Kỹ thuật di truyền

1KỸ THUẬT DI TRUYỀN 2QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU GENE CÔ LẬP GENE Tách chiêt DNA, RNA Phân tích định tính, định lượng Tạo dòng PCR, RT-PCR THU NHẬN GENE Giải trình tự Các phương pháp in silico XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GENE TÌM HIỂU CHỨC NĂNG CỦA GENE Northern blot Southern blot Gây tạo đột biến Phiên mã – dịch mã in vitro ... ỨNG DỤNG Tổng hợp nhân tạo Mục tiêu : Hiểu rõ cấu trúc và chức năng của gene để ứng dụng vào các lĩnh vực khoa học và đời sống Điện di Đo OD Sử dụng các enzyme, vector 3NỘI DUNG 1. Thu hồi nucleic acid 2. Phân tích định tính và định lượng nucleic acid 3. Sử dụng các enzyme thông dụng trong sinh học phân tử 4. Lai phân tử 5. Tạo dòng 6. PCR 7. Giải trình tự nucleic acid 8. Biến đổi vật liệu di truyền và chuyển vật liệu di truyền đã biến đổi vào tế bào 4THU HỒI NUCLEIC ACID 1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT - Tách chiết DNA - Tách chiết RNA 2. PHƯƠNG PHÁP LY TÂM - Ly tâm phân đoạn - Ly tâm đẳng tỷ trọng – Thu nhận nucleic acid tinh sạch 3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Thu mRNA 5TÁCH CHIẾT DNA & RNA DNA RNA Thiocyanate 1. Phá màng tế bào, màng nhân Chất tẩy (SDS) guanidinium + siêu âm, .. LiCl, Urea, .. + cơ học, .. 2. Loại protein Phenol pH8 : Phenol pH4 : Chloroform:IAA Chloroform:IAA Khác Khác 3. Thu hồi nucleic acid : Tủa Ethanol tuyệt đối Ethanol tuyệt đối Isopropanol, .. Isopropanol, .. Boom Hấp phụ trên silica Hấp phụ trên silica Lọc Thu trên màng lọc Thu trên màng lọc 6PHÁ MÀNG SINH HỌC BẰNG CHẤT TẨY Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn. Chất tẩy, là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng 7LY TÂM PHÂN ĐOẠN Ly tâm phân đọan (a) và phân đoạn vùng (b) phân tách các phần tử trong hỗn hợp dựa trên khối lượng của chúng. Thời gian và lực ly tâm được xác định cho từng nhóm phần tử. Dung dịch ly tâm có tỷ trọng thấp hơn các phần tử cần phân tách 8LY TÂM ĐẲNG TỶ TRỌNG Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách các phần tử trong hỗn hợp dựa trên tỷ trọng của chúng. Thời gian và lực ly tâm là chung cho các nhóm phần tử. Dung dịch ly tâm có tỷ trọng với giá trị đi từ thấp hơn đến cao hơn tỷ trọng của các phần tử cần phân tách 9THU HỒI NUCLEIC ACID, PHAGE SAU LY TÂM ĐẲNG TỶ TRỌNG 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Sắc ký lọc gel Sắc ký trao đổi ion Sắc ký ái lực KT-KN 11 THU HỒI mRNA BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC 12 CÂU HỎI – PHẦN 1 1. Những khác biệt trong phương pháp tách chiết-tinh sạch DNA và RNA, vì sao lại có những khác biệt đó ? 2. Phương pháp tủa, Boom có những ưu nhược điểm gì ? 3. Khác biệt giữa ly tâm phân đoạn và ly tâm đẳng tỷ trọng ? Ứng dụng của từng loại ly tâm ? 4. Phương pháp tách chiết-tinh sạch DNA plasmid có gì khác với tách chiết-tinh sạch DNA bộ gene ? 13 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID 1. ĐIỆN DI - Gel agarose - Gel polyacrylamide 2. QUANG PHỔ KẾ : Đo mật độ quang (OD – Optical density) 14 ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE - Điện di theo phương nằm ngang - Giá thể là gel agarose - Phát hiện với màu nhuộm ethidium bromide, ...… phát huỳnh quang dưới đèn tử ngoại - Khả năng phân giải trung bình, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là nồng độ agarose 15 ĐIỆN DI TRONG TRƯỜNG XUNG (PULSED-FIELD ELECTROPHORESIS) 16 ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE - Điện di theo phương thẳng đứng - Giá thể là gel polyacrylamide - Phát hiện với màu nhuộm Coomassie blue, nhuộm bạc, phát hiện trên phim tín hiệu đồng vị phóng xạ - Khả năng phân giải cao, phân biệt được những trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide 17 ĐIỆN DI PROTEIN TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE 18 ĐIỆN DI 2 CHIỀU PROTEIN TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE 19 KỸ THUẬT RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM – ĐA HÌNH KÍCH THƯỚC CÁC TRÌNH TỰ CẮT GIỚI HẠN 20 VNTR (VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS) Phân tích VNTR để nhận biết tính đa hình di truyền ở cá thể. Sử dụng mẫu dò kết hợp với RE để phân tích VNTR 21 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRONG NGHIÊN CỨU PHẢ HỆ Ví dụ về việc sử dụng PCR và điện di trong xác định phả hệ. Đây là phả hệ của Sa hoàng, vợ, 3 con, bác sĩ gia đình và các người hầu 22 KỸ THUẬT “ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY : PHÁT HIỆN NHÂN TỐ TRANS Các phân đọan protein được ủ với một đoạn DNA đã được đánh dấu phóng xạ và có mang một trình tự CIS. Các tổ hợp trên sau đó sẽ được phân tích bằng điện di không biến tính (đối với protein). Các phân đọan DNA không gắn protein sẽ di chuyển xa hơn các phân đọan trong đó trình tự CIS liên kết với protein (7, 8 trong hình). Như vậy các phân đọan protein tương ứng với các tổ hợp 7 và 8 sẽ được xác định. 23 CÂU HỎI - PHẦN 2 1. Các điểm khác biệt trong phương pháp tiến hành điện di trên gel agarose và gel polyacrylamide 2. Các ứng dụng của điện di trên gel agarose, điện di trên gel polyacrylamide 3. Phương pháp đo mật độ quang (OD) : - Nguyên lý và cách xác định hàm lượng nucleic acid - Nguyên lý và cách xác định độ sạch của nucleic acid 4. Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 5. Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) 6. Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp Electrophoretic Mobility Shift Assay 24 SỬ DỤNG CÁC ENZYME THÔNG DỤNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ 1. ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME) 2. POLYMERASE (DNA, RNA) 3. NUCLEASE (DNase, RNase) 4. LIGASE 25 MỘT SỐ ENZYME GIỚI HẠN (RE) 26 MỘT SỐ ENZYME GIỚI HẠN (RE) 27 CÁC ENDO- & EXONUCLEASE Loại enzyme Cơ chất Vị trí nhận biết và cắt trên DNA, RNA 28 LẬP BẢN ĐỒ CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION MAP) Trình tự DNA cần nghiên cứu được cắt với nhiều RE, theo các tổ hợp cắt đơn, cắt phối hợp. Các sản phẩm cắt sau đó được phân tích bằng điện di và xử lý với các phần mềm vi tính để xây dựng bản đồ cắt giới hạn. 29 KỸ THUẬT DNASE I FOOTPRINTING : XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CIS TRÊN DNA Một đọan DNA được đánh dấu phóng xạ ở một đầu 5’ và được ủ chung với các phân đoạn protein được xem là có tương tác với DNA này. Sau đó, tổ hợp được mang phân cắt bằng enzyme Dnase I. Nơi nào trên DNA có gắn protein, nơi đó sẽ được bảo vệ khỏi sự phân cắt này, và hình thành “dấu chân” (giếng 9-12 và O trên hình). Đó chính là trình tự CIS. Kích thước của trình tự có thể được nhận biết khi so sánh với thang DNA (M trên hình) 30 CÂU HỎI – PHẦN 3 1. Cách xây dựng bản đồ cắt hạn chế (restriction map) 2. Cách tiến hành phương pháp DNase Footprinting, ứng dụng của phương pháp 3. Ứng dụng của các nuclease : Nuclease S1, DNase I, RNase A, RNase H, 4. Ứng dụng của các polymerase : reverse transcriptase, DNA polymerase, SP6 RNA polymerase, Taq polymerase, DNA polymerase I, Terminal transferase 5. Ứng dụng của T4 polynucleotide kinase, của alkaline phosphatase LAI PHÂN TỬ 1. ĐÁNH DẤU MẪU DÒ DNA, RNA, OLIGONUCLEOTIDE 2. CÁC KIỂU LAI W Lai trong pha lỏng W Lai trên pha rắn (Southern, Northern, dot blot) W Lai tại chỗ 3. ỨNG DỤNG CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC Có ái lực với anti- Digoxigenin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có ái lực với streptavidin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN Đánh dấu mẫu dò (probe) Ỉ Lai với trình tự mục tiêu Ỉ Phát hiện phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION W “Đục lỗ” trên 2 mạch của DNA bằng Dnase I W DNA polymerase I sử dụng haọt tính 5’-3’ exonuclease “gặm” mạch DNA theo chiều 5’-3’ W DNA polymerase I vừa thủy phân vừa tổng hợp mạch mới bù vào lỗ trống với các dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP đánh dấu) W Kết quả là probe được đánh dấu PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING W Biến tính mạch đôi DNA W Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu nhiên trên 2 mạch 64 = 1296 primers W DNA polymerase tổng hợp bù vào chỗ trống bằng các dNTP trong đó có nucleotide đánh dấu W Kết quả là probe đánh dấu PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU OLIGONUCLEOTIDE PHẢN ỨNG PHOSPHATASE PHẢN ỨNG KINASE PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU OLIGONUCLEOTIDE SỬ DỤNG TERMINAL TRANSFERASE TỔNG HỢP MẪU DÒ RNA BẰNG PHIÊN Mà IN VITRO W Trình tự sẽ dùng làm probe được tạo dòng vào vector biểu hiện W Tùy mạch muốn dùng làm probe sẽ sử dụng promoter tương ứng W RNA polymerase nhận biết promoter đặc hiệu, gắn vào và tổng hợp RNA W Nucleotide tự do dùng trong quá trình phiên mã có mang một phần nucleotide đánh dấu W Kết quả là mẫu dò RNA đánh dấu (riboprobe) TỔNG HỢP MẪU DÒ RNA BẰNG PCR VÀ PHIÊN Mà IN VITRO gene A T7 promoterPCR Phiên mã in vitro với T7 RNA polymerase Mẫu dò RNA Thay vì tạo dòng thì sử dụng PCR để gắn thêm trình tự promoter phù hợp Quá trình tiếp theo giống như tạo dòng SOUTHERN BLOT SOUTHERN BLOT (tiếp) Tách chiết & cắt DNA bằng enzyme giới hạn Điện di Chuyển lên màng lai Lai và phát hiện phân tử lai Biến tính DNA Tiền lai LAI TRÊN PHA RẮN & PHÁT HIỆN PHÂN TỬ LAI BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ Cố định DNA lên màng lai Lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ Rửa màng lai Thực hiện phóng xạ tự ghi SOUTHERN - NORTHERN BLOT KẾT QUẢ NORTHERN BLOT Ghi chú : UN : Mẫu chứng khôn cảm ứng, 48h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 48 giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 96 giờ. Mẫu dò đồng vị phóng xạ DOT BLOT Tách chiết DNA, RNA Ỉ Biến tính (nếu có) Ỉ Đặt lên màng lai Ỉ Tiền lai Ỉ Lai với mẫu dò (trình tự đã biết) Ỉ Phát hiện phân tử lai Dùng để phát hiện, hoặc định lượng tương đối khi so với thang hàm lượng đã biết Phương pháp cải biên là reverse dot blot. Trình tự đã biết được cố định trên giá thể còn trình tự cần biết (mục tiêu) được đánh dấu WESTERN BLOT Điện di trên gel polyacrylamide Chuyển lên màng lai Liên kết với kháng thể 1 & 2. Rửa để loại kháng thể thừa Phát hiện màu thông qua phản ứng enzyme CẮT MẪU CHO LAI “TẠI CHỖ” (IN SITU HYBRIDIZATION) KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ LAI “TẠI CHỖ” TRÊN PHÔI Cố định mẫu (formol, đông lạnh) Ỉ Cắt lát mỏng (microtome) Ỉ Cố định trên lam kính Ỉ Xử lý mẫu trước khi lai Ỉ Tiền lai Ỉ Lai với mẫu dò đánh dấu hóa học hay đồng vị phóng xạ Ỉ Rửa Ỉ Phát hiện phân tử lai Ỉ Quan sát dưới kính hiển vi NGUYÊN TẮC CỦA MICROARRAY - Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy - Phiên mã ngược thành cDNA có đánh dấu huỳnh quang khác nhau - Trộn chung 2 loại cDNA đánh dấu - Rửa, loại các thành phần thừa - Đo cường độ phát huỳnh quang ở từng điểm : Điểm phát màu vàng : gene biểu hiện như nhau trong 2 lọai tế bào Điểm phát màu xanh : gene của tế bào nuôi trong glucose biểu hiện mạnh hơn Điểm phát màu đỏ : gene của tế bào nuôi trong ethanol biểu hiện mạnh hơn KẾT QUẢ MICROARRAY VÍ DỤ : PHÁT HIỆN BỆNH HỒNG CẦU HÌNH LIỀM BẰNG SOUTHERN BLOT - Tách DNA - Cắt bằng enzyme MstII - Chạy điện di - Lai với mẫu dò E-globin đánh dấu phóng xạ - Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi mẫu DNA bệnh dựa vào kích thước trình tự cho tín hiệu lai KỸ THUẬT “ĐI BỘ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ (CHROMOSOME WALKING) KẾT QUẢ RFLP TRONG NGHIÊN CỨU PHẢ HỆ CÂU HỎI PHẦN 4 1. Cách đánh dấu mẫu dò bằng đồng vị phóng xạ ? Bằng hóa học ? Ưu nhược điểm của từng loại tác nhân ? 2. Cách đánh dấu mẫu dò có bản chất là DNA, RNA, oligonucleotide 3. Southern blot z Northern blot z dot blot đuợc thực hiện như thế nào ? 4. Cho ví dụ về việc sử dụng reverse dot blot 5. Cách tiến hành Southern blot, Northern blot, dot blot 6. Ứng dụng của Southern blot, Northern blot, dot blot 7. Cách tiến hành và ứng dụng của phương pháp lai tại chỗ 8. Cách phát hiện phân tử lai với mẫu dò đồng vị phóng xạ ? Hóa học ? 9. Cách tiến hành phương pháp sử dụng microarray và ứng dụng của microarray 10. Kỹ thuật đi bộ trên nhiễm sắc thể : cách làm và ứng dụng TẠO DÒNG HAI CHIẾN LƯỢC TẠO DÒNG IN VIVO & IN VITRO NGUYÊN TẮC TẠO DÒNG (IN VIVO) CÁC BƯỚC TẠO DÒNG Chuẩn bị vector Chuẩn bị trình tự tạo dòng (insert) Tạo vector tái tổ hợp Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Chọn lọc dòng cần tìm Xử lý enzyme tạo đầu so le, đầu bằng Nối vector/ insert W Hóa biến nạp W Điện biến nạp W Biến nạp bằng siêu âm, … W DNA : tách chiết DNA bộ gene, PCR, tổng hợp W RNA : tách chiết RNA và RT, RT- PCR W Lai với mẫu dò đặc hiệu W PCR với mồi đặc hiệu W Sử dụng kháng thể đặc hiệu CHUẨN BỊ cDNA ĐỂ TẠO DÒNG mRNA Ỉ cDNA Ỉ gắn thêm các linker có mang trình tự nhận biết của RE Ỉ Cắt bằng RE tương ứng tạo đầu so le XỬ LÝ ĐOẠN GẮN CHÈN CÓ ĐẦU BẰNG W Gắn thêm các linkers mang trình tự nhận biết của RE W Vector có chứa các trình tự nhận biết của RE tương ứng TẠO DÒNG BẰNG PCR W Mồi (primer) dùng trong phản ứng PCR có mang trình tự nhận biết của RE W Sản phẩm PCR được cắt bằng RE phù hợp tạo đầu so le W Nối với vector đã xử lý với cùng loại RE TẠO DÒNG TRONG PLASMID - Tạo plasmid tái tổ hợp - Biến nạp tế bào E. coli : ủ chung với plasmid TTH có hiện diện CaCl2 ; tạo sốc nhiệt - Nuôi trên đĩa thạch có ampicillin để chọn dòng vi khuẩn có thu nhận plasmid TTH - Thu nhận các dòng tế bào có chứa plamid TTH pBR322 W Plasmid thế hệ thứ nhất W Plasmid thế hệ thứ hai : pBR322 W Plasmid thế hệ thứ ba : pUC, pSP, Bluescript, .. PLASMID pUC18/19 TẠO DÒNG TRONG PLASMID pUC BỘ GENE PHAGE VÀ SỰ TỰ RÁP TẠO DÒNG VỚI VECTOR LÀ PHAGE Thu nhận DNA phage Ỉ Loại bỏ trình tự không cần cho sự đóng gói Ỉ Gắn trình tự cần tạo dòng vào thay cho trình tự loại bỏ Ỉ Đóng gói vào vỏ bọc của phage Ỉ Đem xâm nhiễm tế bào vi khuẩn để chuyển trình tự cần tạo dòng vào vi khuẩn TẠO DÒNG cDNA TRONG PHAGE O Đem dung dịch phage tái tổ hợp trải trên lớp tế bào vi khuẩn phủ đầy mặt thạch Ỉ tạo đĩa ly giải TẠO ĐĨA LY GIẢI (PLAQUE ASSAY) Bề mặt thạch phủ một lớp tế bào E. coli Ỉ Thêm huyền phù virus tái tổ hợp Ỉ Phủ tiếp lên trên một lớp agar mềm Ỉ Ủ Ỉ Mỗi đĩa ly giải tương ứng với vùng ly giải do một phần tử virus gây ra PHÁT HIỆN ĐĨA LY GIẢI CÓ CHỨA DÒNG CẦN TÌM Hộp thạch với các đĩa ly giải È Aùp màng lai lên mặt thạch È Ủ màng lai trong dung dịch kiềm để ly giải phage giải phóng DNA phage È Tiền lai - Lai với mẫu dò È Phát hiện phân tử lai TỔNG HỢP M13 MẠCH ĐÔI COSMID VECTOR PHC79 TẠO DÒNG BẰNG VECTOR COSMID TẠO NGÂN HÀNG BỘ GENE TẠO DÒNG VỚI BAC (NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO CỦA VI KHUẨN TẠO DÒNG TRONG VECTOR BIỂU HIỆN W Vector biểu hiện là vector có mang các promoter cho phép phiên mã trình tự gắn chèn (insert) W Sử dụng RNA polymerase phù hợp với promoter để phiên mã mạch muốn sử dụng làm khuôn PHIÊN Mà & DỊCH Mà TRÌNH TỰ TẠO DÒNG TẠO DÒNG BẰNG VECTOR “CON THOI” Mục tiêu : Nhân bản và chọn lọc trình tự gắn chèn (insert) trong 2 loại tế bào chủ khác nhau PHƯƠNG PHÁP IN Dùng để tạo màng lai dùng phát hiện dòng cần tìm Dùng để chọn lọc dòng cần tìm trên nhiều loại môi trường khác nhau CHỌN DÒNG TÁI TỔ HỢP Chọn các dòng có mang vector tái tổ hợp dựa trên đặc tính kháng 2 kháng sinh của vector pBR322 CHỌN DÒNG TÁI TỔ HỢP Chọn dòng tái tổ hợp dựa trên sự kháng 1 hay 2 kháng sinh của vi khuẩn sau biến nạp(ampicilli n và tetracyclin) Chọn dòng tái tổ hợp dựa trên màu khuẩn lạc (xanh/trắng) LAI TRÊN KHUẨN LẠC - CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG LAI PHÂN TỬ Mẫu dò được suy ra từ trình tự amino acid dựa theo mã di truyền, được tổng hợp và đánh dấu, sau đó đem lai với màng lai có mang cá trình tự DNA đã được cố định CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG KHÁNG THỂ W Tạo một ngân hàng biểu hiện. W Cảm ứng cho các protein biểu hiện W Phát hiện dòng cần tìm trong ngân hàng biểu hiện với kháng thể đánh dấu và đặc hiệu cho protein biểu hiện CÂU HỎI PHẦN 5 1. Vector dùng để tạo dòng cần có những đặc điểm gì 2. Có những loại vector nào ? Ưu nhược điểm của các loại ấy ? Ứng dụng của chúng ? 3. Đặc điểm của các vector plasmid pUC, pSP, Bluescript 4. Mô tả cách sử dụng vector là phage 5. Vector biểu hiện dùng để làm gì ? Cho ví dụ 6. Vcetor con thoi dùng để làm gì ? Cho ví dụ 7. Mô tả cách tạo ngân hàng bộ gene 8. Mô tả cách tạo ngân hàng cDNA 9. Cách phát hiện dòng cần tìm bằng kháng thể 10.Cách phát hiện dòng cần tìm bằng mẫu dò nucleic acid 11.Cách biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR 1. Primer (mồi) Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2) Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại. 2. DNA bản mẫu (template) Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ..), heparin, ..) 3. Nồng độ MgCl2 Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme 4. dNTP Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế 5. Enzyme Được chọn tùy mục đích sử dụng : W Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thông dụng nhất, hoạt tính polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease Stoffel DNA polymerase : tính chịu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng € multiplex PCR Taq và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR W Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chịu nhiệt rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease € tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu bằng” W Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và 3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong cycle sequencing W Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vừa có chức năng polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT) € dùng trong phản ưng RT-PCR W UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chịu nhiệt rất cao, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease € tính trung thực rất cao CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp) 5. Chương trình PCR : W Nhiệt độ : biến tính – 94-95qC ; lai < Tm của các primer ~ 5qC ; kéo dài - 72qC W Thời gian của từng chu kỳ tùy thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm W Số lượng chu kỳ thường  40 Ví dụ : 1 chu kỳ - 95qC – 5‘ 35 chu kỳ – 94qC – 30” 55qC – 30” 72qC – 45” 1 chu kỳ – 72qC – 10’ 6. Thiết bị : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate 96 giếng, (2) các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, (3) block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR. 7. Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọc CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp) NHỮNG HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCR – CÁCH KHẮÊC PHỤC 1. Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh Ỵ Phân chia khu vực thí nghiệm, sử dụng đầu tip có phin lọc, găng tay thay thường xuyên, chiếu tia UV khu vực thí nghiệm, sử dụng hệ thống dUTP-ung, 2. Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp Ỵ Lặp lại phản ứng PCR nếu cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính trung thực cao như Pfu, DeepVent, UlTma polymerase. 3. Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác Ỵ Kỹ thuật viên cần được đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha sẳn (kit) đã được chuẩn hóa 4. Thiết bị đắt tiền MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR 1. PCR : sử dụng 1 cặp mồi ; sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di 2. Nested / Semi-nested PCR : sử dụng 1 cặp mồi “ngoài” và 1 mồi/1 cặp mồi “trong” để tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng PCR 3. Multiplex PCR : sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR để phát hiện đồng thời nhiều trình tự DNA của 1 tác nhân (A) hay nhiều tác nhân (B) (A) (B) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR (tiếp) 4. AP-PCR (Arbitrary Primed)/RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) : sử dụng tổ hợp các primer “ngẫu nhiên” để xác dịnh “dấu ấn di truyền” của loài (1) (2) 5. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : nhân bản hai đầu mút 5’ và 3’ của 1 trình tự exon với 1 mồi đặc hiệu và 1 mồi “chung” 6. In situ PCR : thực hiện phản ứng PCR ngay trên mô/tế bào 7. PCR định lượng : định lượng sản phẩm PCR theo thời gian thực dựa trên mẫu dò phát hùynh quang AAAAAAAA TTTTTT AAAAA TTTTTTT RT-PCR Gồm 2 bước : 1. RT (Phiên mã ngược) : tạo cDNA 2. PCR : nhân bản cDNA Dùng để nhân bản RNA REAL-TIME PCR Dùng định lượng DNA hoặc RNA (real-time RT-PCR) Định lượng dựa trên số tín hiệu huỳnh quang/phản ứng mà máy đọc được Tác nhân đánh dấu thuộc hai nhóm : W Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidium bromide) sẽ phát huỳnh quang W Chất phát hùynh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu TaqMan probe KẾT QUẢ PCR REAL-TIME CA B 101 bản sao 101 bản sao Dựng đường chuẩn (standard curve) với một chất chuẩn có nồng độ đã biết. Hàm lượng của thành phần cần phát hiện được tính dựa trên đường chuẩn này Ct (Cycle threshold - chu kỳ ngưỡng) : chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền Ghi chú : đường màu đỏ là t1n hiệu nền TẠO DÒNG SẢN PHẨM PCR Taq polymerase thường thêm 1A vào đầu 3’ Ỉ sử dụng T-vector để tạo dòng sản phẩm PCR Còn gọi là T-A cloning PCR “NGƯỢC“ Dùng nhân bản vùng nằm hai bên một vùng đã biết trình tự PCR „“TÁI TỔ HỢP“ Dùng để nối nhiều trình tự ngắn thành một trình tự dài, Ví dụ : nối promoter của gene A với vùng mã hóa của gene B GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (SEQUENCING) PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT (HÓA HỌC) Nguyên lý : dựa trên sự phân cắt hóa học DNA Các bước chính : 1. Thu nhận trình tự DNA cần giải 2. Biến đổi hóa học đặc hiệu các base 3. Loại bỏ các base biến đổi 4. Cắt mạch DNA ở vị trí bị loại bỏ base PHƯƠNG PHÁP SANGER (ENZYME HỌC) (DIDEOXY SEQUENCING METHOD) Nguyên lý : dựa trên sự tổng hợp DNA kết hợp với từng loại dideoxynucleotide Các bước chính : 1. Thu nhận trình tự DNA cần giải 2. Nhân bản trình tự này với dNTP và từng loại ddNTP Điện di phân tách các trình tự DNA tạo thành của hai phản ứng È Đọc kết quả : tự động hoặc qua phóng xạ tự ghi PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ MAXAM-GILBERT Các phản ứng giải trình tự : C : Hydrazine trong NaCl cắt base C G : G được methyl hóa bằng dimethylsulfate sau đó bị cắt bằng kiềm G + A : Formic acid cắt liên kết giữa base và đường T + C : Hydrazine cắt vòng pyrimidine Bước cuối : Piperidine cắt các base biến đổi KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ HÓA HỌC Kết quả của kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ SANGER GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG MỘT SỐ BIỆN PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG The Single-Priming Method PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 2 PRIMER ĐỘT BIẾN PHƯƠNG PHÁP KUNKEL dut : dUTPase ung : uracil-DNA-glycosylase (W.P. Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751) PHƯƠNG PHÁP “TÁI SẮP XẾP DNA” (DNA SHUFFLING) Gồm các bước : • “Đục lỗ” DNA bằng Dnase I • Tiến hành PCR không có mồi : - Biến tính - Tái bắt cặp - Kéo dài Ỵ Tạo ra những trình tự DNA “lai” CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có mang plasmid Ti tái tổ hợp để chuyển gene vào tế bào thực vật MỘT SỐ BIỆN PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Phương pháp bắn gene Phương pháp biến nạp Phương pháp vi tiêm Phương pháp dùng vector virus CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT LIỆU PHÁP GENE Ở ĐỘNG VẬT : W Chuyển gene ở tế bào sinh dục Ỉ động vật chuyển gene W Chuyển gene ở tế bào sinh dưỡng Ỉ động vật “khảm” CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT Chuyển gene ở động vật thông qua tế bào ES (Embryonic Stem Cell – tế bào mầm) CÂU HỎI PHẦN 6 1. Những yếu tố nào quyết định tính đặc hiệu ? độ nhạy của phương pháp PCR ? 2. Làm cách nào tăng tính đặc hiệu, độ nhạy của phương pháp PCR ? 3. Những cách hạn chế các nhược điểm của phương pháp PCR 4. Nêu một số ứng dụng của nested-,multiplex, AP-PCR, RACE, in situ PCR 5. Nêu cách thực hiện phản ứng real-time RT-PCR 6. Đường chuẩn là gì ? Xây dựng như thế nào ? Dùng làm gì ? 7. Ct là gì ? Vì sao cần xác định Ct ? 8. Nguyên lý của PCR tái tổ hợp 9. Nguyên lý phương pháp Giải trình tự theo Sanger, phương pháp Giải trình tự tự động. Khác biệt giữa hai phương pháp ? 10. Có thể gây đột biến điểm không định hướng như thế nào ? 11. Có thể gây đột biến điểm định hướng như thế nào ? 12. Nêu một ứng dụng củ phương pháp “DNA Shuffling” 13. Cách chuyển vật liệu di truyền (VLDT) ở thực vật 14. Chuyển VLDT ở động vật : các cách tiếp cận và ưu nhược điểm của chúng