Khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Thái Nguyên

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 92 KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CHÈ CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT THÁI NGUYÊN Bùi Thị Hà (ĐH Y khoa - ĐH Thái Nguyên) Vi Thị Đoan Chính (Khoa KHTN&XH - ĐH Thái Nguyên) 1. Đặt vấn đề Thái Nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây chè là loại cây chủ đạo, có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, hàng năm những bệnh do vi sinh vật (VSV), mà đặc biệt là do nấm gây ra đã ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và chất lượng sản phNm. Để phòng trừ các bệnh cho chè, người ta thường sử dụng nhiều loại thuốc hóa học, song việc sử dụng hóa chất thường là độc hại cho người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái. Chính vì vây, hiện nay người ta tăng cường các biện pháp đấu tranh sinh học theo hướng sử dụng các tác nhân sinh học để làm hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng, xạ khuNn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ các chủng xạ khuNn có khả năng sinh chất kháng sinh (CKS) ở Việt Nam là khá cao, hầu hết các CKS có nguồn gốc xạ khuNn đều có phổ kháng rộng, đặc biệt có nhiều CKS có khả năng kháng nấm. Xuất phát từ lý do trên và góp phần khai thác nguồn tài nguyên VSV ở Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu điều tra về khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật của xạ khuNn phân lập từ đất Thái Nguyên. Trong bài báo này chúng tôi thông báo kết quả tuyển chọn các chủng xạ khuNn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè. 2.Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu - Các mẫu đất lấy từ các địa điểm khác nhau thuộc tỉnh Thái Nguyên - 3 chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh ký hiệu là: CT-1A, CT-2E, CT-3X - Các môi trường Gause I và ISP 4 để phân lập và giữ giống xạ khuNn, môi trường Czapek và PDA để phân lập và giữ giống nấm 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu đất [1], phân lập xạ khuNn theo [2] - Xác định màu sắc khuNn ty theo Bảng màu của Tresner và Bakus (1963) - Xác định hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khuếch tán trên thạch và đục lỗ - Lên men trên máy lắc tròn 220 vòng/phút. Thời gian lên men 120 giờ ở 280C - Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy theo [1],[3]. 3. Kết quả và thảo luận 3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn sơ bộ Từ các mẫu đất lấy ở độ sâu 5 – 10 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuNn thuộc chi Streptomyces. Sau khi thử hoạt tính kháng sinh (HTKS) theo phương pháp khuếch tán trên thạch với 3 chủng nấm CT-1A, CT-2E, CT-3X, chúng tôi đã sơ bộ tuyển chọn được 30 chủng trong tổng số 80 chủng xạ khuNn có hoạt tính kháng nấm (HTKN) ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 93 So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuNn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây[4], tỉ lệ chủng xạ khuNn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn. Tỷ lệ các chủng xạ khuNn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu của Shirling và Gottlieb [5]. Kết quả trên Bảng 1 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều nhất là nhóm trắng chiếm 36,7%, sau đó là nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh - 25,3%, nhóm hồng – 6,7% và ít nhất là các nhóm nâu và lục đều chiếm 3,3%. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu trước [3],[4]. Tỷ lệ các nhóm màu được thể hiện trên hình 1. Bảng 1. Sự phân bố của xạ khu n có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Nhóm màu xạ khu@n Các chủng có HTKN Tỷ lệ chủng có HTKN so với tổng số (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Trắng (Allbus) 11 36,7 13,7 Xám (Griseus) 8 26,7 10,0 Xanh (Azeureus) 7 23,3 8,6 Hồng (Roseus) 2 6,7 2,6 Nâu (Chromogenes) 1 3,3 1,3 Lục (Viridis) 1 3,3 1,3 Tổng cộng 30 100 37,5 Hình 1. Tỷ lệ các chủng xạ khu n có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu (W:Trắng; G:Xám; B:Xanh; R:Hồng; Br:Nâu; Gr: Lục). Ngoài ra, chúng tôi cũng nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng xạ khuNn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè có sự khác nhau (bảng 2). Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm CT2E là cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), tiếp theo là số chủng kháng nấm TC5X, có 13 chủng (chiếm 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm TC 1A có 9 chủng (chiếm 30%). Đáng chú ý trong số đó, có 4 chủng có khả năng kháng được cả 3 chủng nấm, chiếm tỷ lệ 13,3%, các chủng còn lại phần lớn chỉ kháng được 1 đến 2 chủng nấm. Tỷ lệ các chủng kháng nấm được thể hiện trên hình 2. Bảng 2.Tính đối kháng của xạ khu n với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè Số chủng XK có HTKS 3 chủng nấm gây bệnh chè CT1A CT2E CT5X Cả 3 chủng 30 Tỷ lệ (%) 9 30 16 53 13 43 4 13,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 W G B R Br Gr Nhóm màu W G B R Br Gr Tỷ lệ ch ủ n g (% ) T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 94 Hình 2. Tỷ lệ các chủng xạ khu n có hoạt tính kháng nấm *Kết quả tuyển chọn các chủng xạ khu n có HTKS cao Sau khi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chúng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã chọn ra 3 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục sàng chọn bước 2, đó là các chủng: Đ1, R2 và T6. Ở bước này, các chủng được nuôi lắc trong môi trường ISP-4 để thu dịch nuôi cấy. Căn cứ vào kết quả thử hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ (bảng 3), chúng tôi đã chọn ra được 2 chủng có hoạt tính cao hơn để cho các nghiên cứu tiếp theo, đó là các chủng Đ1 và R2. Bảng 3. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khu n Chủng xạ khu@n Hoạt tính kháng nấm (ĐKVVK – mm) CT1A CT2E CT5X Đ1 12 14 15 R2 12 16 17 T6 11 12 11 Kết quả trên bảng 3 cho thấy: nhìn chung cả 3 chủng xạ khuNn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính, song mức độ kháng đối với các chủng nấm là khác nhau. Khả năng kháng nấm CT1A của các chủng là yếu nhất. Trong số 3 chủng chỉ có 2 chủng Đ1 và R2 là có khả năng kháng được cả 2 chủng nấm CT2E và CT5X với mức độ kháng mạnh nhất (hình 3) Hình 3. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khu n lựa chọn * Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của 2 chủng Đ1 và R2 Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn (hình 4) Chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng hơi xoắn (hình 5) 0 5 10 15 20 25 30 Số chủng XK có HTKN CT1A CT2E CT5X Cả 3 chủng Các chủng nấm T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 95 Hình 4.Cuống sinh bào tử chủng R2(x400) Hình 5. Cuống sinh bào tử chủng Đ1(x400) *Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng R2 và Đ1 trên môi trường ISP – 9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%. Sau 7 – 14 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên bảng 4 Bảng 4. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khu n Đ1 và R2 TT Nguồn cacbon Chủng Đ1 Chủng R2 1 Glucose (Đối chứng dương) + - 2 Saccarose ++ ++ 3 Maltose + - 4 Tinh bột + + 5 Fructose + + 6 Không có đường (Đối chứng âm) - - Ghi chú: ++: sinh trưởng tốt; +: sinh trưởng bình thường, -: Không sinh trưởng Kết quả trên bảng 4 cho thấy: trong 2 chủng nghiên cứu, chủng Đ1 có khả năng đồng hóa được nhiều nguồn cacbon hơn và khả năng đồng hóa tốt nhất là đường saccarose. Chủng R2 cũng như chủng Đ1, đồng hóa tốt đường saccarose nhưng lại không có khả đồng hóa 2 nguồn đường glucose và maltose 4. Kết luận 4.1. Từ các mẫu đất khác nhau, đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuNn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. Trong số các chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám – 26,7%, xanh – 23,3%, hồng – 6,7%, nâu – 3,3%, lục – 3,3%. 4.2. Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuNn là Đ1 và R2 có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT2E và CT5X 4.3. Chủng Đ1 có khả năng đồng hóa tốt nhiều nguồn cacbon và đồng hóa tốt nhất là nguồn đường saccarose. Chủng R2 đồng hóa tốt nguồn đường saccarose nhưng không có khả năng đồng hóa 2 nguồn đường glucose và maltose
T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 96 Tóm tắt Từ các mẫu đất khác nhau của tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập được 80 chủng Xạ khuNn có hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Kết quả đã tìm được 30 chủng có hoạt tính kháng nấm ở các mức độ khác nhau (chiếm 37,5%). Trong số đó nhóm Trắng chiếm 36,7%, nhóm Xám chiếm 26,7%, nhóm Xanh chiếm 23,3%, nhóm Hồng chiếm 6,7%, nhóm Nâu chiếm 3,3%, nhóm Lục chiếm 3,3%. Có 16 chủng (53%) có hoạt tính kháng nấm CT2E, 13 chủng (43%) có hoạt tính kháng nấm CT5X, 9 chủng (30%) có hoạt tính kháng nấm CT1A. Hai chủng Đ1 và R2 đã được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Summary Streptomyces – antagonist isolated from soil in Thai Nguyen to fungal disease on Tea Eigthy Streptomyces strains isolated from soil samples in Thai Nguyen were examined anti-fungal activities by agar streak method. The results showed that 30 isolates exhibited antibiotic activity (37,5%). Among them, white – 36,7%, grey -26,7%, blue – 23,3%, pink – 6,7%, brown- 3,3%, green- 3,3%. 16 strains (53%) possessed antibiotic activity against CT2E fungi, 13 strain (43%) – against CT5X fungi, 9 strain (30%) – aginst CT1A fungi. Two strain Đ1 and R2 was chosen and studied. Tài liệu tham khảo [1].Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, Nxb KHKT Hà Nội, Tr.328 – 345 [2].Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh học vi sinh vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội. [3].Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khu n sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án TS sinh học. [4]. Lê Gia Hy và cộng sự (1992), "Tính đối kháng của xạ khuNn phân lập từ đất Việt Nam đối với bệnh đạo ôn", Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, Tr.11 – 12. [5].ShirlingE.B, Gotilieb D. (1966), Methods for characterization of Streptomyces spectes, international Journal of Systematic Bacteriology, Vol 16, No 3, 313 - 340.