên chúng tôi cho rằng chất PH2 là 3-O--D- glucopyranozyl stigmasterol Chất PC1: Hợp chất PC1 đƣợc phân lập trong cặn dịch clorofom bằng sắc kí cột nhồi silicagen, rửa giải bằng hệ dung môi etylaxetat : metanol (70-30), thu đƣợc 10 mg tinh thể dạng bột màu xám. Rf = 0,65 trong hệ dung môi clorofom – metanol (30:10), Rf = 0,45 trong hệ dung môi n-butanol-axit axetic-nƣớc (4:1:5). Nhiệt độ nóng chảy đo đƣợc là 276-2800C. Phân tích phổ 1H-NMR của chất PC1 thấy rất giống với phổ của chất PH2 tức là giống với phổ của stigmasterolglucozit ngoại trừ không phát hiện thấy H =5,15 và H =5,03 của các proton ở liên kết C-H tại các vị trí C22 và C23, điều này gợi ý cho biết có thể chất PC1 là glycozit của -sitosterol. Khi thuỷ phân chất PC1 bằng dung dịch HCl 2N ta thu đƣợc chất kết tủa mà cả Rf lẫn phổ 1 H-NMR của nó đều trùng lặp với phổ và Rf của -sitosterol [2]. Phần dung dịch thuỷ phân đƣợc nhận dạng đƣờng glucozơ bằng phƣơng pháp sắc kí giấy có so sánh với glucozơ của phòng thí nghiệm thấy cho các số liệu trùng nhau. Từ kết quả trên có thể quy kết chất PC1 là 3-O-- D-glucopyranozyt sitosterol. Chất PE1: Hợp chất PE1 thu đƣợc dƣới dạng chất rắn vô định hình màu vàng, khối lƣợng 12 mg, thu đƣợc ở cặn dịch etylaxetat khi rửa giải ở hệ dung môi etylaxetat: metanol (90:10). Nhiệt độ nóng chảy đo đƣợc là 271-274 0 C. PH2 là 3-O--D- glucopyranozyl stigmasterol. PC1 là -sitosterol-3--D-glucopyrannozit Phổ UV và phổ NMR của PE1 có dạng phổ của hợp chất flavonoit glycozit. Có tín hiệu rộng singlet cộng hƣởng ở vùng trƣờng rất thấp ( δ = 13,15 ppm) gợi ý về sự có mặt của nhóm OH ở vị trí C-5 (vòng A) và tham gia liên kết hidro với oxi trong nhóm C=O ở vị trí C-4 (vòng C). Hai tín hiệu mạnh singlet khác ở δ = 6,76 đặc trƣng cho proton ở nối đôi tại C-3 của các flavon. Ở vòng B chỉ có 1 nhóm OH ở vị trí C-4 cũng đƣợc minh chứng trong phổ 1H-NMR với tín hiệu doublet ở δ = 8,0; J = 8,1 Hz (2H đặc trƣng cho các H-2’ và H-6’). Một tín hiệu doublet nữa ở δ = 6,9 với J = 8,2 đặc trƣng cho proton ở H-3’ và H-5’. Proton có tín hiệu ở δ = 6,26 là của proton của H-6. Các proton của phần đƣờng đƣợc phát hiện trong vùng tín hiệu δ = 3,4- 4,96. Đáng chú ý là proton ở cacbon anome (C-1”) có giá trị cao hơn cả δ = 4,68 (J = 0,5 Hz) so với các giá trị tƣơng ứng trong trƣờng hợp O-glycozit. Điều này cho phép nghĩ đến liên kết glycozit ở hợp chất PE1 là liên kết C-glycozit. Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu tƣơng ứng của 15 C thuộc khung flavon và 6 cacbon của Nghiêm Thị Hƣơng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 65(03): 100 - 104 106 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên mạch đƣờng. Nhóm cacbonyl đƣợc nhận dạng bởi tín hiệu δ = 181,88. Vòng B có 2 tín hiệu cao gấp đôi các tín hiệu khác ở δ = 128,69 và δ = 115,71. Đó chính là các tín hiệu của C-2’, C-6’ và của C-3’, C-5’. Vị trí C-4 , đƣợc nhận ra với tín hiệu δ = 160,98. Còn tín hiệu của C-1’ ở δ = 121,51. Các giá trị δC của phân tử đƣờng là 61,19 (C- 6 ” ); 70,53 (C-4 ” ); 70,84 (C-2 ” ); 73,38 (C-1 ” ); 78,5 (C-3 ” ) và 81,62 (C-5 ” ) là hoàn toàn phù hợp với các tín hiệu của đƣờng glucopyranozit có liên kết C-C [4]. Khi so sánh các giá trị phổ và tính chất vật lí khác của chất PE1 với chất 8-C--D- glucopyranozyl apigenin (Vitexin) của các tác giả khác cho kết quả rất phù hợp nhau [3,4] Trên phổ HSQC và HMBC của chất PE1 cũng cho phép quy kết độ dịch chuyển hoá học của các vị trí C và H trong công thức cấu tạo giả định của chất PE1. Tƣơng tác HMBC của H-1” với C-2”, C-3”, C- 5 ” , C-6, C-7, C-8 không những khẳng định thêm các giá trị độ dịch chuyển hoá học của các vị trí trên mà còn khẳng định sự tạo liên kết C-glycozit ở vị trí C-8. Tƣơng tác HMBC của H-6 (δ = 6,26) với C-5 và C-7; tƣơng tác của H-3 với C-4 và C-2 cũng đã cho biết hai nhóm OH phải ở vị trí C-5 và C-7 và nối đôi ở C-2 với C-3 Từ các lập luận trên và kết quả của các phổ NMR có thể quy kết cho các vị trí nhƣ bảng 2 Bảng 2: Số liệu phổ 13 C-NMR của PE 1 Vị trí c (ppm) H (J,Hz) Vị trí c (ppm) H (J,Hz) 2 163,6 s 1’ 121,5 s 3 102,8 d 6,78 s 2’ 128,7 d 7,93 (8,3) 4 182,0 s 3’ 115,7 d 6,9 (8,2) 5 160,7 s 13,155 s (OH) 4’ 160,9 6 98,09 s 6,26 s 5’ 115,7 d 6,9 (8,2) 7 163,3 s 6’ 128,6 d 8,0 (8,2) 8 104,4 d 1’’ 73,38 d 4,68 ( 0,5) 9 156,3 s 2’’ 70,8 3,84 t 10 103,5 s 3’’ 78,59 3,3 4’’ 70,53 3,4 5’’ 81,62 3,25 6’’ 61,19 3,53 t (5,4) 3,75 d (9,5) O O OH H OH H H OHH H OH OH HO OH O Chất PE1: 8-C--D-glucopyranozyl apigenin (Vitexin) KẾT LUẬN Lần đầu tiên, cây hàn the (Desmodium heterophyllum - Papilionaceac), mọc hoang tại Thái Nguyên đƣợc nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật, đã thiết lập đƣợc quy trình ngâm chiết mẫu hợp lí thu đƣợc 4 dịch chiết chọn Nghiêm Thị Hƣơng và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 65(03): 100 - 104 107 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên lọc. Từ toàn bộ phần trên mặt đất (thân và lá) cây hàn the (Desmodium heterophyllum - Papilionaceac), bằng phƣơng pháp phân tích định tính đã khẳng định trong cây hàn the ít nhất có chứa tới 7 nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng đó là: đƣờng khử, ankaloit, steroit, flavonoit, poliphenol, cumarin và saponin. Lần đầu tiên, đã phân lập và bằng các phƣơng pháp quang phổ có độ phân giải cao đã xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 4 hợp chất có trong cây hàn the đó là Stigmast-5,22-dien- 24R-3-ol; 3-O--D- glucopyranozyl stigmasterol;-sitosterol-3--D- glucopyranozit và 8-C--D-glucopyranozyl apigenin . TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội 1999 [2] Phạm Văn Thỉnh, Bùi Văn Bình- Nghiên cứu hoá học cây đỏ ngọn mọc hoang tại đất đồi Thái Nguyên, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - ĐH Thái Nguyên 2008 (46) ,71-75. [3] Nguyễn Thị Hồng Vân, Phan Văn Kiên, Châu Văn Minh... , Các hợp chất flavonoit phân lập từ lá cây bồ kết, Tạp chí Dƣợc học số 379 (11/2007) tr. 36-39 [4] Yin.F., Hu.L., Pan.R. novel dammarane-type glycoside from Gynostemma pentaphyllum. Chem. Pharm. Bull. (2004) Vol.52 p.1440 – 1444. SOME CHEMICAL COMPOSITION OF DESMDIUM HETEROPHYLUM - PAPILIONACEAE Nghiem Thi Huong, Pham Van Thinh 1 College of Education - Thai Nguyen University SUMMARY Desmodium heterophyllum was very effectively treated fever, kidney stones inflammation targets in the medical tradition. Chemical components of the Desmodium heterophyllum shows containing the seven groups of natural compounds with high biological activity: reducing sugar, alkaloids, steroids, flavonoids, coumarin, polyphenol and saponin. From n-Hexane extraction were isolated steroid, stigmatsterol glucosid and 3-O-β-D-glucopyranozyl stigmasterol, also from CHCl3 extraction were isolated β-sitosterol-3-β-D-glucopyranosid. From ethyl acetate extraction were isolated a flavonoid. Its chemical structure was determined by the modern methods as IR, MS, 1D and 2D-NMR and structure of extracted flavonoid is 8-C-β-D-glucopyranozyl apigenin (vitexin). Vitexin is biologically active substances have been used as a high anti-inflammatory drugs and limit the growth of tumors. Key words: Welding tree, Desmodium heterophyllum, steroids, flavonoid, vitexin. 1 Tel:0912132563, Email: phamvanthinhsptn@gmail.com