Knock-Down gen Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase (duch) gây giảm biểu hiện Tyrosine Hydroxylase trong tế bào thần kinh sản sinh Dopamine và cảm ứng apoptosis trên mô hình ruồi giấm Drosophilamelanogaster - Đặng Ngọc Ánh Sương

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 267-273 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. KNOCK-DOWN GEN Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase (duch) GÂY GIẢM BIỂU HIỆN TYROSINE HYDROXYLASE TRONG TẾ BÀO THẦN KINH SẢN SINH DOPAMINE VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM Drosophilamelanogaster Đặng Ngọc Ánh Sương, Trần Hoàng Hiệp, Nguyễn Thị Thanh, Đặng Thị Phương Thảo* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase L1 (UCH-L1) là một enzyme thuộc hệ thống ubiquitin proteasome, có hoạt tính thủy phân liên kết giữa hai phân tử ubiquitin. Ngoài ra, UCH-L1 còn có hoạt tính nối khi tồn tại ở dạng lưỡng phân trong điều kiện in vitro. Protein UCH-L1 được cho là có liên quan đến bệnh Parkinson và một số loại ung thư nhưng cơ chế gây bệnh vẫn chưa được biết rõ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mô hình ruồi giấm Drosophila melonagaster để nghiên cứu chức năng của protein dUCH (protein tương đồng với UCH-L1 của người ở ruồi giấm) trong hệ thống sống thông qua khảo sát ảnh hưởng của việc knock-down gen duch. Kết quả thực nghiệm cho thấy, knock-down gen duch chuyên biệt trên các mô khác nhau đều dẫn đến những bất thường, cụ thể là thúc đẩy quá trình apoptosis ở mô mắt và giảm biểu hiện tyrosine hydroxylase (TH), enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp dopamine, ở mô não. Ngoài ra, knock-down gen duch trên toàn bộ cơ thể ruồi gây chết ấu trùng ở giai đoạn đóng kén. Những kết quả này bước đầu khẳng định protein UCH-L1 có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt động bình thường của tế bào, tạo tiền đề cho các nghiên cứu làm rõ cơ chế hoạt động của protein này trong cơ thể sống. Từ khóa: Drosophila melanogaster, apoptosis, cancer, Parkinson’s disease, tyrosine hydroxyalse, UCH-L1. MỞ ĐẦU Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase L1 (UCH-L1) là một protein chưa biết rõ chức năng gồm 223 amino acid. UCH-L1 biểu hiện nhiều trong tế bào thần kinh, chiếm 1-2% tổng số protein trong tế bào chất [7]. UCH-L1 vừa có hoạt tính thủy phân liên kết giữa hai phân tử ubiquitin [6] vừa có hoạt tính nối ubiquitin khi ở dạng lưỡng phân trên cơ chất là α-synuclein [8]. Ngoài ra, UCH-L1 còn có vai trò bền hóa phân tử ubiquitin, giúp hệ thống ubiquitin proteasome hoạt động ổn định [11]. Bất thường về chức năng của UCH-L1 đã được phát hiện ở một số loại ung thư và thoái hóa thần kinh, tuy nhiên vai trò của UCH-L1 trong cơ chế gây bệnh vẫn chưa được biết rõ. uch-l1 vừa được cho là có vai trò như một gen phát sinh ung thư [5] vừa được cho là có vai trò như một gen kháng khối u [15]. Đối với bệnh thoái hóa thần kinh, đột biến UCH-L1I93M, được tìm thấy trên một bệnh nhân Parkinson, làm thay đổi một phần cấu trúc của UCH-L1 và làm giảm 50% hoạt tính của UCH-L1 [10]. Hơn nữa, chuột chuyển gen biểu hiện UCH-L1I93M có sự tích tụ UCH-L1 và ubiquitin đồng thời các tế bào sản sinh dopamine chết theo thời gian, tương tự đặc điểm sinh lý của bệnh Parkinson [13]. Quan trọng hơn, UCH-L1còn có vai trò thiết yếu trong việc duy trì cấu trúc bình thường của synap thần kinh [2]. Vì vậy, việc tìm hiểu rõ chức năng cũng như mối tương quan giữa protein UCH-L1 với các bệnh có liên quan là một nhu cầu cần thiết nhằm cung cấp cơ sở cho điều trị và phòng ngừa bệnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu tìm hiểu vai trò của UCH-L1 trong hệ thống sống bằng cách giảm biểu hiện gen và xem xét mức độ ảnh hưởng trên mô hình ruồi giấm chuyển gen. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dòng ruồi: Canton-S (mã số 1, Bloomington, Hoa Kỳ), TH-GAL4 (mã số 8848, Bloomington, Hoa Kỳ), UAS-dUCH-IR (mã số 26468, Vienna Drosophila RNAi, Áo). Kháng thể: kháng thể kháng dUCH (Bộ môn Công nghệ sinh học phân tử vàMôi trường, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, tp. Hồ Chí Minh) [14], kháng thể kháng Tyrosine hydroxylase (Milipore, Nhật), kháng thể gắn Alexa 488 (Invitrogen, Nhật Bản). Knock-down gen bằng phương pháp RNAi kết hợp hệ thống GAL4/UAS Gen duch được knock-down bằng hệ thống GAL4/UAS [1]. Gen mã hóa cho protein GAL4 được thiết kế nằm sau promoter biểu hiện định hướng mô. Vùng UAS (upstream activation sequence) được gắn với hai đoạn trình tự gen duch sắp xếp đảo chiều (UAS-dUCH-IR). Khi hệ thống GAL4/UAS hoạt động, GAL4 được tạo ra sẽ bám lên vùng UAS và kích hoạt phiên mã đoạn gen này. Do có trình tự bổ sung ngược chiều nên sợi RNA được tạo ra sẽ tự động bắt cặp thành RNA mạch đôi, từ đó kích hoạt quá trình RNAi tự nhiên giúp phân cắt mRNA của gen duch, kết quả là sự knock-down gen duch tại mô đích (hình 1a). Hình 1. Knockdown gen duch trên mô mắt và mô não ruồi giấm a. Sơ đồ mô hình knock-down gen duch chuyên biệt mô trên ruồi giấm; b. Kết quả knock-down gen duch trên mô mắt và mô não ruồi giấm 1, 2, 5, 6: Đĩa tiền phân sinh mắt và não của ấu trùng ruồi đối chứng (1, 5) và ấu trùng ruồi knock-down gen duch (2, 6) nhuộm với kháng thể kháng dUCH. 3, 7: Sơ đồ vùng hoạt động của promoter GMR (c) và promoter TH (g). 4, 8: Biểu đồ tương quan tín hiệu dUCH trên đĩa mắt (4) với p=0,0002 và trên não ấu trùng (8) với p = 0,04 (Welch’s t-test). Thước đo tỷ lệ 50 μm. Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Tách mô trong dung dịch PBS lạnh và cố định bằng paraformaldehyde 4% trong 15 phút ở 25oC. Sau khi rửa bằng PBS-Triton X-100 (PBST) 0,3%, khóa mô bằng 10% huyết thanh dê và PBST 0,15% trong 30 phút ở 25oC, sau đó ủ với kháng thể sơ cấp trong 16 giờ ở 4oC. Kháng thể được pha trong 10% huyết thanh dê/PBST 0,15% với tỷ lệ: kháng thể dUCH 1:500, kháng thể TH 1:500. Sau đó, rửa mô bằng PBST 0,3% rồi ủ với kháng thể thứ cấp gắn Alexa 488 (1:500) trong 2 giờ ở 25oC. Sau khi rửa mô bằng PBST 0,3%, cố định mô trên lam kính với dung dịch bảo quản. Khảo sát khả năng leo trèo của ruồi trưởng thành (climbing) Ruồi 20 ngày tuổi được cho vào các ống nhựa có đánh dấu mức 20cm (10con/lần, mỗi dòng 30 con). Để đảm bảo tính ổn định của kết quả, thí nghiệm chỉ quan sát trên ruồi đực, vì chu kỳ sinh sản của ruồi cái có khả năng ảnh hưởng tới sức sống và khả năng leo trèo. Ðập nhẹ ống nhựa để đưa ruồi về cùng mức xuất phát và ghi nhận số ruồi vượt mức 20cm trong 20 giây. Lặp lại ba lần cho mỗi lần đo. Xử lý dữ liệu Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang được quan sát dưới kính hiển vi Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Hoa Kỳ) và ghi nhận bằng phần mềm Axiovision 4.8. Sau đó, cường độ tín hiệu huỳnh quang khi nhuộm với kháng thể kháng dUCH và cas-3 trên các mô được đo bằng công cụ Measure của phần mềm ImageJ (so sánh chỉ số IntDen). Số lượng tế bào sinh dopamine được đánh dấu huỳnh quang bằng kháng thể kháng TH, sau đó đếm bằng công cụ Cell counter của phần mềm ImageJ. Tất cả dữ liệu trên được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm Graphpad Prism 6.0. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Knock-down gen duch chuyên biệt mô trên mô hình ruồi giấm Trước tiên, chúng tôi knock-down gen duch trên hai mô đích là mắt và não ruồi. Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng dUCH cho thấy tín hiệu dUCH giảm trên đĩa tiền phân sinh mắt của ấu trùng bậc ba dòng ruồi knock-down so với dòng đối chứng (hình 1a-1, 2). Tương tự, tín hiệu dUCH trên não ấu trùng bậc ba cũng giảm (hình 1b-4, 5). Như vậy, chúng tôi đã knock-down thành công gen duch, với hiệu quả knock-down 34,4% trên đĩa mắt (hình 1b-3) và 23,6% trên não (hình 1b-6), tỷ lệ này vừa đủ để gây ra những bất thường trong tế bào mà không gây chết, giúp tiến hành những thí nghiệm tiếp theo thuận lợi hơn. Knock-down gen duch cảm ứng apoptosis trên đĩa tiền phân sinh mắt ruồi giấm Quan sát ban đầu cho thấy dòng ruồi có sự knock-down duch trên mô mắt có kiểu hình mắt nhám, cấu trúc mắt có nhiều sai hỏng (hình 2a,b). Để giải thích hiện tượng này, chúng tôi tiến hành nhuộm đĩa mắt với kháng thể kháng caspase-3, một marker nhận diện hiện tượng apoptosis. Đĩa mắt của dòng ruồi knock-down cho thấy có sự gia tăng đáng kể của các tín hiệu caspase-3 ở vùng posterior so với đối chứng (hình 2a’, b’). Bên cạnh đó, chúng tôi đồng biểu hiện protein P35 trên dòng ruồi knock-down gen duch, P35 là một protein của virus đã được chứng minh có khả năng bất hoạt hoàn toàn quá trình apoptosis [4]. Dòng ruồi knock-down duch và biểu hiện P35 có kiểu hình mắt trở về bình thường (hình 2c) đồng thời tín hiệu apoptosis trên đĩa mắt cũng không còn được ghi nhận (hình 2c’). Hiện tượng này không xảy ra ở dòng ruồi đồng biểu hiện một protein ngoại lai khác là β-galactosidase (hình 2d, d’). Như vậy, knock-down gen duch cảm ứng apoptosis trên đĩa mắt của ấu trùng và dẫn đến kiểu hình mắt nhám ở ruồi trưởng thành. Hình 2. Knockdown gen duch cảm ứng apoptosis trên đĩa tiền phân sinh mắt và gây ra kiểu hình mắt nhám a-d: Mắt kép các dòng ruồi giấm trong thí nghiệm; a’-d’: Đĩa mắt nhuộm kháng thể kháng caspase-3, tín hiệu caspase-3 được quan sát ở vùng posterior (vùng khoanh lại); e: Biểu đồ tương quan cường độ caspase-3 trên các đĩa mắt, với p<0,0001 (One-way ANOVA). Thước đo tỷ lệ 50 μm. Hình 3. Knock-down gen duch trên não ruồi làm giảm tín hiệu TH và giảm khả năng leo trèo của ruồi trưởng thành 20 ngày tuổi a. Kết quả nhuộm kháng thể TH: 1, 2, 3: não ruồi đối chứng ở các độ phóng đại khác nhau; 4, 5, 6: não ruồi knock-down gen duch ở các độ phóng đại khác nhau; 7: Sơ đồ các vùng tế bào sinh dopamine trên não ruồi trưởng thành; 8: Biểu đồ số lượng tín hiệu TH trên vùng não trước của ruồi giấm, p=0,0104 (Welch’s t-test); b. Kết quả khảo sát vận động ở ruồi 20 ngày tuổi, p = 0.0429 (Welch’s t-test). Thước đo tỷ lệ: 50μm. Bảng 1. Tác động knock-down gen duch trên các mô khác nhau của ruồi giấm Dòng ruồi Vị trí knock down duch Kiểu hình Ruồi đối chứng Ruồi knock-down Act5C-GAL4 Tất cả các tế bào Phát triển bình thường Chết ở giai đoạn ấu trùng đóng kén GMR-GAL4 Mắt Tế bào mắt phồng, dính nhau, mất gai Pnr-GAL4 Lưng Biến dạng vị trí các lông trên lưng MS1096-GAL4 Cánh Mất ven, ven biến dạng TH-GAL4 Tế bào sinh dopamine Giảm khả năng vận động của ruồi 20 ngày tuổi Knock-down gen duch trên tế bào thần kinh sinh tổng hợp dopamine làm giảm tín hiệu tyrosine hydroxylase tương ứng với giảm khả năng vận động của ruồi giấm Chúng tôi sử dụng promoter TH để knock-down gen duch trên các tế bào sản sinh dopamine. Promoter này điều hòa enzyme tyrosine hydroxylase (TH) tham gia chuyển hóa tạo dopamine, chất dẫn truyền tín hiệu thần kinh có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt động bình thường của cơ và có liên quan mật thiết đến bệnh Parkinson. Trong nhiều nghiên cứu trước, protein TH đã được sử dụng như một chỉ thị trong phân tích và nghiên cứu trên các tế bào thần kinh sản sinh dopamine [3]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhuộm huỳnh quang não ruồi trưởng thành 20 ngày tuổi với kháng thể kháng TH. Kết quả cho thấy tín hiệu TH trên vùng não trước của ruồi knock-down có sự suy giảm đáng kể so với ruồi đối chứng (hình 3a), và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Song song đó, ruồi knock-down 20 ngày tuổi cũng cho thấy khả năng vận động kém hơn ruồi đối chứng (hình 3b). Như vậy, dưới tác động của việc knock-down gen duch, lượng TH trong não ruồi suy giảm kèm theo khả năng leo trèo kém đi đã được ghi nhận ở ruồi 20 ngày tuổi. Các nghiên cứu trước đã cho thấy giảm biểu biện protein TH dẫn đến giảm lượng dopamine trong não ruồi [12]. Mặt khác, công bố về vai trò của các protein như alpha-synuclein, park1, pink1, Dj1 trong bệnh Parkinson trên mô hình ruồi giấm cũng cho thấy các biểu hiện tương tự như suy giảm lượng dopamine và khả năng vận động của ruồi giấm [9]. Với những dữ liệu trên, chúng tôi đã có được những bằng chứng thực nghiệm ban đầu về mối liên hệ giữa gen duch và bệnh Parkinson trên mô hình ruồi giấm. Ngoài ra, chúng tôi cũng khảo sát ảnh hưởng của việc knock-down gen duch trên một số mô khác như cánh và lưng (bảng 1) và cũng ghi nhận có sự bất thường về kiểu hình trên dòng ruồi knock-down gen duch so với dòng đối chứng. Knock-down gene duch trên tất cả các tế bào của ruồi giấm gây tác động mạnh hơn, dẫn đến chết ấu trùng ở giai đoạn đóng kén. Kết hợp lại, các kết quả này bước đầu cho thấy protein dUCH có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt động bình thường của cơ thể sống. Tuy nhiên, cần tiến hành thêm nhiều thí nghiệm sâu hơn để làm sáng tỏ những hiện tượng này, từ đó giúp tìm ra cơ chế gây bệnh của gen uch-l1. KẾT LUẬN Với những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đã thành công trong việc knock-down gen duch trên mô hình ruồi giấm. Knock-down gen duch đã cảm ứng apoptosis trên đĩa tiền phân sinh mắt dẫn đến kiểu hình mắt nhám và gây chết khi việc knock-down xảy ra ở toàn thân. Đi sâu nghiên cứu tác động của knock-down gen duch trên não, chúng tôi nhận thấy ruồi knock-down 20 ngày tuổi có sự giảm tín hiệu TH cũng như giảm khả năng vận động. Kết hợp với những dữ liệu đã có về bệnh Parkinson, sự giảm biểu hiện của protein dUCH có thể dẫn đến giảm lượng dopamine trong não và gây giảm vận động ở ruồi. Các kết quả này là cơ sở tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra cơ chế phân tử gây bệnh của protein này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Brand A. H., Perrimon N., 1993. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development, 118(2): 401-415. Cartier A. E., Djakovic S. N., Salehi A., Wilson S. M., Masliah E., Patrick G. N., 2009. Regulation of synaptic structure by ubiquitin C-terminal hydrolase L1. The Journal of neuroscience., 29(24): 7857-7868. Faust K., Gehrke S., Yang Y., Yang L., Beal M. F., Lu B.., 2009. Neuroprotective effects of compounds with antioxidant and anti-inflammatory properties in a Drosophila model of Parkinson's disease. Bmc Neuroscience., 10: 109. Hay B. A., Wolff T., Rubin G. M., 1994. Expression of baculovirus P35 prevents cell death in Drosophila. Development., 120(8): 2121-2129. Hibi K., Westra W. H., BorgesM., Goodman S., Sidransky D., Jen J., 1999. PGP9.5 as a candidate tumor marker for non-small-cell lung cancer. American Journal of Pathology., 155(3): 711-715. Larsen C. N., Krantz B. A., Wilkinson K. D., 1998. Substrate specificity of deubiquitinating enzymes: ubiquitin C-terminal hydrolases. Biochemistry., 37(10): 3358-3368. Liu Y., Fallon L., Lashuel H. A., Liu Z., Lansbury P. T. J., 2002. The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect alpha-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility. Cell., 111(2): 209-218. Liu Z., Meray R. K., Grammatopoulos T. N., Fredenburg R. A., Cookson M. R., Liu Y., Logan T., Lansbury P. T. J., 2009. Membrane-associated farnesylated UCH-L1 promotes alpha-synuclein neurotoxicity and is a therapeutic target for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America., 106(12): 4635-4640. Muñoz-Soriano V; Paricio N., 2011. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's Disease., 2011: 520640. Nishikawa K., Li H., Kawamura R., Osaka H., Wang Y. L., Hara Y., Hirokawa T., Wada K., 2003. Alterations of structure and hydrolase activity of parkinsonism-associated human UCHL1 variants. Biochem Biochemical and Biophysical Research Communications., 304(1):176-183. Osaka H., Wang Y. L., Takada K., Takizawa S., Setsuie R., Li H., Sato Y., Wada K., 2003. Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Human Molecular Genetics., 12(16): 1945-1958. Riemensperger T., Isabel G., Coulom H., Neuser K., Seugnet L., Kume K., Iché-Torres M., Birman S., 2011. Behavioral consequences of dopamine deficiency in the Drosophila central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108(2): 834-839. Setsuie R., Wang Y. L., Mochizuki H., Osaka H., Hayakawa H., Ichihara N., Li H., Wada K., 2007. Dopaminergic neuronal loss in transgenic mice expressing the Parkinson's disease-associated UCH-L1 I93M mutant. Neurochemistry International., 50(1): 119-129. Tram N. T. Q., Trang N. T. T., Thao D. T. P., Thuoc T. L., 2013. Production of polyclonal anti-dUCH (Drosophila Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase) antibodies. Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy., 32(2): 105-112. Ummanni R., Jost E., Braig M., Lohmann F., Mundt F., Barett C., Schlomm T., Balabanov S., 2011. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1 (UCHL1) is a potential tumour suppressor in prostate cancer and is frequently silenced by promoter methylation. Molecular Cancer., 10(1): 1-13. KNOCK-DOWN GENE Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase (duch) RESULTED IN REDUCING TYROSINE HYDROXYLASE IN DOPAMINERGIC CELLS AND INDUCING APOPTOSIS IN Drosophila melanogaster Dang Ngoc Anh Suong, Tran Hoang Hiep, Nguyen Thi Thanh, Dang Thi Phuong Thao University of Science, Vietnam National University in Ho Chi Minh city SUMMARY Ubiquitin Carboxyl Hydrolase L1 (UCH-L1) is an abundant neuron protein that plays an important role in remaining the function of ubiquitin proteasome system. It has several irrelevant activities as hydrolase and ligase, which also related to ubiquitin. Recent decades, UCH-L1 has been supposed that it related to pathogenesis of many cancers and neurodegenerative diseases. However, the mechanism of these diseases induced by UCH-L1 has not been revealed yet. In this research, we use Drosophila melanogaster as a model system to examine the consequence of the knock-down gene duch, a Drosophila homologue of UCH-L1, by using RNAi. Specific knock-down gene duch in eye imaginal dics induce apoptosis and result in a rough eye phenotype in adults. Moreover, we found that down-regulated dUCH has a toxic effect that leads to the reduction in the number of dopaminergic neurons and the locomotor dysfunction of the 20-days-old adults with a significantly different from control. Furthermore, knock-down gene duch in whole-body Drosophila caused pupal lethality. These results strongly suggested that dUCH plays an important role in maintaining normal activity of organism and giving a basic knowledge for many our researches afterward. Keywords: Drosophila melanogaster, apoptosis, cancer, Parkinson’s disease, tyrosine hydroxyalse, UCH-L1. Ngày nhận bài: 22-10-2014