Lựa chọn phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis aeruginosa

76 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP THÍCH HỢP CHO TẢO Microcystis aeruginosa SELECTION OF SUITABLE ISOLATION METHOD FOR THE MICROALGAE Microcystis aeruginosa Nguyễn Thị Thúy1, Lê Minh Hoàng1, Trương Thị Bích Hồng1 Ngày nhận bài: 14/6/2016; Ngày phản biện thông qua: 11/10/2016; Ngày duyệt đăng: 10/3/2017 TÓM TẮT Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm để xác định phương pháp phân lập thích hợp cho tảo Microcystis aeruginosa. Thí nghiệm được thực hiện với 2 phương pháp phân lập khác nhau: phương pháp pha loãng và nuôi cấy trên môi trường agar với thành phần dinh dưỡng B12, cường độ ánh sáng 2.000 lux, nhiệt độ 25 ºC, chu kỳ quang 12 sáng:12 tối. Kết quả cho thấy, sau 16 ngày thí nghiệm, tảo Microcystis aeruginosa đạt thuần chủng 100 % ở phương pháp pha loãng với tỉ lệ pha loãng 10-5, thậm chí, ở tỉ lệ pha loãng 10-4, độ thuần chủng cũng đạt 99 %. Trong khi đó, tảo Microcystis aeruginosa phân lập trong môi trường agar đạt độ thuần chủng 100 % sau khi tiến hành phân lập lại nhiều lần. Thời gian tiến hành phân lập trên môi trường agar cũng lâu hơn so với phương pháp pha loãng. Như vậy, phương pháp pha loãng được xem là phù hợp hơn để phân lập Microcystis aeruginosa trong nghiên cứu này. Từ khóa: agar, Microcystis aeruginosa, B12, phương pháp phân lập ABSTRACT The objectives of the study were to determine the suitable isolation method for Microcystis aeruginosa. Experiments were performed in two different isolation methods: diluted method and culturing algae on the agar medium, with culture condition of nutrient medium B12, light intensity of 2,000 lux, temperature of 25oC, light cycle of (12 light: 12 dark). After 16 days, the results showed that the best purifi cation of Microcystis aeruginosa was in the diluted method which reached at 100% and 99% at the dilution ratio of 10-5 and 10-4. After re-isolating many times, the purifi cation level of Microcystis aeruginosa was still at 100%. Moreover, the time needed to isolate was also longer than that of diluted method. In conclusion, it can be suggested that the best isolation method for Microcystis aeruginosa was diluted method applied in this study. Keywords: agar, Microcystis aeruginosa, B12, isolated method 1 Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nước hồ, ao thì loài Microcystis aeruginosa là loài bắt gặp thường xuyên nhất. Loài M. aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vòng có tên gọi là microcystin(MC) [5], [13]. Độc tố cũng gây ảnh hưởng xấu lên hai loại protein serine và threonin phosphatases [7], [8], [9]. Với đặc điểm là tập đoàn bao gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- 7 µm và mỗi tế bào đều chứa một không bào khí. Chính sự tập hợp của hàng nghìn không bào khí định vị trong vô số Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 77 các tế bào này giúp chúng nổi trên mặt nước và thu nhận được nguồn ánh sáng mặt trời, thông qua quá trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục tạo nên váng xanh trên mặt nước [10] . Trên thế giới cũng như ở nước ta đã có một số phương pháp phân lập giống tảo thuần chủng (Hilary Belcher and Erica Swale (1982) [11] , Nguyễn Thị Hương, 2001 [3], Các phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch, nhặt tế bào bằng micropipet, hiện đang được sử dụng phổ biến để phân lập các loài tảo. Tuy nhiên, mỗi loài tảo phù hợp với các phương pháp khác nhau. Theo Hoàng Thị Bích Mai [1] phương pháp pha loãng phù hợp để phân lập Nitzschia longissima nhưng loài tảo Chlorella sp lại phát triển tốt nhất trên môi trường thạch agar. Cho đến nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu đầy đủ về phân lập loài tảo M. aeruginosa. các nhà khoa học mới chỉ phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch agar [12]. Các phương pháp khác như nhặt tế bào, phương pháp pha loãng chưa được nói đến. Do đó, để lựa chọn được phương pháp phân lập phù hợp cho loài tảo M. aeruginosa thì việc nghiên cứu phương pháp phân lập thích hợp cho tảo M. aeruginosa được chúng tôi thực hiện. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 1.1. Đối tượng nghiên cứu Ngành Cyanobaeteria Lớp Cyanophyceae Bộ Chroococcales Họ Microcystaceae Chi Microcystis Loài Microcystis aeruginosa 1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng Norad - Viện Nuôi trồng Thủy sản. 1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2015 đến tháng 8/2015. 2. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm - Nguồn nước: nước cất. - Dụng cụ thu mẫu: lưới vớt thực vật nổi, động vật nổi, chai nhựa và thùng xốp đựng mẫu. 2.1. Môi trường nuôi tảo Bảng 1. Môi trường dinh dưỡng B12 [12] Các chất dinh dưỡng Nồng độ (mg/l) NaNO3 100 mg K2HPO4 10 mg MgSO4.7H2O 75mg CaCl2.2H2O 40mg Na2CO3 20mg Ferric citrate 6mg Disodium EDTA. 2H2O 1mg VTM Nồng độ (ml/l) V itamin B12 0,1ml 2.2. Vệ sinh các dụng cụ nuôi Cho nước cất và môi trường dinh dưỡng (trừ VTM) vào trong bình tam giác 1000 mL, điều chỉnh pH = 9 (bằng HCl và KOH). Các dụng cụ như ống nghiệm, hộp lồng, bình tam giác, ống đong, pipet, que cấy, bông gòn, môi trường dinh dưỡng, được tiệt trùng bằng máy Autoclarve ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1.5 at trong thời gian 30 phút. Để nhiệt độ xuống thấp hơn 80 0C lấy các dụng cụ ra. Riêng môi trường dinh dưỡng sau khi lấy ra, để ở nhiệt độ phòng tảo (25 0C) trong 20 phút rồi cho VTM vào lắc đều. 2.3. Phương pháp thu mẫu và nhân giống tảo để bố trí phân lập Nguồn tảo hỗn hợp được thu từ một số ao nuôi cá tại Ninh Phụng - Ninh Hòa - Khánh Hòa bằng lưới vớt thực vật nổi (Juday gas 98). Sau đó lọc qua lưới vớt động vật nổi (Juday gas 68) và cho vào chai nhựa 500 ml. Mẫu tảo được để trong các thùng xốp, ướp đá lạnh và được vận chuyển về phòng thí nghiệm. Để lắng trong vòng 2 tiếng, dùng pipet hút lớp dịch nổi lên trên bề mặt đó chính là vi khuẩn lam. Nhân sinh khối giống trong các bình tam giác 250 ml với môi trường B12, nhiệt độ 250C, cường độ chiếu sáng 2,000 lux, với chu kỳ quang 12 sáng: 12 tối trước khi đưa vào thí nghiệm. 2.4. Phương pháp phân loại Quan sát mẫu dưới kính hiển vi Olympus CX41 có gắn máy ghi hình kỹ thuật số Olympus 78 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 để quan sát và chụp ảnh tảo. Song song với ảnh chụp, những chi tiết của tảo cũng được vẽ lại. Căn cứ vào quan sát trực tiếp, hình ảnh, các đặc điểm, hình thái và kích thước tế bào để phân loại. Bằng phương pháp hình thái so sánh, dựa vào khóa phân loại để phân loại đến loài. Chúng tôi sử dụng các tài liệu chính sau: - Phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam [4]. - Phân loại thực vật học bậc thấp [6]. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Phương pháp phân lập tảo 3.1.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch agar Pha 0,4g agar với 100 ml nước cất trong bình tam giác 500 ml,. Sau đó, đổ vào trong bình nút mài 500 ml có màu và Autoclarve ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 at trong thời gian 30 phút. Để nhiệt độ xuống 80 0C lấy bình ra để ở nhiệt độ phòng tảo (250C) trong 20 phút, cho môi trường dinh dưỡng vào lắc đều đồng thời đổ vào đĩa petri (10 ml/đĩa). Sau 12 giờ, khi thạch đông, nguội dùng que cấy tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ, chờ nguội rồi dùng que cấy lấy tảo và cấy lên bề mặt thạch agar. Đậy hộp lồng lại, cuốn mép đĩa peptri bằng parafi n và đặt dưới ánh sáng đèn neon (thời gian chiếu sáng 12 giờ sáng: 12 giờ tối), cường độ chiếu sáng 2,000 lux, nhiệt độ 25 0C. Sau 10 - 12 ngày nuôi cấy thấy xuất hiện các quần lạc tảo màu xanh có hình dạng khác nhau trên bề mặt thạch. Dùng que cấy (sau khi đã hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội) lấy mẫu từ các quần lạc và quan sát trên kính hiển vi để kiểm tra độ thuần chủng. Cấy chuyền sang các đĩa thạch khác đến khi thu được mẫu thuần chủng 100%. 3.1.2. Phân lập bằng phương pháp pha loãng Chuẩn bị 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước cất. Sau đó, Autoclarve ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 at trong thời gian 30 phút. Để nhiệt độ xuống 80 0C lấy ống nghiệm ra và để trong phòng thí nghiệm nuôi tảo ở nhiệt độ 25 0C. Sau 24h ống nghiệm và nước cất đã nguội, cho môi trường dinh dưỡng vào lắc đều. Tiến hành ghi nhãn từ 10-1 đến 10-10 để chỉ số lần pha loãng. Dùng pipet hút 1ml tảo mẫu thu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang ống nghiệm đầu tiên 10-1 và lắc nhẹ nhàng cho đều. Tiếp tục hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 sang ống nghiệm 10-2 và lắc nhẹ. Lặp lại như vậy cho đến ống nghiệm thứ 10 (10-10). Các ống nghiệm được đặt trên giá và nuôi trong điều kiện: thời gian chiếu sáng: 12 giờ sáng: 12 giờ tối, nhiệt độ: 250C, cường độ chiếu sáng: 2,000 lux. 3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 3.2.1. Xác định mật độ tế bào Việc xác định số lượng tế bào tảo được tiến hành bằng cách đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu Neubacur’s Hemacytometer của Đức, buồng đếm có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vông nhỏ có diện tích 0,0025 mm2 và độ sâu buồng đếm là 0,1 mm. 3.2.2. Công thức tính Theo Mucklow, số lượng tb/mL = (X x 1000 mm3)/(Y x W2 x d) Trong đó: X = số lượng tế bào được đếm Y = số lượng ô vuông nhỏ nhất được đếm d = độ dày của lớp nước trong buồng đếm W = cạnh của một ô vuông W2 x d: Thể tích của dung dịch trong một ô vuông nhỏ nhất 3.2.3. Xác định một số yếu tố môi trường a. Đo cường độ ánh sáng: Được đo bằng máy đo Ana-F1 của Nhật. b. Đo pH: Được đo bằng máy đo pH 744, hiệu Metrohm. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Thu mẫu, phân lập 1 loài thuộc chi Microcystis từ ao cá Ninh Phụng - Ninh Hòa Sau khi thu mẫu từ một số ao nuôi cá tại Ninh Phụng - Ninh Hòa - Khánh Hòa về Phòng thí nghiệm Norad - Viện Nuôi trồng Thủy sản. Nhân sinh khối giống trong các bình tam giác 250ml Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 79 với môi trường B12, nhiệt độ 250C, cường độ chiếu sáng 2,000 lux, với chu kỳ quang (12:12) trước khi đưa vào thí nghiệm. 1.1. Phân loại loài Microcystis aeruginosa Dựa theo phân loại các tài liệu [4], [6] về các đặc điểm hình thái, kết hợp với kết quả chụp hình thái trên kính hiển vi quang học, chúng tôi xác định đây là loài Microcystis aeruginosa. Tế bào tảo Microcystis aeruginosa có đặc điểm: Tập đoàn có cấu tạo bất thường, các tế bào sắp xếp rải rác, bao nhầy, trong suốt, các tế bào tròn rộng, dạng hình cầu, đường kính 3 -7 µm. Tế bào có màu xanh lam, đều chứa không bào khí bên trong, thường sắp xếp dày đặc. Thường tạo thành váng xanh nổi trên mặt nước. Tuy nhiên trong mẫu còn rất nhiều loài tảo khác nhau do đó chúng tôi tiến hành phân lập tảo bằng phương pháp: nuôi cấy trên môi trường thạch agar và phương pháp pha loãng. Hình 1. Tảo Microcystis phát triển trong ao nuôi cá Ninh Phụng 1.2. Phân lập Microcystis aeruginosa bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch agar Sau 10 ngày phân lập, chúng tôi quan sát thấy xuất hiện các quần lạc có màu xanh mọc rải rác trên đĩa thạch. Dùng que cấy lấy các quần lạc tảo từ các đĩa petri và kiểm tra độ thuần chủng của tảo, tảo đạt độ thuần chủng không cao (70%), trong mẫu còn bắt gặp khá nhiều tế bào tảo khác. Sau 3 lần cấy chuyền lặp lại với tổng thời gian 30 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch agar chúng tôi đã thu được loài tảo M. aeruginosa có độ thuần chủng 100%. Bảng 2. Độ thuần chủng của M. aeruginosa (%) bằng phương pháp cấy trên môi trường thạch agar STT Phân lập trên môi trường thạch agar Thời gian nuôi cấy Độ thuần chủng 1 Đĩa peptri 1 10 ngày 70% 2 Cấy chuyền từ đĩa peptri 1 qua đĩa peptri 2 10 ngày 95% 3 Cấy chuyền từ đĩa peptri 2 qua đĩa peptri 3 10 ngày 100% Hình 2. Quần lạc tảo Microcystis aeruginosa mọc trên môi trường thạch agar 80 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 1.3. Phân lập Microcystis aeruginosa bằng phương pháp pha loãng Sau 16 ngày nuôi cấy tảo M. aeruginosa ở các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 đến 10-10, chúng tôi quan sát các ống nghiệm bằng mắt thường thấy dịch tảo có màu xanh lam, màu đặc trưng của tảo lam. Hình 4. Quần lạc tảo Microcystis aeruginosa thuần chủng (độ phóng đại 400x) So sánh với phương pháp pha loãng thì phương pháp nuôi cấy trên môi trường agar, tảo M. aeruginosa thu được tảo thuần chủng có thời gian lâu hơn (30 ngày). Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Hilary Belcher,1982 [11], khi ông cho rằng phương pháp phân lập bằng cách nuôi cấy trên môi trường agar chỉ phù hợp với các loài tảo silic nước ngọt và tảo lục đơn bào (đặc biệt là các loài thuộc chi Chlorella). Nghiên cứu của Hoàng Thị Bích Mai, 1995 [2] đã kết luận rằng: khi phân lập, lưu giữ cũng như nuôi sinh khối tảo, chúng ta cần chú ý đến đặc điểm sinh thái của loài để chọn phương pháp phân lập phù hợp. Qua kết quả trên ta thấy, phương pháp pha loãng là phương pháp thích hợp hơn để phân lập tảo M. aeruginosa với độ thuần chủng cao 100% và độ pha loãng thấp 10-5. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong 2 phương pháp phân lập: phân lập bằng cách pha loãng và phân lập bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch, chúng tôi thấy phân lập theo phương pháp pha loãng là thích hợp hơn cho loài tảo Microcystis aeruginosa. Tảo M. aeruginosa đạt thuần chủng 100 % từ độ pha loãng 10-5. Cần nghiên cứu sâu như: tách chiết và phân loại độc tố của vi khuẩn lam, cụ thể là loài M. aeruginosa trên máy sắc ký lỏng cao áp và thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của tảo M. aeruginosa trên động vật thủy sản. Hình 3. Tảo Microcystis aeruginosa phát triển ở phương pháp pha loãng Khi đưa các mẫu tảo ở các độ pha loãng khác nhau lên quan sát, chúng tôi đã đếm mật độ tảo M. aeruginosa và thu được kết quả như sau: - Độ pha loãng 10-1: sau 5 ngày quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác; - Độ pha loãng10-2: sau 7 ngày quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác; - Độ pha loãng10-3: sau 16 ngày độ thuần chủng của M. aeruginosa đạt 80%; - Độ pha loãng10-4: sau 16 ngày độ thuần chủng của M. aeruginosa đạt 99%; - Độ pha loãng 10-5: sau 16 ngày độ thuần chủng của M. aeruginosa đạt 100%; Kết quả thu được M. aeruginosa thuần chủng 100% từ đĩa có độ pha loãng 10-5 đến 10-10. Ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4, độ thuần chủng cũng đã đạt 99% sau 16 ngày nuôi cấy. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Hoàng Thị Bích Mai, 2008-2010. Phân lập, lưu giữ và nhân sinh khối hai loài vi tảo có lợi (tảo lục & silic) trong một số ao nuôi tôm thuộc vùng nuôi tôm sinh thái tại huyện Năm Căn, Ngọc Hiển tỉnh Cà Mau. Đề tài cấp Bộ. Mã số: B2008-13-35. 2. Hoàng Thị Bích Mai, 1995. Sinh s ản, sinh trưởng và cơ sở khoa học của quy trình nuôi thu sinh khối tảo Silic (Skeletonema costatum Greville Cleve, Chaetoceros sp.) làm thức ăn cho ấu trùng tôm Sú. Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang. 3. Nguyễn Thị Hương, 2001. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo Chaetoceros calcistrans Paulsen, 1905. Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang. 4. Dương Đức Tiến, 1996. Phân loại Vi khuẩn lam ở Việt Nam. NXB Nông Nghiệp. 5. Dương Đức Tiến và ctv, 2002. Bảo vệ nguồn gen vi tảo (microalgae) đặc hữu quý hiếm ở hồ Hoà n Kiếm - Hà Nội. Báo cáo khoa học trong chương trình tài trợ bảo vệ môi trường và gìn giữ di sản văn hoá - Công ty Ford Motor. 6. Dương Đức Tiến và Võ Văn Chí, 1978. Phân loại Thực vật học bậc thấp. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp: 87-95. Tiếng Anh 7. Carmichael. W, 1992. A Status Report on Planktonic Cyanobacter ia (Blue-Green Algae) and their Toxins. EPA/600/R-92/079. United States Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. 8. Chorus I., Bartram J., 1999. Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences, monitoring and management. Published by E & FN Spon on behalf of the World Health Organization. 9. Falconer I., Buckley TH., 1989. Tumor promotion by Microcystis sp., a blue-green algae occurring in w ater supplies. Medical Journal of Australia, 150: 351-352. 10. Gibson MT., Barrett PRF and Ridge I Welch IM, 1990. Barley straw as an inhibitor of algal growth II: Laboratory studies. J. Ap pl. Phycol. 2: 241-248. 11. Hilary Belcher, Erica Swale, 1982. Culturing algae, a guide for shool and colleges. Culture collection of algae and protozoa. Terrestrial Ecollogy institute, Cambridge. 12. Naka gawa M. Y., O.Yagi Takamura, 1987. Isolation of the slime from a cyanobacterium, microcystis aruginosa. K-3A. Agric. Biol. Chem. 51: 329-337. 13. Song L. R., H.Pan N.Q.Gan, 2005. Toxic Microcystis blooms and microcystin composition in eutrophic lakes in China. Algal Culture Collection and the Environment: 89-108.