Kiểm nghiệm và phân tích thực phẩm

n tích - Máy đọc Elisa (Photometer) - Micro pipet 1,8,12 kênh loại - Máy lắc (để chiết mẫu) 50-200µl - Bình định mức - Máy xay (để xay mẫu) - Ống đong - Ống nghiệm - Cốc thủy tinh - Bình tia nhựa - Máy lắc Vortex - Đồng hồ bấm giây - Khăn giấy - Bút đánh dấu - Pipet tip - Phễu lọc * Hóa chất - Methanol (để chiết mẫu) - Nước cất Các thành phần của bộ kit Elisa để kiểm tra Aflatoxin B1 (nhà sản xuất cung cấp): - Giếng mini phủ kháng thể - Cộng hợp Enzim đặc 10x - Đệm pha cộng hợp - Aflatoxin chuẩn B1 (1,2,4,8 ppb) - Cơ chất A (TMB) - Cơ chất B (Hydroperoxit/đệm axetat) - Dịch hãm - Tween20 5% * Tiến hành Chuẩn bị các thuốc thử: - Pha loãng 1/10 cộng hợp enzyme trong đệm pha công hợp. Lắc đều hỗn hợp một cách nhẹ nhàng. Tránh tạo bọt. Sau khi pha cộng hợp enzyme bảo quản được 6 tháng - Pha dịch rửa: Pha loãng Tween20 trong nước cất để đạt nồng độ 0,05% - Trong vòng 15 phút trước khi sử dụng, pha hỗn hợp cơ chất như sau : Trộn cơ chất A và cơ chất B theo tỷ lệ: 0,5ml cơ chất A/15ml cơ chất B. Chuẩn bị mẫu: - Mẫu đem xay nhỏ, trộn đều, lấy 5g mẫu và 25ml methanol 60% cho vào bình định mức, lắc đều trong vòng 30 phút. - Để lắng trong vòng 10 – 15 phút - Lọc qua giấy lọc, lấy khoảng 10ml dịch lọc đem phân tích. Phân tích mẫu: - Cho vào những giếng đối chứng âm: 50ml methanol 60%, 50µl Aflatoxin B1 chuẩn. - Cho vào những giếng mẫu: 50ml methanol 60%, 50µl dịch chiết đã pha loãng (làm lặp lại tối thiểu mỗi mẫu 2 giếng). 92 - Để yên trong 10 phút. - Sau thời gian ủ, đổ mạnh hỗn hợp ra khỏi giếng vào một chậu đựng nước javen 5%, đập lên khăn giấy, sau đó rửa 5 lần bằng dung dịch rửa. Cách rửa: dùng bình tia đổ đầy dung dịch rửa vào các giếng, để khoảng 5 giây, vẩy mạnh để đổ toàn bộ dịch rửa ra, lặp lại như thế 5 lần. Đập lên giấy nhiều lần cho thật khô nước. - Cho 100µl hỗn hợp cơ chất vào tất cả các giếng, đọc kết quả bằng máy đọc Elisa tại bước sóng 450nm. * Đọc kết quả và tính toán Màu đậm = ít Aflatoxin B1 Màu nhạt = nhiều Aflatoxin B1 Tính độ ức chế màu theo công thức: % Ức chế = 1001 0 1 ×      − A A Trong đó: A1 : Mật độ quang của giếng chuẩn hoặc mẫu A0 : Mật độ quang của giếng đối chứng âm Dựa vào % ức chế màu của mẫu, so sánh trên đồ thị Aflatoxin B1 chuẩn sẽ tính được nồng độ Aflatoxin B1 có trong giếng. Từ đó tính ra được nồngđộ Aflatoxin B1 có trong mẫu. Nồng độ Aflatoxin B1 trong mẫu = 5 x Nồng độ Aflatoxin B1 trong giếng 5.2.10.2. Phân tích Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng (TCL) * Nguyên tắc Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với Aflatoxin được gắn đồng hóa trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được gắn vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết mẫu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu dã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để loại bỏ tát cả những thành phần không đặc hiệu bám lại. Sau đó Aflatoxin sẽ được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng. * Dụng cụ - Cột sắc ký ái lực miễn dịch - Xiranh 20-30ml - Cân phân tích - Microsyringe Halminton 10µl - Micro pipet 1,8,12 kênh loại 50-200, 200-1000µl - Pipet tip - Giấy lọc - Bình chạy TLC - Bơm tay - Bản TLC silicagel 10x10cm - Dụng cụ làm khô gia nhiệt - Bình thổi khí N2 (hoặc bình làm khô chân không) - Máy xay (để xay mẫu) - Bình định mức - Ống nghiệm - Ống đong - Phễu lọc - Cốc thủy tinh - Bình tia nhựa - Máy lắc Vortex - Khăn giấy * Hóa chất 93 - Dung dịch chiết mẫu: Methanol/nước cất (75:25) - Methanol HPLC grade (để chiết mẫu) - Aflatoxin chuẩn B1 trong Benzen-Acetonitrit (98:2) - Dung dịch triển khai: Chloroform-Aceton (9:1) - Máy soi đèn UV 365nm - Nước cất * Tiến hành Chuẩn bị mẫu: - Xay 1kg mẫu đủ lọt sàng 1mm. Trộng đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu methanol 75% cho vào bình định mức. Lắc đều trong 30 phút. - Để lắng trong vòng 10-15 phút. - Lọc dịch chiết qua giấy lọc. - Lấy 15ml dịch pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu). Phân tích mẫu: Qua cột sắc ký ái lực miễn dịch: - Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ. Mở nắp cột sắc ký ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống (để tránh tạo bọt khí trong cột) và gắn vào xiranh. - Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột. - Khi lớp nước vừa tới đầu cột cho 15ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh (tránh có bọt khí trong cột) - Cho dịch lọc chảy qua cột với tốc độ khoảng 1giọt/giây. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy. - Khi dịch mẫu tới đầu cột, cho 10ml nước cất vào xiranh để rửa cột. Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất. - Khi toàn bộ nước đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột ra khỏi xiranh, lau nước bám ở đầu cột và xiranh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước. - Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, hứng lấy dịch chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xiranh thổi 2-3ml không khí để đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột. Định lượng bằng sắc ký bản mỏng (TLC): - Làm khô dịch giải hấp thu trong N2 ở 40-45 0C. Hòa tan cặn lại trong 200µl Benzen-Acetonitrl (98:2). - Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách cạnh đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ bằng bút chì cách nhau 1cm trở lên. - Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen-Acetonitril (98:2). - Dùng Microsyringe chấm lên bảng silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau: + 3 chấm mẫu: 2,5,10µl + 1 nội chuẩn: 10µl mẫu và 10µl chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1). + 3 chấm chuẩn: 10,5,2µl chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1). 94 Lưu ý: Chấm trong tủ hút để dung môi bay hơi nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoảng 1mm/chấm. - Pha dung môi: Chloroform-Aceton (9:1). Cho khoảng 20ml dung môi vào bình sắc ký. Cho bản silicagel vào bình, đậy kín. Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản khoảng 0,5cm. - Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV. Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng. - So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm Aflatoxin B1 thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu. - So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và chấm mẫu, chọn một thể tích là Xµl mẫu có độ phát sáng bằng S µl chuẩn. - Tính toán nồng độ Aflatoxin B1 có trong mẫu. * Đọc kết quả và tính toán Nồng độ Aflatoxin B1 có trong mẫu: Aflatoxin B1 = WX VYS × ×× (µg/kg hoặc ppb) Trong đó: S : Thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng Xµl mẫu (µl) Y : Nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5µg/ml hoặc 0,5ppm) V : Thể tích hòa tan cặn (200µl) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng Sµl chuẩn W : Số gam mẫu đi qua cột (1g) Chú ý an toàn khi tiếp xúc với Aflatoxin: - Đeo găng tay khi làm thí nghiệm - Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước javen 10% - Dụng cụ thủy tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm trong nước javen 10% tối thiểu là 30 phút trước khi rửa. 95 CHƯƠNG 6 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ MẶT HÀNG THỰC PHẨM 6.1. Bột mỳ 6.1.1. Phương pháp lấy mẫu Nếu bột mỳ chứa trong bao thì tùy theo số lượng bao mà lấy mẫu: - Dưới 200 bao, lấy mẫu trong 20 bao. - Từ 201 bao đến 1000 bao, lấy mẫu trong 23 bao. - Trên 1000 bao, lấy mẫu trong 23 đến 30 bao. Nếu bột mỳ đổ thành đống: - Đống to lớn 100 tạ, lấy 20 chỗ. - Đống từ 101 đến 500 tạ, lấy 22 chỗ. - Đống từ 501 đến 1000 tạ, lấy 23 chỗ. - Đống trên 1000 tạ, lấy 30 chỗ. Mỗi mẫu như vậy lấy từ 100g đến 500g, đem trộn đều cho cả lô hàng, rồi rây đi rây lại cẩn thận 3 lần. Dàn mỏng đều thành hình tròn hoặc hình vuông, cắt chéo thành 4 phần bằng nhau, lấy 2 phàn đối diện. Trộn đều và lại chia lại như trên cho đến khi mẫu thử còn khoảng 1000g, đóng gói tránh ẩm ướt và các chất lạ lẫn vào. 6.1.2. Xác định trạng thái cảm quan Màu sắc bột mỳ được xác định và biểu thị thành các màu >, >, >… Bột mỳ tốt có màu trắng hoặc trắng ngà, mịn, tơi, có mùi thơm dễ chịu, không có mùi lạ: đắng, chua, ôi khét, không được có mùi mốc, mọt và các mùi lạ khác. 6.1.3. Xác định chỉ số lý hóa 6.1.3.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của bột mỳ được xác định theo phương pháp sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi (xem chi tiêt ở chương 3) 6.1.3.2. Xác định độ chua * Nguyên tắc Dùng dung dịch NaOH chuẩn để trung hòa hết các acid trong mẫu với phenolphtalein làm chỉ thị màu. * Tiến hành Cân 5g bột mỳ cho vào bình nón 250ml, thêm 50ml nước cất và lắc đều để làm tan hết bột. Thêm vào bình 3-5 giọt chỉ thị phenol phtalein và chuẩn đọ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền. * Kết quả Độ chua là số ml dung dịch NaOH 0,1N tác dụng hết với lượng acid có trong 100g bột mỳ. 96 X= G VNaOH 100× (0) 6.1.3.3. Xác định hàm lượng tro Hàm lượng tro được xác định bằng cách nung thành tro trắng rồi cân ( xem chi tiết ở chương 3) 6.1.3.4. Xác định hàm lượng và chất lượng gluten * Nguyên tắc Gluten là thành phàn chủ yếu của bột mỳ. Gluten gồm hai chất gliadin và glutenin. Hai chất này có tính chất dính cao, không tan trong nước mà khi nhào với nước, chúng trương nở và tạo thành khối dẻo đàn hồi. Các tính chất này là cơ sở để xác định hàm lượng gluten. * Tiến hành Xác định hàm lượng gluten ướt: - Cân 25g bột mỳ cho vào chén sứ. Nhào mẫu với 15ml nước ở nhiệt độ thường, dùng đũa trộn đều cho đến khi thành một khối đồng nhất. Dùng dao vét các mảnh bột dính vào chén, vê khối bột thành hình cầu, cho vào chén và đậy bằng tấm kính. - Để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng. Lấy cục bột rửa dưới tia nước nhỏ. Tay trái cầm cục bột, nắm các ngón tay lại và đưa vào vòi nước, tay phải điều chỉnh dòng nước chảy nhẹ. Khi gluten trở thành đàn hồi thì tăng tốc độ dòng nước lên cho đến khi gluten sạch hết bột. - Kiểm tra quá trình rửa bằng cách sử dụng một trong các cách sau: + Cho vào nước vắt từ gluten một vài giọt dung dịch Iot trong kali iotdua (0,2g kali iotdua và 0,1g iot tinh thể hòa tan trong 100ml nước), dung dịch không có màu xanh là đã rửa hết tinh bột. + Nhỏ 2-3 giọt nước vắt từ gluten vào một cốc nước trong, thấy nước không đục là được. - Ép khô khối gluten: Đặt khối gluten giữa 2 lòng bàn tay ép mạnh, thỉnh thoảng thấm tay bằng khăn khô. - Cân gluten đã ép khô với độ chính xác đên 0,01g. Khối lượng cân được là khối lượng gluten ướt của mẫu. Xác định hàm lượng gluten khô: - Sấy khối gluten ở nhiệt đọ 1050C, thời gian 1 giờ sấy đến khối lượng không đổi. Cân lượng chất gluten vừa sấy được M2. Đánh giá chất lượng gluten: Chất lượng gluten ướt được đặc trưng bằng màu sắc, độ căng, độ đàn hồi - Nhận xét màu sắc trước khi cân gluten Màu sắc được đặc trưng bằng các mức độ sau: Trắng ngà, xám, sẫm… - Xác định độ căng Sau khi xác định độ màu, cân 4g gluten. Vê thành hình cầu rồi ngâm trong chậu nước có nhiệt độ 16-200C trong 15 phút. Sau đó dùng hai tay kéo dài khối gluten trên 97 thước chia milimet cho đến khi đứt, tính chiều dài từ lúc đứt. Thời gian kéo 10 giây. Khi kéo không được xoắn sợi gluten. - Đánh giá độ đàn hồi Dùng khối lượng còn lại sau khi đánh giá độ căng. Dùng hai tay kéo dài miếng gluten trên thước khoảng 2 cm rồi buông ra, hoặc dùng ngón tay trỏ và ngón tay trái bóp miếng gluten. Đánh giá chất lượng Gluten Màu sắc gluten: - Màu trứng ngà hoặc màu vàng xám : gluten tốt - Màu xám : gluten xấu Độ căng: -Loại gluten có độ căng kém : 8 cm thì đứt -Loại gluten có độ căng trung bình : 15 cm thì đứt -Loại gluten có độ căng cao : 20 cm thì đứt Gluten loại I: Độ dẻo tốt độ giãn dài khá hoặc trung bình Gluten loại II: Độ dẻo tốt độ dãn dài kém hoặc độ dẻo vừa độ dãn dài trung bình Gluten loại III: Độ dẻo kém không dãn dài hoặc dãn dài kém * Tính kết quả Hàm lượng gluten (ướt) tính bằng % theo công thức: X = 0 1 100 M M × (%) Trong đó: M0 : Lượng cân mẫu (g) M1 : Khối lượng gluten ướt (g) Hàm lượng gluten (khô) tính bằng % theo công thức X = 0 2 M 100M × (%) Trong đó: M0 : Lượng cân mẫu (g) M2 : Khối lượng gluten khô (g) 6.1.4. Xác định chỉ số vi sinh 6.1.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí ( xem chi tiết ở chương 4). 6.1.4.2. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc ( xem chi tiết ở chương 4) 6.1.4.3. Xác định Coliforms (xem chi tiết ở chương 4). 6.1.4.4. Xác định E.coli (xem chi tiết ở chương 4). 6.1.4.5. Xác định Clostridium perfringens (xem chi tiết ở chương 4). 6.2. Bánh quy 6.2.1. Phương pháp lấy mẫu Bánh thường được bao thành gói với khối lượng mỗi gói 500g hoặc 250g. Lấy mẫu đầu tiên khoảng 5-10% tổng đơn vị bao gói, rồi từ mẫu đầu tiên lấy 10% làm mẫu 98 trung bình. Nếu mẫu trung bình có khối lượng từ 2-3kg thì nó đồng thời là mẫu phân tích. Nếu mẫu trung bình lớn hơn 3kg thì cẩn thận bóc các lớp giấy gói, lấy toàn bộ các chiếc bánh ra khỏi gói, xếp lên mặt bàn khô, sạch và lấy một nửa làm mẫu phân tích (chú ý lấy cả bánh nguyên, bánh vỡ, gãy và mốc, hỏng nếu có). 6.2.2. Xác định trạng thái cảm quan Màu đặc trưng của bánh đồng đều, màu không được đậm, hoặc màu trắng, hơi sống hoặc lốm đốm trắng, hoặc nâu đen. Bề mặt bánh láng đẹp, nguyên vẹn, chữ và vân hoa rõ nét không biến dạng, khuyết tật, không được có tạp chất. Bánh giòn, xốp, không ỉu mềm, chai cứng. Có vị đặc trưng của sản phẩm, hài hòa, hậu vị tốt, không được có vị lạ hay vị của sản phẩm hư hỏng 6.2.3. Xác định chỉ số lý hóa 6.2.3.1. Xác định tỷ trọng Độ xốp là một chỉ tiêu quan trọng của chất lượng bánh bích quy, nó đặc trưng cho độ nở và độ tiêu hóa của bánh. Độ xốp của bánh quy được xác định gián tiếp thông qua việc xác định tỷ trọng của bánh quy. * Nguyên tắc Xác định tỉ trọng bằng cách bỏ bánh quy đã biết trước khối lượng và đã được bọc một lớp parafin vào nước: dựa vào sự thay đổi khối lượng bánh bích quy trong không khí và trong nước tính được tỷ trọng của bánh. * Tiến hành - Cân khối lượng một chiếc bánh, cho vào chén sứ có parafin nóng chảy và để nguội. Cân bánh đã được phủ lớp parafin. Hiệu số khối lượng bánh sau và trước khi parafin hóa sẽ cho ra khối lượng parafin. - Cân khối lượng giá treo trong không khí, sau đó cho nó vào cốc nước cất có nhiệt độ 200C để cân khối lượng trong nước. Lấy hiệu số của khối lượng giá treo trong không khí và nước ta có thể tích của giá treo. - Sau đó đặt bánh bích quy đã nhúng parafin vào trong giá treo rồi tiến hành cân tương tự như trên để xác định thể tích của giá treo và bánh bích quy có bọc lớp parafin. * Kết quả Công thức xác định tỷ trọng bánh bích quy: D = CBA m −− Trong đó: m : khối lượng bánh bích quy (g) A : thể tích giá treo và bánh bích quy nhúng parafin (cm3) B : thể tích giá treo (cm3) C : Thể tích parafin = khối lượng parafin/0,9 Người ta quy ước bánh quy có độ xốp cao khi tỷ trọng không lớn hơn 0,6g/cm3, xốp trung bình – 0,63, xốp kém – trên 0,64. 99 6.2.3.2. Xác định độ ẩm Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô 100-1050C đến trọng lượng không đổi (xem chi tiết ở chương 3). 6.2.3.3. Xác định độ kiềm * Nguyên tắc Xác định độ kiềm của bánh bằng phương pháp trung hòa với dung dịch H2SO4 0,1N với chỉ thị là Bromthymol xanh. * Tiến hành Cân 5g bánh quy đã nghiền nhỏ, hòa tan bằng nước cất rồi cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch định mức. Lắc mạnh 5 phút rồi để yên 30 phút sau đó lắc đều. Lọc dung dịch trong bình qua bông lọc. Hút 25ml dung dịch lọc cho vào bình nón 250ml, thêm 3-5 giọt chỉ thị Bromothymol xanh. Chuẩn độ dung dịch trong bình nón bằng H2SO4 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển màu đột ngột từ xanh sang vàng. * Tính kết quả Độ kiềm của bánh quy là số ml dung dịch H2SO4 0,1N dùng trung hòa hết lượng kiềm có trong 100g bánh. Độ kiềm được tính theo công thức sau: X = 10 100 1 ×× ×× GV Va (0) Trong đó: a : thể tích dung dịch H2SO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ (ml) V : thể tích bình định mức (ml) V1 : thể tích dung dịch lấy để chuẩn độ (ml) G : lượng cân mẫu (g) 6.2.3.4. Xác định hàm lượng tro Xác đinh hàm lượng tro bằng phương pháp nung thành tro trắng rồi cân (xem chi tiết ở chương 3). 6.2.3.5. Xác định hàm lượng chất béo Hàm lượng chất béo được xác định theo phương pháp Soxhlet (xem chi tiết chương 3). 6.2.4. Xác định các chỉ tiêu vi sinh 6.2.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí (xem chi tiết ở chương 4). 6.2.4.2. Xác định Colifroms (xem chi tiết ở chương 4). 6.2.4.3. Xác định E.coli (xem chi tiết ở chương 4). 6.2.4.4. Xác định Clostridium perfringens (xem chi tiết ở chương 4). 6.3. Kẹo 6.3.1. Phương pháp lấy mẫu Các sản phẩm kẹo thường được bao gói thành từng chiếc. Tùy lượng mẫu, có thể lấy từ 5-10% khối lượng lô hàng làm mẫu đầu tiên, rồi trộn đều, lấy 5-10% mẫu đầu 100 tiên làm mẫu trung bình, rồi lại trộn đều, lấy 5-10% mẫu trung bình làm mẫu phân tích. 6.3.2. Xác định trạng thái cảm quan Màu sắc đồng đều, đặc trưng cho loại kẹo, hình dạng đẹp, không có khuyết tật. Trạng thái bên trong phải đặc trưng với từng loại kẹo. Mùi vị đặc trưng với từng loại kẹo, thơm, ngọt, dịu, kẹo không bị hồi đường và không có vị lạ. 6.3.3. Xác định chỉ số lý hóa 6.3.3.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của kẹo được xác định theo phương pháp sấy ở 800C đến khối lượng không đổi (xem chi tiết ở chương 3). 6.3.3.2. Xác định độ hòa tan và lượng tạp chất không tan Độ hòa tan của kẹo là hàm lượng các chất tan trong nước nóng. Độ hòa tan được xác định bằng cách cân một lượng mẫu cho vào cốc có 100ml nước cất, tiến hành đun sôi trên bếp điện và khuấy nhẹ cho đến khi kẹo tan hêt. Sau đó, lọc dung dịch ngay khi còn nóng qua giấy lọc hai lớp (đã biết khối lượng).Tráng rửa cốc và cặn trên giấy lọc nhiều lần bằng nước cất nóng. Để 10 phút cho giấy lọc ráo nước. Sấy khô giấy lọc ở 1050C đến khối lượng không đổi. Lượng tạp chất không tan của kẹo được tính theo công thức: Lượng tạp chất không tan = 100 – độ hòa tan (%) 6.3.3.3. Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung thành tro trắng rồi cân (xem chi tiết ở chương 3). 6.3.3.4. Xác định hàm lượng đường hoàn nguyên Theo phương pháp Bertrand (xem chi tiết ở chương 3). Hàm lượng đường này thường không quá 30%. Nếu hàm lượng đường này quá cao, kẹo dễ hút nước, ẩm và dễ chua. 6.3.3.5. Xác định hàm lượng đường chung Đường chung của kẹo là tổng các loại đường sau khi đã được thủy phân ở 700C trong 5 phút. Hàm lượng đường sau khi thủy phân được xác định theo phương pháp Bertrand (xem chi tiết ở chương 3). 6.3.3.6. Xác định độ acid hoặc độ kiềm Xác định độ acid (độ kiềm) của kẹo bằng phương pháp trung hòa với dung dịch NaOH 0,1N (H2SO4 0,1N) với chỉ thị là phenolphtalein. 6.3.3.7. Xác định hàm lượng chất béo Xác định hàm lượng chất béo theo phương pháp Soxhlet. Xác định chỉ số chứng minh độ hư hỏng của chất béo, các chỉ số này phải âm tính. 6.3.4. Xác định các chỉ tiêu vi sinh Dùng 20 bình nón, mỗi bình chứa 20g kẹo, đổ nước vô khuẩn vào và lắc cho tan hết, rồi thêm từ từ nước đến khi vừa đủ 100ml. Đem một trong hai bình đun sôi 15 phút, sau đó bù phần nước bốc hơi cho đủ 100ml 101 Dung dịch nước đường không đun thì dùng để tìm tổng số vi khuẩn hiếu khí, E.coli, vi khuẩn gây bệnh nấm mốc. Còn dung dịch đường đã đun thì tìm vi khuẩn có nha bào. Các chỉ số vi sinh cần xác định bao gồm: 6.3.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Pha loãng dung dịch nước đường chưa đun sôi thành các dung dịch 1/100, 1/1000, 1/10000, theo cách pha loãng thông thường. Cho vào 3 hộp lồng, mỗi hộp 1ml dịch pha loãng trên, 15ml thạc thường đã đun chảy và để nguội đến 450C, sau đó cho vào tủ ấm 370C. Sau 24-48 giờ, đếm khuẩn lạc và tính tổng số khuẩn lạc trong 1g thực phẩm. 6.3.4.2. Xác định nấm mốc Dùng dung dịch nước đường chưa đun pha loãng thành nhiều đậm độ khác nhau. Cho 1ml dung dịch nước đường chưa đun pha loãng vào 3 hộp lồng, rồi đỏ 15ml thạch Sabouraud đã điều chỉnh pH đến 3,5 bằng acid lactic, để ở nhiệt độ 25-300C, sau 5 – 7 ngày, nếu thấy nấm mọc, thì tùy theo từng nhóm nấm khác nhau, cấy vào môi trường định loại thích hợp để đọc kết quả. Dựa vào hình thái đại thể và vi thể để nhận định loại nấm. 6.3.4.3. Xác định E.coli Cấy dung dịch nước đường vào môi trường Kessler và nước pepton, khi thấy vi khuẩn phát triển thì theo dõi hiện tượng sinh indol trong môi trường pepton, hiện tượng sinh hơi trong môi trường Kessler. 6.3.4.4 Xác định cầu khuẩn gây bệnh Cấy nước đường chưa đun vào canh thang glucoza. Để tủ ấm 370C, sau 24 giờ cấy chuyển sang môi trường Chapmann để tìm tụ cầu khuẩn gây bệnh, và cấy chuyền sang môi trường thạch máu để tìm liên cầu khuẩn. 6.3.4.5. Xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S Lấy 6 ống thang gan, gạn bỏ nước, cấy vào mỗi ống 2ml dung dịch nước đường đã đun. Để tất cả ống vào nồi cách thủy 750C trong 15 phút. Để lên trên các ống đó 5ml môi trường thạch thường đã đun chảy và để nguội đến 450C. Làm lạnh ngay bằng cách cho vào tủ lạnh hoặc ngâm nước lạnh. Để toàn bộ vào tủ ấm 370C, sau 72 giờ, nếu có vi khuẩn phát triển, thạch sẽ bị nứt ra và có mùi hôi thối. 6.3.4.6. Xác định vi khuẩn kị khí chịu nhiệt và sinh H2S Nuôi cấy dung dịch đường pha loãng và đã đun sôi, trên môi trường Wilson Blair, nếu có Welchii sẽ có khuẩn lạc màu đen Nhận định kết quả: Đường dùng ăn thẳng, kẹo mứt, mật ong không được có E.coli, các vi khuẩn gây bệnh, nấm mốc, nấm men. 6.4. Nước chấm Nước chấm là sản phẩm của sự thủy phân các chất đạm thực vật (khô lạc, khô đậu tương) hoặc đạm động vật (cá, tôm, cua, tép) bằng men proteaza trong nấm men, 102 nấm mốc (nước chấm lên men), hoặc bằng dung dịch acid clohydric, rồi trung hòa bằng NaOH, Na2CO3 (nước chấm hóa giải). Nước chấm thường chứa trong bao gói là các chai có dung tích 0,5 lít hoặc 1 lít. 6.4.1. Xác định trạng thái cảm quan - Nước chấm tốt có màu nâu nhạt đến nâu, không có váng, trong. - Mùi thơm đặc trưng, không có mùi khét hoặc các mùi khác lạ. - Vị ngọt dịu, không khé cổ, không có các vị lạ khác. 6.4.2. Xác định chỉ số lý hóa Tất cả các chỉ số hóa học đều tiến hành phân tích trên nước chấm pha loãng 1/20. 6.4.2.1. Xác định độ acid Xác định độ acid bằng phương pháp trung hòa với phenolphtalein làm chỉ thị. Độ acid trong nước chấm cao hơn trong nước mắm, và độ acid trong nước chấm lên men lại cao hơn trong nước chấm hóa giải. Thông thường độ acid của nước chấm từ 8-10. 6.4.2.2. Xác định hàm lượng muối NaCl Hàm lượng muối ăn trong nước chấm được xác định theo phương pháp Morh. Lấy 5ml mẫu thử đã pha loãng cho vào bình nón 250ml, thêm 20ml nước cất và 0,5ml dung dịch K2CrO4 5%. Chuẩn độ bằng dung dịch AgNO3 0,1N cho đến khi xuất hiện hết tủa đỏ gạch Ag2CrO4. Hàm lượmg muối ăn được tính theo công thức: NaCl = V 201000V00585,0 1 ××× (g/l) Trong đó: V1 : Thể tích dung dịch AgNO3 0,1N tiêu tốn để chuẩn độ (ml) V : Thể tích mẫu đã pha loãng đem phân tích (ml) 20 : Hệ số pha loãng mẫu Hàm lượng muối ăn trong nước chấm từ 200-250 g/l 6.4.2.3. Xác đinh hàm lượng nitơ toàn phần Xác định hàm lượng nitơ toàn phần theo phương pháp Kenđan (xem chi tiết ở chương 3). 6.4.2.4. Xác định hàm lượng nitơ foocmon (xem chi tiết ở chương 3). 6.4.2.5. Xác định hàm lượng nitơ (xem chi tiết ở chương 3). 6.4.2.6. Xác định hàm lượng Aflatoxin (xem chi tiết ở chương 4). 6.4.2.7. Xác định các kim loại nặng (xem chi tiết ở chương 4). 6.4.3. Xác định các chỉ tiêu vi sinh 6.4.3.1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Pha loãng nước chấm thành các dung dịch có đậm độ 1/10,1/100, 1/1000 Cho 1ml dung dịch pha loãng trên ( mỗi đậm độ làm 3 mẫu song song) vào hộp petri, đổ thêm 15ml thạch thường đã đun chảy và để nguội 450C, láng đều. Sau khi thạch đông, để tủ ấm 370C. Sau 24-48 giờ, đếm các khuẩn lạc và tính kết quả trên 1ml nước chấm. 103 6.4.3.2. Xác định E.coli Lấy 1ml nước chấm, cho vào một ống môi trường pepton, có cho thêm 0,34ml dung dịch phenic 5% và 1ml nước mắm cho vào một ống canh thang lactoza 1% có ống Đunham Để trong tủ ấm 420C, sau 24 giờ, theo dõi tính chất sinh indol ở ống nước pepton và tính chất lên men, sinh hơi ở ống môi trường lactoza. Nếu cả hai hiện tượng trên đều có và phết kính nhuộm Gram lại tìm thấy trực khuẩn Gram (-) thì đó là trực khuẩn E.coli. 6.4.3.3. Xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S Xem phần xác định vi khuẩn kị khí sinh H2S chương 5. 6.4.3.4 Xác định trực khuẩn hiếu khí sinh H2S Xem phần xác định trực khuản hiếu khí sinh H2S chương 5. 6.4.3.5. Xác định Vibrio parahaemolyticus Áp dụng đối với nước chấm có nguồn gốc động vật Nguyên tắc: một lượng mẫu nước chấm xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng Colistine. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose. Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh học. 6.4.3.6. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc (xem chi tiết ở chương 5). Áp dụng đối với nước chấm có nguồn gốc thực vật Nhận định kết quả: Nước chấm bán ra thị trường về mặt vi sinh vật phải đáp ứng những yêu cầu sau: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 5000/ml - Không được có E.coli. - Vi khuẩn kị Khí sinh H2S không được quá 1/ml. - Trực khuẩn hiếu khí sinh H2S không được quá 10/ml. - Không đươc có vi khuẩn gây bệnh. 6.5. Rượu, bia, nước ngọt 6.5.1. Bia 6.5.1.1. Phương pháp lấy mẫu Cứ 1000 chai bia cùng loại, lấy 20 chai ở các ket khác nhau. Mẫu này được dùng làm mẫu phân tích. 6.5.1.2. Xác định trạng thái cảm quan - Bia có màu vàng nhạt, hay vàng rơm đẹp, trong suốt, không có vẫn đục, không có cặn hay vật thể nhỏ, khi đổ vào cốc. Bọt rất mịn, dày, bọt nổi đều liên kết, bọt trắng, kết dính bền tốt. - Mùi thơm, có mùi hoa húp-lông và malt tinh khiết đặc trưng dễ chịu, hòa hợp. Không được có mùi men, mùi chua. - Vị ngọt dịu, vị đắng của hoa húp-lông và malt dễ chịu, hòa hợp không khé cổ, không có các vị lạ khác 104 6.5.1.3. Xác định chỉ số lý hóa * Xác định tỷ trọng Dùng tỷ trọng kế ở 200C, chia vạch cách nhau 0,005. Mẫu thử đã được trộn đều và hạ nhiệt độ đến 16-170C, được đổ vào ống đong từ từ và cho chảy theo đường ống, tránh sủi bọt, cho tới ¾ dung tích. Cho tỷ trọng kế thật nhẹ nhàng vào ống đong, tránh chạm vào thành ống, bỏ tay ra thật nhẹ nhàng. Chú ý tránh để tỷ trọng kế chìm xuống dưới rồi lại nổi lên, làm sai kết quả. Đọc kết quả trên tỷ trọng kế và đọc luôn cả nhiệt độ. Đọc kết quả: - Nếu nhiệt độ đúng +200C, kết qủa đọc được là kết quả kiểm nghiệm. - Nếu nhiệt độ cao hơn +200C, thì mỗi độ cao hơn, phải cộng thêm vào kết quả 0,0002. Nếu nhiệt độ thấp hơn +200C thì phải trừ vào kết quả 0,0002. Tỷ trọng của bia từ 1,005 đến 1,020 * Xác định độ khô Lấy 10ml bia đã loại bỏ CO2, cô khô ở nồi cách thủy, rồi tiến hàn theo phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi. Độ khô của bia trung bình khoảng 40g/l. * Xác định độ màu Độ màu của bia được xác định theo một trong hai phương pháp: Phương pháp quang phổ: ` - Đo độ hấp thụ của bia ở bước sóng 430nm. Màu dịch đường được tính theo đơn vị EBC bằng độ hấp thụ nhân với hệ số pha loãng. Phương pháp chuẩn độ Iod: Lấy 150ml đến 200ml bia cho vào bình tam giác lắc ở nhiệt độ 17-200C cho đến khi ngừng tách khí. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng khô. Dùng ống đong cho vào cốc thủy tinh 100ml nước cất và một cốc khác 100ml bia. Để 2 cốc trên nền đá trắng, quan sát màu từ trên xuống. Dùng micropipet nhỏ thật từ từ dung dịch I2 0,1N vào cốc nước cất, vừa nhỏ vừa dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi màu của dung dịch trong 2 cốc như nhau. Độ màu được tính bằng số ml dung dịch I2 0,1N đã thêm vào dung dịch nước cất. Đây là cách biểu thị độ màu theo thang điểm Brand. Bia vàng: tương ứng 0,6-1,0 ml I2 0,1N Bia nâu : tương ứng 1,0-1,25 ml I2 0,1N Bia đen : tương ứng 4-8 ml I2 0,1N Để chuyển đổi đơn vị màu theo số ml I2 0,1N và độ màu theo đơn vị EBC có thể sử dụng công thức sau: 1 2 3 4 Hình 6.1. Thiết bị đo áp lực CO2 1. Giá đỡ 2. Vít xoắn 3. Đầu nhọn của áp kế 4. Áp kế 105 Độ màu tính theo ml I2 0,1N = 2 36 EBC 18 EBC      × * Xác định độ chua Xác định độ chua trên 10ml bia đã loại bỏ CO2 theo phương pháp trung hòa với phenolphtalein làm chỉ thị. Thông thường độ chua của bia từ 3-4. * Xác định hàm lượng CO2 Phương pháp áp lực Nguyên tắc Đo áp suất khí trong cổ chai bia, kết quả đo được thể hiện trên áp kế. Tại nhiệt độ xác định, áp suất sẽ tỷ lệ với nồng độ CO2. Dụng cụ: - Dụng cụ đo áp lực như hình vẽ - Bình cách thủy - Nhiệt kế Tiến hành Trước khi xác định hàm lượng CO2, chai bia cần đượclàm lạnh hoặc làm ấm đến 25 ± 0,50C. Vì vậy cần nhúng chai bia lạnh vào bình cách thủy ở nhiệt độ 250C trong 1h. Sau đó lấy ra lau khô bên ngoài chai. Đặt chai bia vào giá (1). Tiếp đến vặn vít (2) để nâng đầu chai lên, khi nút chai gần tiếp xúc với đuôi áp kế (3), điều chỉnh đuôi áp kế cắm thẳng vào giữa nút chai. Sau đó, vặn vít và nâng chai cho nút chạm vào đuôi áp kế, cao su bọc đuôi áp kế sẽ bị nén và do đó đuôi nhọn của áp kế sẽ chọc thủng nút chai và áp lực CO2 sẽ được biểu thị trên áp kế. Đánh dấu mức bia trong chai, sau đó rót bia ra cốc tráng sạch rồi đổ nước tới ngấn đã đánh dấu. Tiếp theo dùng pipet hay rót thêm nước đến đầy tràn như ban đầu. Lượng nước cho thêm vào chính là thể tích CO2 và cả không khí chiếm trong chai (tính theo ml). Kết quả Hàm lượng CO2 được tính theo công thức sau: CO2 = (P + 1).(X + A) Trong đó: P : chỉ số đọc trên áp kế X : hằng số hòa tan của CO2 trong bia A : hệ số phụ thuộc CO2 chiếm trong chai * Xác định hàm lượng etanol Hàm lượng cồn trong bia được xác định bằng cách chưng cất bia, xác định tỉ trọng ở 200C của dịch cất. Từ tỷ trọng của dịch cất có thể xác định hàm lượng cồn bằng cách tra bảng độ rượu (%v/v) theo tỷ trọng của dung dịch etanol ở 200C. Hàm lượng cồn của dịch cất chính là hàm lượng cồn của bia. Để xác định tỷ trọng dùng tỉ trọng kế. 6.5.1.4. Kiểm tra vi sinh vật 106 * Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Đối với bia đóng chai thì pha loãng thành các đậm độ 1/10, 1/100, 1/1000. Đối với bia đựng trong thùng thì pha loãng thành các đậm độ 1/10, 1/100, 1/1000. Lấy mỗi đậm độ trên cho vào 3 hộp lồng, mỗi hộp 1ml. Đổ thêm 15ml thạch glucoza 1% đã chảy, để nguội 450C, sau khi thạch đông đem để vào tủ ấm 370C. đọc kết quả sau 24 – 48h. Cách đọc và tính kết quả giống ở chương 5. * Tìm tế bào nấm men còn sống sót Phương pháp trực tiếp Đem 100ml bia ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút, lấy cặn phết kính nhuộm đơn và soi kính. Với phương pháp này việc phân biệt tế bào nấm men còn sống và đã chết đòi hỏi phải lành nghề. Phương pháp gián tiếp Nuôi cấy là phương pháp thông dụng nhất. Dùng 3 hộp lồng. Mỗi hộp cho 1ml bia, sau đó đổ môi trường Sabouraud đã điều chỉnh pH về 4,5 – 5,5, để ở nhiệt độ phòng, sau 24 – 48 giờ, đếm số khuẩn lạc nấm men và tính số trung bình như đã áp dụng để đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí. * Xác định E. Coli Dùng phương pháp Vincent Cách tiến hành: Trên mỗi ống Vincent đặc, cho vào mỗi ống 0,34ml dung dịch acid phenic 5% và cấy vào mỗi ống 10ml bia. Trên 3 ống Vincent loãng, cho vào mỗi ống 0,17ml dung dịch acid phenic 5% và cấy vào mỗi ống 10ml bia với nồng độ như sau: + ống 1: 1ml bia nguyên chất + ống 2: 1ml bia pha loãng 1/10 + ống 3: 1ml bia pha loãng 1/100 Cấy xong, lắc đều ống Vincent và để vào tủ ấm 420C, trong 24-48 giờ. Cứ mỗi môi trường trên bị đục là phải cấy chuyển sang canh thang lactozơ có ống Durham và sang dung dịch pepton. Để vào tủ ấm 420C, trong 24-48 giờ rồi tìm phản ứng Indol như ở chương 5. Nếu có phản ứng Indol, đồng thời môi trường lactozơ bị đục và sinh hơi thì coi là có E. Coli. Mỗi ống Vincent đặc được coi là có 20 E. Coli, còn ống Vincent loãng thì tính theo độ pha loãng của dịch mẫu cấy vào: Dịch cấy vào không pha loãng mà dương tính được coi là có 1000 E. Coli. Dịch cấy vào pha loãng 1/10 mà dương tính được coi là có 10.000 E. Coli. Dịch cấy vào pha loãng 1/100 mà dương tính được coi là có 100.000 E.Coli. * Xác định Clostridium Welchii Cách chuẩn bị và tiến hành như chương 4, 5. 107 Tính kết quả: Chia số khuẩn lạc đếm được cho 10 và nhân với 1000 để biết số vi khuẩn có trong 1 lít bia. * Xác định vi khuẩn gây bệnh: chủ yếu là tìm tụ cầu vàng Cấy 1ml bia vào canh thang glucozơ 1%, để vào tủ ấm 370C, trong 24giờ. Cấy chuyền sang môi trường Chapman, nếu tìm thấy cầu tụ thì tìm tính chất đông huyết tương của tụ cầu. Nhận định kết quả: Đối với bia đóng chai đã được tiệt khuẩn theo phương pháp Pasteur: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 100/lít. - Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii, E. Coli. - Không được có nấm men. Đối với bia hơi bán lẻ: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 100/lít. - Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii, E. Coli. - Không được có nấm men. - Tế bào nấm men không được quá 20. 6.5.2. Rượu 6.5.2.1. Rượu trắng * Xác định trạng thái cảm quan Xác định màu sắc, độ trong Dùng 2 ống so màu có độ đường kính và chiều dài bằng nhau. Rót 20ml rượu trắng vào một ống nghiệm, 20ml nước cất vào ống nghiệm kia, đặt 2 ống nghiệm trên nền trắng ở chỗ sáng để so sánh màu sắc, độ trong. Màu sắc, độ trong của 2 ống phải như nhau. * Xác định chỉ số lý hóa Xác định độ rượu Dùng tỷ trọng kế: xem phần bia Dùng bình tỷ trọng: - Bình tỷ trọng có nhều loại khác nhau nhưng đều dựa trên nguyên tắc so sánh khối lượng của chất lỏng với nước cất cùng thể tích. - Để đo bằng bình tỷ trọng, đầu tiên phải rửa bình thật sạch, sấy khô và làm sạch trong bình hút ẩm, sau đó đem cân bình không ta thu được a gam. - Tiếp theo rót nước cất vào bình đến trên ngấn định mức, đặt vào nồi cách thủy, có nhiệt độ 200C. Sau 15 phút, dùng giấy lọc thấm nước đến ngấn bình đồng thời thấm khô phần không chứa nước, lau khô nước và đậy lại. Lấy bình ra khỏi nồi điều nhiệt, lau khô phía ngoài bình đem cân được b gam. Tiếp theo đổ nước khỏi bình, tráng bình từ 2 đến 3 lần bằng dung dịch cân đo tỷ trọng rồi cùng rót chất lỏng tới vạch, sau đó làm tương tự như khi bình chứa nước, giả sử bình chứa dịch cân được c gam. Chú ý: Sau khi định mức chất lỏng ở 200C vừa tới ngấn, nhiệt độ sẽ tăng và mức chất lỏng sẽ cao hơn ngấn cũ. Điều này không làm ảnh hưởng đến kết quả. 108 Tỷ trọng chất lỏng so với nước cùng nhiệt độ 200C sẽ là: ab ac d 2020 − − = Căn cứ vào tỷ trọng tra Phụ lục, ta sẽ biết % rượu trong chất lỏng. Trường hợp khi đo nhiệt độ chất lỏng khác 200C nhưng biết rõ nhiệt độ khi cân nước vẫn là 200C, ta có thể chuyển dt sang d20 theo bảng, rồi tiếp đó tra phụ lục để biết nồng độ rượu. Dùng cồn kế: (rượu kế thủy tinh, tửu kế, thước đo độ rượu) - Rót rượu vào ống đong đặt thẳng đứng, ống đong phải sạch, khô, phải tráng qua dung dịch đo. Nhiệt độ khi đo cần làm lạnh hoặc gia nhiệt đến xấp xỉ 200C. - Từ từ nhúng cồn kế vào, buông tay để cồn kế nổi tự do, rồi đọc kết quả. Làm 2-3 lần, lấy kết quả trung bình. Khi đọc phải đặt ngang tầm mức chất lỏng, không đọc phần lồi hay phần lõm. Dùng cân tỷ trọng: Cân tỷ trọng cũng dựa trên sức đẩy Archimedes và có cấu tạo như hình. Dung dịch rượu hoặc chất lỏng bất kỳ được rót vào ống đong, sau đó nhúng thỏi thủy tinh được treo trên móc thăng bằng. Chất lỏng sẽ đẩy thỏi thủy tinh một lực m, tùy theo tỷ trọng d của chất lỏng lớn hay bé, cán cân sẽ bị lệch so với thăng bằng với nước cất lúc ban đầu. Bằng cách đặt và thay đổi các quả cân A1, A, B, C, D vào các vị trí sao cho cân trở lại trạng thái cân bằng. Đọc trên cán cân và các vị trí các quả cân ta sẽ có tỷ trọng trực tiếp của chất lỏng ở nhiệt độ t. Khi treo A1 vào để cân các chất có d > 1, còn đối với rượu và các chất lỏng có d < 1 thì không cần móc A1 vào. Khi cân thăng bằng với nước cất cần tiến hành ở nhiệt độ 200C, còn với dung dịch có thể đo ở nhiệt độ 200C, rồi cũng hiệu chỉnh theo bảng và sau đó làm tương tự như khi xác định tỷ trọng bằng bình tỷ trọng kể trên. Xác định hàm lượng acid Dùng pipet hút 5ml rượu mẫu vào bình tam giác 250ml, cho thêm 15-20ml nước cất để sau đó dễ nhận màu. Cho vào vài giọt phenolphtalein và dùng NaOH 0,1N để chuẩn cho đến khi có màu phớt hồng. Kết quả: Hàm lượng acid (theo acid axetic) )l/mg(1000. V 1000.V.006,0 Acid 1= Trong đó: V1 : Thể tích dd NaOH 0,1N đã dùng, ml V : Thể tích rượu đem dùng, ml 0,006 : Hệ số tương ứng với acid axetic Xác định hàm lượng Este Nguyên tắc Hàm lượng este được xác định dựa vào phản ứng xà phòng hóa: CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5OH 109 Tiến hành - Cho vào bình cầu 50ml rượu đã trung hòa acid, 50ml nước cất và 10ml dung dịch NaOH 0,1N. - Lắp hệ thống nước làm mát, bật điện. - Đun dung dịch trong bình cầu ở nhiệt độ 80 – 1000C, thời gian 1h. - Rút điện, tắt nước làm mát, làm nguội bình cầu. - Hút chính xác 10ml H2SO4 0,1N cho vào bình cầu, 1-2 giọt phenolphtalein (P.P). - Chuẩn độ dung dịch trong bình tam giác bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng thì ngừng. Ghi thể tích dung dịch NaOH tiêu tốn. Tính kết quả Hàm lượng este (theo este acetat) )/(1000. 1000..0088,0 1 lmg V V Este = Trong đó: V1 : Thể tích dd NaOH 0,1N đã dùng, ml V : Thể tích rượu đem dùng, ml 0,0088 : Hệ số quy về etyl acetat Xác định hàm lượng Aldehyt Nguyên tắc Hàm lượng aldehyt được xác định dựa vào phương pháp Iod CH3CHO + NaHSO3 → CH3CH(OH)NaSO3 NaHSO3 + I2 + H2O →HCl NaHSO4 + 2HI + NaHCO3 CH3CH(OH)NaSO3  → 3 NaHCO CH3CHO + NaHSO3 NaHSO3 + I2 + H2O → NaHSO4 + 2HI Tiến hành Lấy 50ml rượu cho vào bình nón 250ml, thêm 25 ml NaHSO3 1,2%, lắc đều và để 1h. Sau đó cho vào 5-7ml dd HCl 1N và dùng dung dịch I2 0,1N để oxy hóa lượng NaHSO3 dư với chỉ thị là dung dịch tinh bột 0,5%. Tiếp đến, thêm vào bình 25ml NaHCO3 để giả phóng lượng NaHSO3 và aldehyt. Sau 1 phút, dùng dung dịch I2 0,01N để chuẩn lượng NaHSO3 vùa được giải phóng do kết hợp với aldehyt lúc ban đầu. Phản ứng được xem là kết thúc khi xuất hiện màu tím nhạt. Song song đó làm một thí nghiệm trắng để kiểm chứng, thay 50ml rượu bằng 50ml nước cất. * Tính kết quả Hàm lượng aldehyt được xác định theo công thức: )/( 1000.22,0).( 0 12 lmg V VV Aldehyt − = Trong đó: V2 : Thể tích dd I2 0,01N đã dùng trong thí nghiệm thực, ml V1 : Thể tích dd I2 0,01N đã dùng trong thí nghiệm kiểm chứng, ml 110 0,22 : Số ml aldehut acetic tương ứng với 1ml dung dịch I2 0,01N 6.5.2.2. Rượu mùi * Xác định trạng thái cảm quan Xác định màu sắc, độ trong Lấy 100ml rượu mùi cho vào cốc thuỷ tinh không màu dung tích 150ml. Đem quan sát màu của rượu mùi và sự vẫn đục của rượu trong ánh sáng thường, trên nền trắng. Xác định mùi vị: giống như phần rượu trắng * Xác định chỉ số lý hóa Xác định độ rượu Mỗi loại rượu mùi khác nhau đều có một độ rượu khác nhau, khi xuất ra phải đúng độ rượu quy định và quy định chung chỉ sai số 10 mà thôi. Việc phân tích độ rượu chính xác sẽ đảm bảo cho việc quyết định sản xuất và hợp đồng thương mại. Tiến hành: - Cho chính xác 200ml rượu mẫu vào bình cầu dung tích 500ml, cho thêm đúng 100ml nước cất rồi lắp vào ống sinh hàn đặt lên bếp cất. - Chú ý không nên đun quá sôi mà cho rượu sôi nhẹ đều, muốn vậy không nên đặt bình trực tiếp mà nên đặt cao lên một chút hoặc trên một lớp đệm amiăng. Nếu bếp có bộ điều chỉnh nhiệt thì tốt. Ở dưới ống sinh hàn hứng rượu ra bằng một bình có dung tích 250ml, cho vào bình một ít nước cất trước, mục đích là để rượu cất ra sẽ bay hơi vì bao giờ đợt đầu rượu bốc ra sẽ cao độ. - Lấy ra 190ml và thêm nước vào cho đủ 200ml. Lắc đều dùng thước đo cồn và nhiệt kế cồn đo rồi dùng bảng tra đọc kết quả. Xác định hàm lượng acid Giống như phần rượu trắng Kết quả: Hàm lượng acid (theo acid acetic) )l/mg(1000. V 1000.V.0064,0 X 1= Trong đó: V1 : Thể tích dd NaOH 0,1N đã dùng, ml V : Thể tích rượu đem dùng, ml 0,0064 : Hệ số tương ứng với acid acetic Xác định hàm lượng saccharose Tiến hành: - Lấy chính xác 10ml rượu mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml, cho thêm đúng 30ml nước cất rồi đun trên bếp điện 10 phút để bay hết hơi rượu. Cho thêm 8ml HCl 5%, lắc đều rồi đặt trên bếp cách thủy 800C trong 5 phút. 111 - Làm nguội bình tam giác đến nhiệt độ phòng, thêm 4-5 giot P.P, dùng NaOH 20% để trung hòa hết axit đến khi gần chuyển màu thì dùng NaOH 0,1N chuẩn cho đến khi dung dịch chuyển sang màu phớt hồng thì dừng. - Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức dung tích 250ml, dùng nước cất tráng bình tam giác rồi chuyển sang bình định mức (2-3 lần). Thêm nước cất đến vạch. - Tiến hành xác định hàm lượng đường khử trong bình định mức bằng phương pháp Bertrand (hoặc phương pháp metylen xanh). Tính kết quả Hàm lượng đường có trong mẫu thử Đ = 4KMnO V .6,36 (mg) Hàm lượng đường tính bằng g/l rượu mẫu: 95,0. 100.1000.5 1000.250.a X = (g/l) Trong đó: 6,36 : Số mg đường tương ứng với 1ml dung dịch KMnO4 0,1N a : Số ml đường được tra bảng theo phương pháp Bertrand 250 : Dung tích bình định mức. 1000 : Chuyển ra lít. 0,95 : Hệ số chuyển đổi ra đường Saccharose 5 : Dung tích mẫu hút xác định bằng phương pháp Bertrand (ml) 1000 : Chuyển ra gam. 100 : Dung tích rượu lấy ban đầu (ml) Định tính Saccharin - Saccharin là hợp chất amit của acid octo-sunfuabenzoic. - Công thức: - Saccharin có độ ngọt gấp 500 lần đường Saccharose. Cách định tính: - Cách 1: Lấy 20ml mẫu vào cốc đun, thêm 5ml H2SO4 đậm đặc (hay HCl đậm đặc), đun nóng trên bếp điện. Nếu thấy phát hiện có mùi phenol bay ra là chứng tỏ có Saccharin. - Cách 2: Về mặt thử cảm quan, cảm giác ngọt của đường Saccarozơ đến mau hơn và chóng hết hơn, còn đường Saccharin thì đến chậm hơn và dư vị ngọt lâu hơn. Xác định phẩm màu Nguyên tắc: Từ dung dịch phẩm màu chiết xuất được từ mẫu thử. Dùng phương pháp sắc ký giấy tách các phẩm màu và so sánh với các sản phẩm màu chuẩn đã có, có thể định CO S NH OO 112 tính được chúng. Để tách được phẩm màu từ thực phẩm có thể dùng phương pháp nhuộm len hoặc chiết bằng dung môi. Dụng cụ thiết bị, nguyên liệu, hóa chất - Micropipet chia đến µl hoặc ống mao quản. - Bình chứa dung môi chạy sắc kí giấy. - Giấy sắc kí. - Các dung dịch phẩm màu để so sanh (đã biết hàm lượng màu). - Các hệ dung môi chạy sắc kí (tùy theo loại phẩm màu đã chọn hệ dung môi phù hợp). + Hệ dung môi 1: trinatri citrat-amoniac-nước 2:5:93 + Hệ dung môi 2: etanol-amoniac-nước 2,5:2,5:85 + Hệ dung môi 3: n.butanol-etanol-nước 2:1:1 + Hệ dung môi 4: phenol-etanol-nước 8:5:8 + Hệ dung môi 5: phenol-nước-amoniac 8:2:1 + Hệ dung môi 6: piridin-isobutanol-nước 8:6:3 + Hệ dung môi 7: etyl acetat-piridin-nước 50:25:20 Tiến hành: Bước 1: Chọn sắc ký giấy Cần phải chọn kích thước của giấy sắc ký sao cho đường kính (sau khi đã cuộn thành hình trụ) nhỏ hơn từ 2 - 3 cm so với đường kính của bình chứa dung môi chạy sắc ký, chiều cao của cuộn giấy thấp hơn chiều cao của bình ít nhất là 5cm, nhưng không thấp hơn 35cm. Phía cuối của giấy sắc ký, cách mép giấy khoảng 3cm, kẻ một đường thẳng bút chì, chia đường đó thành những đoạn bằng nhau, cách nhau 2 - 3 cm, hai đầu cách mép giấy 2 - 3 cm. Bước 2: Chuẩn bị bình sắc ký Bình thủy tinh có nắp đậy kín được, kích thước của bình phụ thuộc vào kích thước của giấy. Nếu các chất của giá trị Rf gần bằng nhau thì cần giấy dài hơn nên bình phải cao. Chiều cao của bình thường là 40 - 50 cm, còn chiều rộng của bình thường là 20cm để có thể làm nhiều mẫu cùng một lúc. Đổ dung môi vào bình sắc ký một lớp dày 15mm, sau đó đậy nắp bình. Sau 2 giờ tạo được một trạng thái bão hòa hơi dung môi trong bình. Bước 3: Chấm mẫu thử lên giấy Chấm trên cùng đường thẳng đã chia ở trên 2 chấm dung dịch cần thử, xen kẽ vào giữa là những chấm dung dịch phẩm màu chuẩn. Lượng dung dịch hút để chấm lên giấy sao cho xuất hiện những vết có đường kính 2 - 4cm. Chú ý chấm những chấm nhỏ để khô, rồi chấm tiếp giọt sau để đảm bảo vết chấm cuối cùng có đường kính nhỏ nhưng chứa được đủ thể tích yêu cầu và chú ý lượng dung dịch mẫu thử và lượng dung dịch phẩm màu chuẩn phải gần tương đương nhau. Sau khi các vết chấm đã khô, cố định giấy sắc ký (cuộn lại thành hình trụ) sao cho 2 mép giấy còn cách xa nhau một khoảng là 1cm. Trường hợp các vết chấm trên giấy chưa khô hoàn toàn thì có thể dùng 113 máy sấy tóc hoặc để ra ngoài không khí 1h để độ ẩm các điểm trên giấy trở nên như nhau. Cho chạy dung môi và phát hiện vết: Đặt cuộn giấy vào bình sắc ký đã chuẩn bị trước, chú ý đừng để chạm vào thành bình. Trong thời gian này dung môi lan truyền từ từ trên giấy. Việc chạy sắc ký hoàn toàn khi đường mức của dung môi đã truyền gần tới đầu phía đối lập của tờ giấy khoảng 25cm. Thời gian cần thiết khoảng 1-12 h phụ thuộc vào từng loại phẩm màu và từng hệ dung môi. Kết thúc quá trình sắc ký, lấy cuộn giấy ra. Vạch vị trí của đường mức dung môi và làm khô trong tủ hút. Sau khi giấy khô có thể đọc được kết quả bằng mắt hoặc soi ở ánh sáng đèn tử ngoại. Để tính giá trị Rf của các phẩm màu đã được phân chia, đánh dấu vị trí trung bình của các vết và đường mức dung môi, rồi đo khoảng cách từ đó đến đường xuất phát. Nếu ký hiệu a: khoảng cách từ đường xuất phát tới tâm của vết chấm đã được phân chia. Và b: khoảng cách từ đường xuất phát tới mức của dung môi. Thì giá trị Rf được tính bằng công thức sau: Rf = b a Đánh giá kết quả sắc ký đồ: Giá trị tuyệt đối của Rf rất khó xác định vì phải làm trong những điều kiện thật giống nhau. Tuy vậy, có thể định tính bằng cách làm sắc ký so sánh với một chất phẩm màu chuẩn (Bảng 6.1). Sau khi chạy sắc ký, ta so sánh vị trí của các vết (mẫu thử và phẩm màu chuẩn). Nếu ta thu được: − Màu của các vết giống nhau. − Giá trị Rf gần giống nhau. Sau khi làm sắc ký ít nhất với hai hệ dung môi thì có thể kết luận là hai chất như nhau. Bảng 6.1. Định tính các phẩm màu. Phù hợp Phẩm màu và hỗn hợp phẩm màu để so sánh Nồng độ phẩm màu Hệ dung môi Phẩm vàng: Tartrazine CI.19140 0,2 1,2,3,6 Phẩm vàng acid: Fast yellow AB CI. 13015 0,3 1,2,3,6 Phẩm đỏ: Fonceou 4R CI. 16225 0,2 1,2,3 Phẩm đỏ: Amoranth CI. 16185 0,2 1 Phẩm đỏ: Erithrosine CI. 45430 0,1 3,4 Phẩm xanh: Indigocarmine CI. 73015 0,1 3,5,6,7 Phẩm đen: Brilliant black CI. 28440 0,2 3,6 Tartrazine ponceau 4R 0,4 1 Tartrazine Indigocarmin 4R 0,4 5 114 Tartrazine + Ponceau 4R + Brilliant black 0,6 Tartrazine + Amoranth + Indigocarmin 0,6 Tartrazine + Amoranth + Brilliant black 0,6 Phẩm màu vàng mặt trời: Sunset yellow FCH CI. 15985 0,2 1,2,3,6 6.5.3. Nước giải khát nhân tạo Nước giải khát nhân tạo được pha chế từ nước đường với acid hữu cơ, tính dầu thực phẩm, nén khí CO2, có hoặc không có pha thêm màu thực phẩm. 6.5.3.1. Xác định trạng thái cảm quan Một mẫu nước giải khát tốt nếu trong suốt, không có vẩn đục, không có cặn hay vật thể nhỏ, màu nhạt. Mùi vị êm dịu, ngọt mát, hơi chua, có vị tê lưỡi của khí CO2. 6.5.3.2. Xác định các chỉ số lý hóa * Xác định độ chua: giống phần rượu mùi * Xác định hàm lượng đường tổng số Xác định đường tổng số theo phương pháp Betrand, sau khi thủy phân mẫu thử 700C trong 7 phút (xem phương pháp Betrand ở chương 3). * Xác định hàm lượng CO2: Xác định hàm lượng CO2 theo phương pháp áp lực (xem chi tiết ở phần xác định CO2 của bia). * Định tính saccarin (giống phần rượu mùi) * Xác định phần màu (giống phần rượu mùi) 6.5.3.3. Xác định các chỉ số vi sinh (giống phần rượu mùi) Đối với các nước giải khát bán lẻ thì kiểm nghiệm ngay, còn nước giải khát đóng chai phải loại bỏ CO2 rồi mới kiểm nghiệm. Các chỉ tiêu vi sinh cần xác định bao gồm: − Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí. - Xác định tổng số nấm men, nấm mốc. − Xác định E.Coli. - Xác định vi khuẩn gây bệnh. − Xác định Clostridium Welchii. Nhận định kết quả: Đối với nước giải khát nhân tạo bán lẻ: − Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 5000/lít. − Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii. − Chỉ số E.Coli chỉ được phép 20. - Tế bào nấm men không được quá 20. Đối với nước giải khát nhân tạo đóng chai − Tổng số vi khuẩn hiếu khí không được quá 5000/lít. − Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii, E.Coli. − Không được có nấm men, nấm mốc. Không được có vi khuẩn gây bệnh, Clostridium Welchii. 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hoàng Minh Châu (2002), Cơ sở hóa học phân tích – NXB KHKT, Hà Nội, 2002. 2. Bộ y tế Vụ khoa học và đào tạo(2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học 3. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự(1997), Vi sinh vật học, Hà Nội 4. Từ Vọng Nghi (2000), Hóa học phân tích - NXB ĐHQG Hà Nội, 2000. 5. Phạm Luận(1994), Cơ sở lý thuyết hóa phân tích, ĐHTHQG Hà Nội 6. Phạm Luận(1999), Những vấn đề cơ sở của các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích, ĐHTHQG Hà Nội 7. Nguyễn Thị Hiền, Từ Việt Phú, Trần Thanh Đại(2009), Phân tích thực phẩm, Nhà xuất bản trường cao đẳng kỹ thuật- công nghệ Đồng Nai 8. Nguyễn Thị Mận(1998), Phân tích thực phẩm, Trường cao đẳng lương thực thực phẩm Đà Nẵng. 9. Phạm Hải Tùng, Phạm Gia Huệ(1987), Hóa học phân tích, NXB Yhọc, Hà Nội. 10. Skoog D.A.-west D.M. West, HollerF.J(1988), Fundamentals of Analytical Chemistry 5th, ed. Saundes colleeg Publíhing. P.p.557-598