Bài giảng Mô hình động vật trong nghiên cứu bệnh về khớp

* Tại sao sử dụng mô hình động vật IN VITRO •  Nhiều vấn đề quan trọng liên quan đến sự biệt hoá và chức năng sụn khớp có thể được nghiên cứu in vitro •  Thử nghiệm in vitro có thể được sử dụng để xác định sự tương tác giữa tế bào với chất nền IN VIVO !  Tuy nhiên, thử nghiệm trên động vật cần thiết để khám phá ra !  Sự tăng trưởng và biệt hoá của tế bào trong vi môi trường sụn- khớp !  Tính an toàn cục bộ và hệ thống !  Sự ổn định chức năng của tế bào, sự biểu hiện marker và đặc tính cơ học của sụn khớp mới !  Ảnh hưởng lâu dài của sự tái thiết lập mô trong và quanh vùng tổn thương/vùng được điều trị

pdf41 trang | Chia sẻ: Tiểu Khải Minh | Ngày: 17/02/2024 | Lượt xem: 59 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Mô hình động vật trong nghiên cứu bệnh về khớp, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VỀ KHỚP TS. Vũ Bích Ngọc ngocvu@sci.edu.vn TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN TẾ BÀO GỐC 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn Tại sao sử dụng mô hình động vật để nghiên cứu các bệnh về xương khớp? Xác định các mô hình động vật thích hợp nhất cho nghiên cứu Phương pháp và thời điểm đánh giá kết quả 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Tại sao sử dụng mô hình động vật !  Tuy nhiên, thử nghiệm trên động vật cần thiết để khám phá ra !  Sự tăng trưởng và biệt hoá của tế bào trong vi môi trường sụn- khớp !  Tính an toàn cục bộ và hệ thống !  Sự ổn định chức năng của tế bào, sự biểu hiện marker và đặc tính cơ học của sụn khớp mới !  Ảnh hưởng lâu dài của sự tái thiết lập mô trong và quanh vùng tổn thương/vùng được điều trị •  Nhiều vấn đề quan trọng liên quan đến sự biệt hoá và chức năng sụn khớp có thể được nghiên cứu in vitro •  Thử nghiệm in vitro có thể được sử dụng để xác định sự tương tác giữa tế bào với chất nền IN VITRO IN VIVO 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Kết quả nghiên cứu trên động vật có thể ứng dụng trên người? !  Nhiều điểm tương đồng trong cấu trúc sụn khớp giữa động vật (cừu, heo) và người !  Động vật cho chỉ số an toàn tốt !  Nghiên cứu trước trên động vật sẽ hỗ trợ nghiên cứu trên người !  Nghiên cứu y học về người phải được hỗ trợ bằng các nghiên cứu trên động vật !  Gần như tất cả tiến bộ y học của thế kỷ trước bắt đầu với nghiên cứu ở động vật 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn GIẢI PHẪU SỤN KHỚP Human* Dog Pig * Goat Sheep * Rat Rabbit Mouse * Bellemans, 1999 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + CÁC LOẠI KHỚP 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Cấu tạo khớp gối 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn +Các bệnh về khớp !  Viêm bao hoạt dịch !  Bong gân !  Viêm khớp 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Viêm khớp !  xảy ra khi sụn ở khớp xương giảm theo thời gian. !  phương pháp điều trị viêm xương khớp có thể làm giảm đau và giúp duy trì hoạt động •  Viêm khớp do viêm •  Viêm khớp do thoái hoá 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình động vật sẵn có !  Loài gặm nhấm (chuột, rat) !  Động vật nhai lại: cừu, dê !  Thỏ !  Heo !  Ngựa !  Linh trưởng 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Các vấn đề quan trọng trong lựa chọn mô hình !  Đặc tính cấu tạo !  Tốc độ sinh sản cao !  Tuổi thọ trung bình ngắn !  Di truyền tương đương với con người MỖI ĐỘNG VẬT CÓ NHỮNG ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM RIÊNG 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Các vấn đề quan trọng trong lựa chọn mô hình !  Tuổi tác và ảnh hưởng của nó đối với sụn khớp !  Kích thước (diện tích, độ sâu) và vị trí của tổn thương •  Kích thước một phần hoặc toàn bộ độ dày, quan trọng hay không quan trọng •  vị trí mang trọng lượng nặng so với vị trí ít mang trọng lượng •  Điều khiển thích hợp phẫu thuật ! Bản chất của phương pháp điều trị: ! ghép tế bào tự thân hay đồng loại ! Ghép vật liệu sinh học 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình động vật tốt nhất !  ”Tốt nhất" nên tham khảo liên quan đến con người nhưng nó cũng bị ảnh hưởng bởi những vấn đề thực tiễn như !  Chi phí (nghiên cứu ngắn ở động vật nhỏ là ít tốn kém nhất!) !  Tính Sẵn có của cơ sở vật chất, trang thiết bị và nhân viên có tay nghề cao !  Giải phẫu so sánh và chức năng khớp !  Đánh giá ở mức giải phẫu bề mặt khớp !  Các khớp lớn hơn cung cấp nhiều sụn hơn !  Các khớp lớn hơn cũng có thể cho phép các thao tác nội soi khớp "  Giao thức phục hồi chức năng "  kết quả đo lường: trong khi sống và sau khi chết "  Một mô hình có thể không được lý tưởng cho mọi giai đoạn thử nghiệm 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + viêm khớp 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Thành phần của sụn •  Không có mạch máu, không có thần kinh •  Chủ yếu là các tế bào sụn •  Chất nền có khả năng ngậm nước cao: PGs, non-collagen protein •  Mạng lưới collagen type II •  Khi bị ép, nước và các phân tử chất tan thoát ra gian bào •  Khi hết lực ép thì tái hydrat hóa 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Nguyên nhân •  Bệnh truyền nhiễm •  phản ứng quá mẫn •  Chế độ dinh dưỡng hoặc trao đổi chất •  rối loạn nội tiết một •  tình trạng tâm thần •  Di truyền 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn Cơ chế gây bệnh 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Cơ chế gây bệnh 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn +Mô hình động vật viêm khớp do viêm !  Induced arthritis models !  Collagen-induced arthritis !  Collagen-antibody-induced arthritis !  Zymosan-induced arthritis !  Antigen-induced arthritis !  Other induced models of arthritis !  Genetically manipulated spontaneous arthritis models !  TNF-a transgenic mouse model of inflammatory arthritis !  K/BN model !  SKG model !  Human/SCID chimeric mice !  Human DR4-CD4 mice !  Other spontaneous transgenic models of arthritis 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình động vật viêm khớp Viêm đa khớp, dễ tạo mô hình ở động vật gặm nhấm Hiệu quả kém đối với chuột khởi phát trong vòng 48 h, đại thực bào và tế bào đa nhân tham gia, không có sự tham gia của T và B-cell. Có thể gây ra viêm đa khớp trong hầu hết các chủng chuột phát triển 3 ngày sau khi cảm ứng; giảm bớt ở ngày thứ 7 nhưng tái phát sau ngày 25. ; Cần kỹ thuật cao để thực hiện tiêm vào trong sụn khớp; Phụ thuộc vào TLR2; Có thể cảm ứng được ở nhiều chủng chuột Cần kỹ thuật cao trong tiêm vào sụn khớp và phưuong pháp phân tích hệ thống tốt Mãn tính tự phát và viêm đa khớp tiến triển, phát triển bệnh ở 3-4wk tuổi. Cần chuyển gen KBxN, SKG và DNase II/IFN-IR/và TNF. Những đột biến này cho đến nay vẫn chỉ được xác định ở chuột. 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình khỉ viêm đa khớp dạng thấp do collagen !  Đặc điểm * Bệnh từ vừa đến nặng, tương tự như viêm khớp người * viêm nhiều khớp, sưng khớp liên tục, phá hủy khớp nối và làm huỷ xương; * Sự gia tăng màng hoạt dịch, thâm nhiễm tế bào viêm; * Sự hình thành mô xơ và tổn thương sụn !  Các điểm chính để đánh giá viêm khớp: * Tỷ lệ mắc bệnh; * Tần suất viêm của các khớp xương liên sườn gần; * Đo mức độ sưng khớp; *thang điểm đánh giá viêm * Trọng lượng động vật 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình khỉ viêm đa khớp dạng thấp do collagen !  Các điểm theo dõi đáp ứng miễn dịch và tiến triển bệnh: * Phân tích huyết học ; * Serum biomarkers (C-reactive protein, alkaline phosphatase, albumin...); * Monkey anti-type II collagen IgG ELISA; * Antigen-specific T cell and B cell responses; * Cytokines !  Các đánh giá bổ sung để (đánh giá mô bệnh học xương và mô học) *chụp X quang, MRI khớp (đo sự phá hủy khớp, sự mất xương và tăng trưởng bất thường, mất khoang khớp) * Phân tích mô bệnh học * Định lượng hình thá (Hệ thống phần mềm OsteoMeasure) * Immunohistochemistry 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình khỉ bị viêm khớp 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình chuột hoại tử chỏm xương đùi vô mạch Chỏm xương đùi ? # Mô sụn # Mô xương # Hệ mạch Hoại tử vô mạch chỏm xương đùi # Định nghĩa # Điều trị 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Hoại tử chỏm xương đùi vô mạch !  Có thể phân chia thành 2 loại nguyên nhân chính: !  do chấn thương (làm gãy cổ xương đùi, trật khớp háng, đứt các mạch máu lớn nuôi phần chỏm xương) !  Nguyên nhân không do chấn thương: : Do rượu hoặc dùng nhiều thuốc có chứa steroids. !  Có hệ thống phân loại cấp độ, chủ yếu dựa trên hình ảnh chụp X quang, MRI. 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn +Mô hình động vật Phương pháp cơ học vật lý $ Sử dụng lực hoặc áp suất cao tác động đến xương và chỏm xương. $ Phẫu thuật, buộc thắt hoặc sử dụng các dị vật làm nghẽn mạch máu nuôi chỏm xương. Sử dụng hóa chất Glucocorticoids Methylprednisolone Lipopolysaccharide Chuột, thỏ, heo, chó RƯỢU 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Cấp độ tổn thương 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Mô hình động vật hoại tử chỏm xương đùi vô mạch Mốc đánh giá 3 tuần 5 tuần 7 tuần Khảo sát phương pháp tiêm Chuột Lô thí nghiệm: Xử lý LPS + MPS Lô đối chứng: Xử lý NaCl 0,9% Đánh giá các chỉ tiêu Sinh lý: Cân nặng Các trạng thái sinh lý khác. Mô học: Cấu trúc mô: Nhuộm H&E, Nhuộm Safranin Mật độ mạch máu: hóa mô miễn dịch. Tế bào: - Chu kỳ tế bào: Nhuộm PI-Flow cytometry Lô A: Tiêm tĩnh mạch đuôi cho LPS và MPS Lô B: Tiêm tĩnh mạch đuôi cho MPS Tiêm cơ đùi cho LPS Chọn phương pháp tiêm và phân lô thí nghiệm Mus musculus var. Albino Ngày 1 2 3 4 5 6 $ 15 Thuố c LPS LPS MPS LPS LPS MPS Liều 2,5mg /kg 2,5mg /kg 30mg/ kg 2,5mg /kg 2,5mg /kg 4mg/con 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn +Đánh giá mô hình 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + KẾT QUẢ - Cấu trúc mô học Cấu trúc chỏm xương nhuộm H&E (50X) (A)  Đối chứng (B)  Thí nghiệm 5 tuần (C)  Thí nghiệm 7 tuần Mô sụn Đĩa sụn Khoang xương A B C Cấu trúc các tế bào sụn ở trạng thái bình thường (200X) Nhóm tế bào sụn cùng dòng (isogenous group) Mô sụn dưới độ phóng đại 200X, (A) đối chứng, (B) 7 tuần A B 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn +KẾT QUẢ - Ảnh hưởng thuốc lên mô xương 0 5 10 15 20 25 30 35 Đối chứng 3 tuần 5 tuần 7 tuần * Kết luận: khuyết hổng xương biểu hiện tăng rõ từ tuần thứ 5 đến tuần thứ 7. (p<0,05). $ MPS kết hợp LPS gây tác động hoại tử các tế bào xương khảm trong chất nền xương. Biểu đồ tỉ lệ khuyết hổng xương Sự xuất hiện các khuyết hổng xương (100X) (A) Mô đối chứng (B) Mô thí nghiệm 3 tuần (C) Mô thí nghiệm 5 tuần (D) Mô thí nghiệm 7 tuần ** A B C D 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + KẾT QUẢ - Ảnh hưởng thuốc lên mô sụn Kết luận: MPS và LPS gây xơ hóa sụn và gây mất liên kết lên đĩa sụn tiếp hợp xương. 2,63 0,62 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Đối chứng 7 tuần Biểu đồ lượng proteoglycan trong mô sụn Chỏm xương nhuộm Safranin O (A) Mô đối chứng (B) Mô thí nghiệm 3 tuần (C) Mô thí nghiệm 5 tuần A B C 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + KẾT QUẢ - Hóa mô miễn dịch VEGF-R2 Kết luận: Xử lý MPS và LPS dẫn đến: VEGF có sự suy giảm trong mô xương, tăng trong mô sụn ở lô thí nghiệm trong giai đoạn 7 tuần. Hoechst Hoechst VEGF-R2 VEGF-R2 Merge Merge Ánh sáng trắng Ánh sáng huỳnh quang ĐC 7T 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + KẾT QUẢ - Hóa mô miễn dịch CD31 Kết luận: Xử lý MPS và LPS dẫn đến: CD31 biểu hiện suy giảm ở lô thí nghiệm trong giai đoạn 7 tuần Ánh sáng trắng Ánh sáng huỳnh quang Hoechst Hoechst CD31 CD31 Merge Merge ĐC 7T 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + KẾT QUẢ - Chu kỳ tế bào Kết luận: có sự khác biệt chỉ số apoptosis giữa lô đối chứng, 5 tuần, 7 tuần so với 3 tuần (p<0,05) Giai đoạn tăng sinh của tế bào cũng khác biệt giữa mốc 3 tuần và 5 tuần. $ MPS và LPS tác động làm thay đổi chu kỳ tế bào trong tủy xương -010 000 010 020 030 040 050 060 070 080 090 100 Đối chứng 3 Tuần 5 tuần 7 tuần G0/G1 S-G2-M APOP Biểu đồ chu kỳ tế bào qua các giai đoạn * ** ** 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + KẾT QUẢ !  Kết luận: Sử dụng kết hợp Methylprednisolone và Lipopolysaccharide có thể tạo được mô hình chuột hoại tử vô mạch chỏm xương đùi dựa trên các tiêu chí đánh giá: Tăng trọng lượng cơ thể Xuất hiện sự hoại tử tế bào xương ở chỏm xương đùi Biểu hiện sự xơ hóa sụn vá mất tế bào sụn. Thay đổi mức độ biểu hiện yếu tố tạo mạch VEGF và CD31. Thay đổi trong chu kỳ tế bào tủy xương đặc trưng bởi sự tăng apoptosis. 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Hướng điều trị -  Ngăn chặn hoặt động của MMPs -  Tăng thể tích vùng space joint giúp các xương không cọ sát vào nhau $ giảm đau -  Inhibitor của các chất trung gian gây viêm $  Những phương pháp này chỉ có khả năng giảm sự tiến triển của bệnh và giảm đau, không có vai trò tái tạo và làm lành 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn + Hướng điều trị 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn Các chiến lược ứng dụng tế bào – tế bào gốc trong điều trị bệnh tim mạch Tế bào gốc nuôi cấy in vitro Tế bào gốc nuôi cấy đã biệt hóa Kích thích tế bào gốc nội sinh Tế bào – tế bào gốc tươi 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn 10/10/17 TS. Vũ Bích Ngọc- ngocvu@sci.edu.vn

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfbai_giang_mo_hinh_dong_vat_trong_nghien_cuu_benh_ve_khop.pdf