Khảo sát sự tồn tại của gen đề kháng kháng sinh trong nước thải ở 3 bệnh viện tại TP. Hồ Chí Minh

521 KHẢO SÁT SỰ TỒN TẠI CỦA GEN ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH TRONG NƢỚC THẢI Ở 3 BỆNH VIỆN TẠI TP. HỒ CHÍ MINH Hoàng Ngọc Hiếu, Phan Thị Thanh Tuyền, Lƣơng Thị Kiều Hải Khoa Dược, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH) TÓM TẮT Nước thải bệnh viện là một trong những nguồn chứa trung gian quan trọng phát tán các gen đề kháng kháng sinh (Antibiotic resistant genes - ARGs) từ bệnh viện ra môi trường bên ngoài. Mục tiêu của nghiên cứu là khảo sát sự tồn tại của ARGs trong nước thải ở bệnh viện đại học Y Dược, bệnh viện Trưng Vương và bệnh viện Columbia. Mỗi bệnh viện tiến hành lấy 12 mẫu tương ứng với 6 ngày. Các ARGs (aadA1, aac(3)-IV, sul1, dfrA1, ere(A), qnrA, blaSHV, blaCMY, blaCTX-M-group1, blaTEM, blaVIM-2, blaOXA-48, blaNDM-1, blaKPC-2) được kiểm tra theo hướng: cô lập trực tiếp DNA từ mẫu nước thải, sau đó tiến hành PCR trên những DNA đã cô lập để kiểm tra sự tồn tại của ARGs. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các gen sul1 (100%), dfrA1 (66.6%), blaSHV (8.3%), blaCTX (50%), blaKPC (33.3%), blaVIM (8.3%) tại bệnh viện đại học Y Dược; sul1 (100%), dfrA1 (33.3%), blaCMY (8.3%) tại bệnh viện Trưng Vương; và sul1 (75%), dfrA1 (33.3%) tại bệnh viện Columbia. Gen đề kháng xuất hiện đối với các kháng sinh thông dụng như Beta-lactam, Trimethoprim, Sulfonamide, và đáng lưu ý là Carbapenem. Từ khóa: ARGs, gen đề kháng kháng sinh, kháng sinh, nước thải bệnh viện, PCR. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới WHO (2014) về giám sát đề kháng kháng sinh trên toàn cầu, đề kháng kháng sinh đang là mối đe dọa lớn đến sức khỏe cộng đồng liên quan sâu rộng đến nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới. Trong hơn 60 năm qua, việc sử dụng các loại thuốc kháng khuẩn đã trở nên phổ biến. Tuy nhiên cách sử dụng không hợp lý đã dẫn tới sự chọn lọc và lây lan các chủng vi sinh đề kháng. Do đó, mặc dù những nỗ lực sử dụng hợp lý kháng sinh trong điều trị lâm sàng, các loại thuốc kháng khuẩn đã, đang và sẽ trở nên ít hiệu quả hơn hoặc thậm chí không còn hiệu quả, dẫn đến tình trạng gia tăng khẩn cấp về an ninh sức khoẻ toàn cầu (WHO 2014). Gần 50 năm sau thời kì hoàng kim của các kháng sinh, tưởng chừng đã được kiểm soát thì cho đến nay bệnh nhiễm khuẩn lại trở thành nguyên nhân của gần 16% ca tử vong trên toàn thế giới (số liệu của WHO 2015). Ước tính có ít nhất 25000 bệnh nhân ở châu Âu và 23000 bệnh nhân ở Hoa Kỳ tử vong mỗi năm do nhiễm khuẩn vi khuẩn đề kháng kháng sinh (số liệu của CDC, ECDC) [12]. Một kỉ nguyên hậu kháng sinh – nơi mà các bệnh nhiễm trùng thông thường hoặc các vết thương nhẹ có thể gây chết người – không chỉ còn là một tương lại xa vời, thay vào đó là các viễn cảnh thực tế cho thế kỉ 21. Việt Nam được CDDEP (The Center for Disease Dynamics, Economics & Policy) xếp vào nhóm các nước có tỉ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới [5]. Tình hình đề kháng kháng sinh ở Việt Nam cũng theo xu hướng chung của tình hình thế giới, khi các tác nhân có kết quả đề kháng cao với các kháng sinh quan trọng vẫn là các vi khuẩn gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacteriaceae, và vi khuẩn gram dương như MRS. Tỉ lệ đề kháng cao đối với các kháng sinh thông dụng cũng như các kháng sinh quan trọng điều trị nhiễm khuẩn tại bệnh viện như cephalosporins thế hệ thứ 3 và thứ 4, fluoroquinolones, erythromycin, aminoglycoside, carbapenem... [1-4], [7] Trong vòng khoảng 2 thập kỉ trở lại đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu mở rộng trọng tâm nghiên cứu về đề kháng kháng sinh ở môi trường bên ngoài thay vì chỉ tập trung vào các yếu tố lâm sàng. Đối tượng nghiên cứu có thể là nguồn đất, hồ nước, nước thải, chất thải bệnh viện, khu dân cư, chất thải vật nuôi đây là các nguồn chứa quan trọng của các gen kháng thuốc cũng như là nơi quá trình đề 522 kháng có thể xảy ra. Cách tiếp cận này cho thấy một vòng lặp khi các tác nhân ô nhiễm này được xả thải từ các nguồn bệnh sẽ làm gia tăng chung mức độ đề kháng và lượng gen đề kháng trong tự nhiên, từ đó lại xâm nhập lại cơ thể con người thông qua hệ vi khuẩn hội sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh, gia tăng mức độ lây lan và hiệu lực đề kháng của các tác nhân, đã và sẽ làm suy giảm hiệu quả của các kháng sinh [6] Tuy nhiên, các nghiên cứu về đề kháng kháng sinh ở Việt Nam chủ yếu tiếp cận theo góc nhìn lâm sàng, đánh giá tình hình đề kháng ở hệ vi khuẩn tại bệnh viện và bệnh nhân, chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá ở mức độ môi trường và cộng đồng, cũng như chưa có nghiên cứu nào đề cập đến sự liên hệ giữa vi khuẩn đề kháng trong lâm sàng và vi khuẩn đề kháng ngoài môi trường – mà ở đó hệ thống nước thải bệnh viện là một trong các bể chứa trung gian quan trọng. Xuất phát từ lý do đó, đề tài “Khảo sát sự tồn tại của gen kháng kháng sinh trong nước thải ở một số bệnh viện tại TP. Hồ Chí Minh” được thực hiện để khảo sát mức độ tồn tại các gen kháng thuốc ở hệ thống nước thải của một số bệnh viện tại TP. HCM, từ đó bổ sung thêm dữ liệu cho tình hình đề kháng kháng sinh cũng như gợi ý những mối liên hệ giữa vi khuẩn đề kháng trong lâm sàng và ngoài môi trường, góp phần hợp lý hóa việc sử dụng kháng sinh, làm chậm lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc, bảo vệ hiệu lực của các kháng sinh dự trữ. 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Tổng số mẫu gồm 12 mẫu nước thải của bệnh viện Đại học Y Dược, 12 mẫu nước thải của Bệnh viện Columbia và 12 mẫu nước thải của Bệnh viện Trưng Vương. Tại mỗi bệnh viện tiến hành lấy mẫu trong 6 ngày, mỗi ngày lấy 2 mẫu gồm: mẫu đầu vào (chưa xử lý) và mẫu đầu ra (đã xử lý). Các mẫu nước thải được chứa trong chai nhựa sạch có dung tích 500ml và được bảo quản trong điều kiện lạnh 4 o C. 2.2 Tách chiết DNA DNA trong nước thải bệnh viện được tách chiết theo phương pháp Phenol/Chloroform tham khảo từ nghiên cứu của Chomczynski và Sacchi (1987) [13]. Mẫu nước thải được lọc lấy cắn, đem ly giải tế bào ở 60 o C trong 1 giờ bằng CTAB buffer, loại bỏ protein bằng Phenol:Choloroform:Isoamylalcohol tỷ lệ 25:24:1 và tủa DNA bằng Ethanol 99%. 2.3 PCR và nhân bản theo gen mục tiêu Các gen đề kháng kháng sinh mục tiêu được nhân bản bằng phương pháp PCR dựa vào các cặp mồi tham khảo từ các nghiên cứu được trình bày ở bảng 1. Các gen aadA1, aac(3)-IV, sul1, dfrA1, ere(A), qnrA, blaSHV, blaCMY được tham khảo từ nghiên cứu của Momtaz (2012) [8]. Các gen blaVIM-2, blaOXA-48, blaNDM-1, blaKPC-2 được tham khảo từ nghiên cứu của Poirel (2011) [10]. Gen blaCTX-M- group 1 được tham khảo từ nghiên cứu của Pitout (2004) [9] và gen blaTEM được tham khảo từ nghiên cứu của Sharma (2010) [11]. Phản ứng PCR được thiết kế với chu trình luân nhiệt dựa trên chu trình đề nghị của bộ kit Mytaq Mix 2X của Bioline Reagents Ltd cùng với nhiệt độ bắt mồi đã tham khảo từ tài liệu. Sản phẩm PCR sau cùng được kiểm tra trên gel agarose 1.5% và nhuộm DNA bằng GelRed. Bảng 1. Danh sách và trình tự của các ARGs Kháng sinh Gen đề kháng Trình tự gen Kích thƣớc sp (bp) Nhiệt độ bắt cặp (°C) Streptomycin aadA1 (F) TATCCAGCTAAGCGCGAACT (R) ATTTGCCGACTACCTTGGTC 447 58 Gentamycin aac(3)-IV (F) CTTCAGGATGGCAAGTTGGT (R) TCATCTCGTTCTCCGCTCAT 286 55 Sulfonamide sul1 (F) TTCGGCATTCTGAATCTCAC (R) ATGATCTAACCCTCGGTCTC 822 47 Trimethoprim dfrA1 (F) GGAGTGCCAAAGGTGAACAGC (R) GAGGCGAAGTCTTGGGTAAAAAC 367 45 523 Kháng sinh Gen đề kháng Trình tự gen Kích thƣớc sp (bp) Nhiệt độ bắt cặp (°C) Erythromycin ere(A) (F) GCCGGTGCTCATGAACTTGAG (R) CGACTCTATTCGATCAGAGGC 419 52 Quinolones qnrA (F) GGGTATGGATATTATTGATAAAG (R) CTAATCCGGCAGCACTATTTA 670 50 Beta-lactams blaSHV (F) TCGCCTGTGTATTATCTCCC (R) CGCAGATAAATCACCACAATG 768 47 blaCMY (F) TGGCCAGAACTGACAGGCAAA (R) TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC 462 52 blaCTX-M- group 1 (F) GACGATGTCACTGGCTGAGC (R) AGCCGCCGACGCTAATACA 499 55 blaTEM (F) AAAATTCTTGAAGACG (R) TTACCAATGCTTAATCA 1080 50 Carbapenem blaVIM-2 (F) GATGGTGTTTGGTCGCATA (R) CGAATGCGCAGCACCAG 390 52 blaOXA-48 (F) GCGTGGTTAAGGATGAACAC (R) CATCAAGTTCAACCCAACCG 438 52 blaNDM-1 (F) GGTTTGGCGATCTGGTTTTC (R) CGGAATGGCTCATCACGATC 621 52 blaKPC-2 (F) CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG (R) CTTGTCATCCTTGTTAGGCG 798 52 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Bệnh Viện Đại học Y Dƣợc Sản phẩm PCR của 12 mẫu nước thải tại bệnh viện Đại học Y Dược được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen đã được nhân bản đặc hiệu. Trong 14 gen đã được tiến hành, thì có 6 gen có xuất hiện kết quả dương tính (sul1; dfrA1; blaSHV; blaCTX; blaKPC; blaVIM) và 8 gen có kết quả toàn bộ các mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaCMY, blaTEM; blaOXA; blaNDM). Trong đó các mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với các gen lần lượt là: sul1 100%, dfrA1 66.6%, blaSHV 8.3%, blaCTX 50%, blaKPC 33.3 %, blaVIM 8.3%. Các mẫu dương tính đầu ra chiếm tỉ lệ 23,6% trên tổng tất cả các mẫu dương tính (17/72 mẫu) . Kết quả điện di các mẫu dương tính đại diện tại hình 1, hình 2, hình 3, hình 4, hình 5, hình 6. Nghiên cứu trên 12 mẫu đối với 6 gen cho kết quả dương tính được tổng hợp tại Bảng 2. Bảng 2: Nghiên cứu trên 12 mẫu nước thải đối với 6 gen cho kết quả dương tính tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM Mẫu A1 V A1 R A2 V A2 R A3 V A3 R A4 V A4 R A5 V A5 R A6 V A6 R Sulfonamide sul1 + + + + + + + + + + + + Trimethoprim dfrA1 + + - + - + + + - - + + Beta-lactams blaSHV - - - - - - - - - - + - blaCTX-M - + - + - + + + - - + - Carbapenem blaVIM-2 - - - - - - + - - - - - blaKPC-2 + - - + - - - - - - + + Chú thích: A: bệnh viện Đại học Y Dược | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 | V: đầu vào ; R: đầu ra 524 Hình 1: Kết quả điện di dương tính gen sul1 Hình 2: Kết quả điện di dương tính gen dfrA1 Hình 3: Kết quả điện di dương tính gen blaKPC Hình 4: Kết quả điện di dương tính gen blaVIM Hình 5: Kết quả điện di dương tính gen blaCTX Hình 6: Kết quả điện di dương tính gen blaSHV 525 3.2 Bệnh Viện Trƣng Vƣơng Sản phẩm PCR của 12 mẫu nước thải tại bệnh viện Trưng Vương được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen đã được nhân bản đặc hiệu. Trong 14 gen đã được tiến hành, thì có 3 gen có xuất hiện kết quả dương tính (sul1; dfrA1; blaCMY) và 11 gen có kết quả toàn bộ các mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaTEM; blaCTX; blaOXA; blaNDM; blaSHV; blaKPC; blaVIM). Trong đó các mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với các gen lần lượt là: sul1 100%, dfrA1 33.3%, blaCMY 8.3%. Các mẫu dương tính đầu ra chiếm tỉ lệ 22.2% trên tổng tất cả các mẫu dương tính (8/36 mẫu). Kết quả điện di các kết quả dương tính đại diện tại hình7, hình 8, hình 9. Nghiên cứu trên 12 mẫu đối với 3 gen cho kết quả dương tính được tổng hợp tại Bảng 3. Bảng 3. Nghiên cứu trên 12 mẫu nước thải đối với 3 gen cho kết quả dương tính tại bệnh viện Trưng Vương Mẫu B1 V B1 R B2 V B2 R B3 V B3 R B4 V B4 R B5 V B5 R B6 V B6 R Sulfonamide sul1 + + + + + + + + + + + + Trimethoprim dfrA1 - - - - + + - - - - + + Beta-lactams blaCMY - - - - - - - - - - + - Chú thích: B: bệnh viện Trưng Vương | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 | V: đầu vào ; R: đầu ra Hình 7. Kết quả điện di dương tính gen sul1 Hình 8. Kết quả điện di dương tính gen dfrA1 Hình 9. Kết quả điện di dương tính gen blaCMY 526 3.4 Bệnh Viện Quốc tế Columbia Sản phẩm PCR của 12 mẫu nước thải tại bệnh viện Quốc tế Columbia được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% cho băng sản phẩm rõ (dương) chứng tỏ đoạn gen đã được nhân bản đặc hiệu. Trong 14 gen đã được tiến hành, thì có 2 gen có xuất hiện kết quả dương tính (sul1; dfrA1) và 12 gen có kết quả toàn bộ các mẫu âm tính (aadA1; aac(3); ere(A); qnrA; blaTEM; blaCTX; blaOXA; blaNDM; blaSHV; blaKPC; blaVIM; blaCMY ). Trong đó các mẫu dương tính chiếm tỉ lệ với các gen lần lượt là: sul1 75%, dfrA1 33.3%. Các mẫu dương tính đầu ra chiếm tỉ lệ 12.5% trên tổng tất cả các mẫu dương tính (3/24 mẫu). Kết quả điện di các kết quả dương tính đại diện tại hình 10, hình 11. Nghiên cứu trên 12 mẫu đối với 2 gen cho kết quả dương tính được tổng hợp tại Bảng 4. Bảng 4. Nghiên Nghiên cứu trên 12 mẫu nước thải đối với 2 gen cho kết quả dương tính tại bệnh viện Quốc tế Columbia Mẫu C1 V C1 R C2 V C2 R C3 V C3 R C4 V C4 R C5 V C5 R C6 V C6 R Sulfonamide sul1 + + + - + + + - + - + + Trimethoprim dfrA1 + - + - + - - - - - + - Chú thích: C: bệnh viện Columbia | 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 | V: đầu vào ; R: đầu ra Hình 10: Kết quả điện di dương tính gen sul1 Hình 11: Kết quả điện di dương tính gen dfrA 4. KẾT LUẬN Kết quả ban đầu cho thấy tỷ lệ hiện diện của các ARGs là khá cao với các nhóm kháng sinh thông dụng như Beta-lactam, Trimethoprim, và đặc biệt là Sulfonamide với gen đề kháng sul1 hiện diện 100% mẫu trên cả hai bệnh viện Đại học Y dược và Trưng Vương. Gen đề kháng Carbapenem (blaVIM-2 và blaKPC-2) xuất hiện tại mẫu của bệnh viện Đại học Y dược cũng là một kết quả đáng lưu ý khi đây là nhóm kháng sinh quan trọng, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng vi khuẩn gram âm đa kháng tại bệnh viện hiện nay. Kết quả bước đầu cho thấy quy trình khảo sát sự hiện diện của ARGs trong mẫu nước thải ở các bệnh viện của nhóm nghiên cứu là phù hợp, có thể tiếp tục mở rộng nghiên cứu cho các ARGs khác cũng như tại các bệnh viện khác. Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn sự hướng dẫn của thầy Ds. Nguyễn Minh Quân. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cao Minh Nga (2013), "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn klebsiella spp. Và e. Coli sinh ESBL phân lập tại bệnh viện 175", Y Học TP. Hồ Chí Minh. 17 (1), pp. 280-285. [2] Nguyễn Phú Hương Lan (2012), "Khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh của Acinetobacter và Pseudomonas phân lập tại bệnh viện bệnh Nhiệt đới năm 2010", THỜI SỰ Y HỌC. 68 527 [3] Phạm Hùng Vân (2010) "Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình đề kháng imipenem và meropenem của trực khuẩn gram âm dễ mọc kết quả trên 16 bệnh viện tại Việt Nam". [4] Bộ Y Tế (2009), Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009, Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh GARP Việt Nam và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng ĐH Oxford. [5] Antibiotic Resistance, https://resistancemap.cddep.org/AntibioticResistance.php, ngày truy cập 11- 06-2018. [6] Czekalski N. et al. (2014), "Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake", Isme j. 8 (7), pp. 1381-1390. [7] Kim S. H. et al. (2012), "Changing trends in antimicrobial resistance and serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates in Asian countries: an Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP) study", Antimicrob Agents Chemother. 56 (3), pp. 1418-1426. [8] Momtaz H. et al. (2012), Molecular detection of antimicrobial resistance genes in E. Coli isolated from slaughtered commercial chickens in Iran, Vol. 57. [9] Pitout J. D. D. et al. (2004), "Phenotypic and Molecular Detection of CTX-M-β-Lactamases Produced by Escherichia coli and Klebsiella spp", Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), pp. 5715-5721. [10] Poirel L. et al. (2011), "Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes", Diagn Microbiol Infect Dis. 70 (1), pp. 119-123. [11] Sharma J. et al. (2010), "Detection of TEM & SHV genes in Escherichia coli & Klebsiella pneumoniae isolates in a tertiary care hospital from India", Indian J Med Res. 132, pp. 332-336. [12] Carlet J. (2014), "Antibiotic resistance: Protecting antibiotics - the declaration of the world alliance against antibiotic resistance", Indian Journal of Critical Care Medicine : Peer-reviewed, Official Publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 18 (10), pp. 643-645. [13] Chomczynski P. et al. (1987), "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction", Anal Biochem. 162 (1), pp. 156-159. doi: 110.1006/abio.1987.9999.