Hoạt tính của proteinase kim loại (MMP-2 và MMP-9) ở bệnh nhân ung thư Đại trực tràng - Hoàng Ngọc Anh

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 279-288 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. HOẠT TÍNH CỦA PROTEINASE KIM LOẠI (MMP-2 VÀ MMP-9) Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Hoàng Ngọc Anh, Nguyễn Văn Hoàn, Bùi Phương Thảo, Lê Lan Phương, Phạm Thị Bích, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Trịnh Hồng Thái* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *thaith@vnu.edu.vn TÓM TẮT: Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về vai trò của các enzyme Matrix Metalloproteinase (MMP) trong quá trình tăng sinh tế bào, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư. Đặc biệt, MMP-2 và MMP-9 là các gelatinase đã được chứng minh là có liên quan với sự tiến triển khối u và di căn ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có công bố nào liên quan đến việc xác định hoạt tính của gelatinase ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 ở mẫu mô đại trực tràng bằng phương pháp điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có bổ sung cơ chất gelatin kết hợp với phân tích hình ảnh bản gel bằng chương trình ImageJ. Kết quả thu được từ 68 bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã cho thấy, hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 tăng lên ở mô u so với mô lân cận u có liên quan tới sự tiến triển của ung thư trên một nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Việt Nam (P<0,01). Hoạt tính tăng của ProMMP-2 và MMP-2 ở mô u có liên quan đến sự xuất hiện hạch di căn và giai đoạn bệnh (P<0,05). Kết quả của chúng tôi đã chỉ rõ vai trò của MMP-2 trong tiến triển ác tính và di căn của khối u và có thể có ích trong xác định bệnh ung thư đại trực tràng. Từ khóa: Gelatin zymography, MMP-2, MMP-9, ung thư đại trực tràng. MỞ ĐẦU Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những ung thư phổ biến nhất trên thế giới trong đó có Việt Nam và đứng thứ 4 về nguyên nhân gây tử vong trong các loại ung thư [16]. Do đó, phát hiện sớm UTĐTT có vai trò quan trọng trong việc điều trị và giảm tỷ lệ tử vong do ung thư này gây ra. Theo dữ liệu thống kê của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ từ năm 2004 đến 2010 cho thấy, tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân được chẩn đoán mắc ung thư đại tràng giai đoạn I là 92% và bệnh nhân được chẩn đoán mắc ung thư trực tràng giai đoạn I là 87% [2]. Vì vậy, việc điều tra nhằm xác định các chỉ thị chẩn đoán và đánh giá tiến triển của bệnh là rất cần thiết nhằm làm giảm nguy cơ tử vong của bệnh này. Matrix metalloproteinase (MMP) là một nhóm enzyme thuộc họ proteinase kim loại có chứa kẽm trong trung tâm hoạt động của phân tử. Các enzyme thuộc nhóm này có khả năng thủy phân protein của lớp gian bào, vì vậy chúng tham gia vào sự điều hòa tăng trưởng và di chuyển của tế bào. MMP đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của tế bào ung thư gồm di chuyển, xâm lấn, di căn và tham gia vào sự hình thành mạch máu của khối u do chúng có khả năng làm suy yếu các liên kết tế bào với tế bào, tế bào với chất nền [6]. Vì vậy, các MMP có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán ung thư. Việc điều tra mức độ biểu hiện của MMP có thể giúp đánh giá tiên lượng bệnh cũng như xác định đích tác động của thuốc trong điều trị bệnh. Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra tiềm năng làm chỉ thị sinh học của MMP-9 và TIMP-1 [8], khả năng trở thành chỉ thị khối u của MMP-2 trong huyết thanh của bệnh nhân UTĐTT [7]. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào liên quan đến việc xác định hoạt tính của gelatinase ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide có bổ sung cơ chất gelatin để phân tích hoạt tính của enzyme gelatinase (gồm MMP-2, MMP-9 và các dạng tiền hoạt động của chúng) nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa các MMP đó với một số đặc điểm bệnh học của một nhóm bệnh nhân UTĐTT ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu gồm 68 cặp mẫu mô u và mô lân cận u (LCU, cách mô u 5-10 cm)) của bệnh nhân UTĐTT thu được ngay sau khi mổ do Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Việt Đức cung cấp. Ung thư biểu mô đại trực tràng được phân loại theo TNM (Tumor-Node-Metastasis) của Tổ chức y tế thế giới (2000). Mẫu enzyme chuẩn dùng trong nghiên cứu gồm ProMMP-2, ProMMP-9, MMP-2 và MMP-9 được cung cấp từ hãng Calbiochem (Hoa Kỳ). Chuẩn bị mẫu: Mẫu mô được cắt nhỏ trong đệm Tris-HCl 50mM (pH 7,5) có chứa NaCl 75mM, Triton X-100 1% và Sodium dodecyl sulfate (SDS) 0,1%. Dịch chiết protein từ mẫu mô thu được bằng cách ly tâm 7.000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút để loại bỏ cặn tế bào và mỡ. Hàm lượng protein tổng số trong mẫu được định lượng bằng phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh bò làm chuẩn. Điện di xác định hoạt tính enzyme MMP: Dịch chiết protein tổng số được điện di bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có SDS được bổ sung cơ chất gelatin của Murname et al. (2009) [13]. Sau khi điện di, bản gel được rửa bằng Triton X-100 2,5% để loại SDS và được ủ với đệm Tris-HCl 50mM (pH 8,0), NaCl 150mM và CaCl2 10mM để khôi phục hoạt tính enzyme. Gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue G-250. Phân tích hình ảnh gel điện di: Sử dụng phần mềm mã nguồn mở ImageJ để phân tích hình ảnh bản gel điện di hoạt tính enzyme MMP dưới dạng 8-bit. Phần mềm giúp phân tích và định lượng các băng hoạt tính thông qua xác định mật độ điểm ảnh (densitometry) của băng đã được số hóa làm cơ sở để so sánh về mức độ biểu hiện của MMP giữa các mẫu nghiên cứu. Giá trị chuẩn hóa của mỗi băng điện di được tính theo công thức sau: Trong đó, Sn là giá trị diện tích băng thứ n trong 1 giếng; ∑S (i:1..n) là tổng giá trị diện tích tất cả các băng trong 1 giếng; X là giá trị hoạt độ chuẩn hóa. Tính toán thống kê: So sánh các đặc trưng thống kê mẫu bằng các test thống kê: t-student, χ2, dấu hiệu, Mann-Whitney U và Kruskal-Wallis. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định băng MMP-2, MMP-9 và dạng tiền hoạt động trên gel điện di Để xác định hoạt tính của các MMP và dạng tiền hoạt động của chúng ở trong mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành điện di cùng với các enzyme chuẩn. Các ProMMP-2 và ProMMP-9 chuẩn cùng với mẫu mô u từ bệnh nhân 39002 (hình 1A) và bệnh nhân 42527 (hình 1B) cũng được hoạt hóa bằng p-aminophenyl-mercuric acetate (APMA) với tỷ 10:1 (2 µl enzyme chuẩn có chứa 2 ng: 0,2 µl APMA 2,5 mM). Kết quả đã xác định được các băng enzyme có hoạt tính gelatinase ở cả mẫu chuẩn và mẫu bệnh nhân. Các băng này được đánh số theo độ di động điện di từ lớn đến nhỏ gồm: băng I-V của mẫu chuẩn và băng 1-6 của mẫu bệnh nhân (hình 1). Trên hình 1, MMP-2 chuẩn được xác định gồm 2 băng chính (băng IV và V, giếng 1, hình 1A và 1B). MMP-9 chuẩn cũng gồm 2 băng chính (băng I và III, giếng 4, hình 1A và giếng 2, hình 1B), ngoài ra MMP-9 còn có một số băng khác có khối lượng phân tử lớn. ProMMP-2 chuẩn gồm 3 băng (băng II, IV và V, giếng 2, hình 1A). Khi được hoạt hóa, hoạt độ của băng II giảm xuống và hoạt dộ băng V tăng lên rõ rệt (giếng 3, hình 1A). Điều này chứng tỏ băng II của ProMMP-2 là dạng tiền hoạt động của băng IV và V. Ở các mẫu bệnh nhân, sau khi được hoạt hóa, cũng có sự thay đổi hoạt độ của 2 băng enzyme (băng 5 và 6 tại giếng 7 và 8, hình 1A và 1B), trong đó hoạt độ của băng 6 tăng lên và hoạt độ của băng 5 giảm xuống sau khi được hoạt hóa. Kết quả phân tích cũng cho thấy băng 5 của mẫu bệnh tương ứng với băng II của ProMMP-2 chuẩn và băng 6 của mẫu bệnh tương ứng với băng IV của MMP-2. Để xác định rõ sự tăng giảm của hoạt độ trước và sau hoạt hóa, chúng tôi đã phân tích bản gel điện di sử dụng chương trình ImageJ. Sự khác biệt về hoạt độ enzyme của băng 5 và băng 6 trong giếng 7 và 8 tương ứng với mẫu mô u của bệnh nhân 39002 (hình 1A) rất khó nhận thấy bằng mắt thường, nhưng khi được phân tích bằng phần mềm ImageJ thì sự khác biệt này đã được nhận ra: Sau khi được hoạt hóa, hoạt độ của băng 5 giảm xuống và hoạt độ của băng 6 tăng lên 1,8 lần (hình 2A và 2B). Hoạt hóa thể hiện rõ rệt với mẫu mô u của bệnh nhân 42527, hoạt độ của băng 6 tăng lên 17,8 lần (hình 2C và 2D). Điều này càng củng cố thêm nhận định cho rằng băng 5 của mẫu tương ứng với băng II của ProMMP-2 chuẩn và băng 6 của mẫu tương ứng với băng IV của MMP-2 chuẩn. A B Hình 1. Điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung cơ chất gelatin A: Giếng 1: MMP-2 chuẩn; giếng 2: ProMMP-2 chuẩn; giếng 3: ProMMP-2 chuẩn + 2,5 mM APMA tỷ lệ 10:1 (ủ 30 phút); giếng 4: MMP-9 chuẩn; giếng 5: ProMMP-9 chuẩn; giếng 6: ProMMP-9 chuẩn + 2,5 mM APMA tỷ lệ 10:1 (ủ 1 giờ); giếng 7: Mẫu mô u của bệnh nhân 39002; giếng 8: Mẫu mô u (39002) + 5 mM APMA tỷ lệ 10:1 (ủ 1 giờ); B: Giếng 1: MMP-2 chuẩn; giếng 2: MMP-9 chuẩn; giếng 7: Mẫu mô u của bệnh nhân 42527; giếng 8: Mẫu từ giếng 7 được hoạt hóa bằng APMA 5 mM APMA ủ trong 1 giờ. Hình 2. Định lượng hoạt độ enzyme trong băng 5 và băng 6 sử dụng chương trình ImageJ (A): Mẫu chưa hoạt hóa từ mô u của bệnh nhân 39002 (phân tích từ giếng 7 của hình 1A); (B): Mẫu sau hoạt hóa từ mô u của bệnh nhân 39002 (phân tích từ giếng 8 của hình 1A); (C): Mẫu chưa hoạt hóa từ mô u của bệnh nhân 42527 (phân tích từ giếng 7 của hình 1B); (D): Mẫu sau hoạt hóa từ mô u của bệnh nhân 42527 (phân tích từ giếng 8 của hình 1B). Thực nghiệm cho thấy, 68 cặp mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT đã được tách chiết và điện di xác định hoạt tính thành công cùng với enzyme chuẩn MMP-2 và MMP-9. Trong đó, enzyme chuẩn có 5 băng, gồm: băng I và III thuộc MMP-9, còn băng II, IV và V thuộc MMP-2 (hình 3A, C, D). Kết quả phân tích cũng đã chỉ rõ các enzyme chuẩn chỉ có hoạt tính khi sử dụng cơ chất gelatin (hình 3A, C, D), nhưng không có hoạt tính ở bản gel cơ chất casein (hình 3B). Điều này chứng tỏ tính đặc hiệu cơ chất của MMP-2 và MMP-9 đối với gelatin. Đối với các mẫu bệnh nhân UTĐTT, có 8 băng được nhận ra (1-8) trong các bản gel cơ chất gelatin, nhưng hoạt độ enzyme rất yếu trong bản gel cơ chất casein. Dựa trên tính đặc hiệu cơ chất gelatin, các băng phân giải cơ chất casein này không thuộc về MMP-2, nhưng có thể thuộc về MMP-9 nếu MMP-9 có nồng độ cao trong mẫu phân tích hoặc các dạng MMP khác như MMP-1, MMP-7, MMP-12 và MMP-13 [13]. A B C D Hình 3. Điện di xác định hoạt tính enzyme trên gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung cơ chất gelatin (A, C và D), cơ chất casein (B) Giếng 1 ở các bản gel: MMP-2 chuẩn; giếng 2 ở các bản gel: MMP-9 chuẩn (gồm các băng: I, II, III, IV và V); giếng 3, 5 và 7 ở các bản gel tương ứng với mẫu mô LCU; giếng 4, 6 và 8 ở các bản gel tương ứng mẫu mô u (các băng của mẫu được đánh theo số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, và 8). Tuy nhiên, không phải 8 băng đều được nhận ra rõ ràng trong tất cả các giếng của bản gel điện di, chỉ có băng 5 tương ứng với ProMMP-2 và băng 6 tương ứng với MMP-2 được nhìn thấy rõ ràng ở hầu hết các bản gel, băng 3 tương ứng với ProMMP-9 và băng 4 tương ứng với MMP-9 được tìm thấy ở một số ít hơn các bản gel (hình 3A, C, D). Băng 8 tương ứng với băng V của MMP-2 chuẩn chỉ được nhìn thấy rõ nhất ở bản gel D của hình 3, không tìm thấy băng nào ở mẫu phân tích tương ứng với băng III của MMP-9 chuẩn. So sánh giữa mô u và mô LCU, đa số các gelatinase có hoạt tính ở mô u mạnh hơn mô LCU, trừ mẫu 10136: hoạt tính enzyme của mô LCU (giếng 5) lại cao hơn mô u (giếng 6) (hình 3C). Như vậy, kết quả phân tích đã nhận ra rõ ràng các băng trong bản gel điện di gồm băng 3 của ProMMP-9, băng 4 của MMP-9, băng 5 của ProMMP-2 và băng 6 của MMP-2. Mức độ biểu hiện hoạt tính của gelatinase ở mô đại trực tràng Các băng enzyme được xác định rõ ràng trên bản gel điện di được đo mật độ điểm ảnh rồi chuẩn hóa số liệu bằng việc sử dụng chương trình ImageJ (bảng 1). Kết quả ở bảng 1 cho thấy, MMP-2, ProMMP-9 và MMP-9 biểu hiện khác biệt ở mô u so với mô LCU là có ý nghĩa thống kê (P0,05). Quan sát trên các bản gel điện di xác định hoạt tính enzyme, băng 3 (ProMMP-9) và băng 4 (MMP-9) của 21 mẫu đã được xác định rõ và được định lượng (bảng 1). Tuy nhiên, băng này ở đa số các mẫu phân tích bị chồng lấn bởi các băng khác, nên được đánh giá thông qua dấu hiệu (+/-) (bảng 2). Bảng 1. Hoạt độ chuẩn hóa của ProMMP-2 (băng 5), MMP-2 (băng 6), proMMP-9 (băng 3) và MMP-9 (băng 4) giữa mô u và mô LCU của bệnh nhân UTĐTT Enzyme Số lượng mẫu Hoạt độ chuẩn hóa P Mô LCU Mô u Mô LCU Mô u ProMMP-2 68 68 20,3 17,5 0,152 MMP-2 68 68 3,6 9,4 1,0E-05 Tỷ số MMP-2/ ProMMP-2 68 68 0,18 0,54 0,015 ProMMP-9 21 21 55,9 43,8 0,020 MMP-9 21 21 0,01 0,05 0,011 Tỷ số MMP-9/ ProMMP-9 21 21 0,03 0,11 0,009 Kiểm định thống kê bằng test t-Student (giá trị P). Bảng 2. Biểu hiện hoạt tính của MMPs ở mô u so với mô LCU ở bệnh nhân UTĐTT Biểu hiện của MMPs Mô u Mô LCU Tần suất (%) MMP-2 (băng 8) ProMMP-9 (băng 3) MMP-9 (băng 4) Giảm - + 16,2 (11/68) 10,3 (7/68) 8,8 (06/68) Không biểu hiện 0 0 67,6 (46/68) 0 16,2 (11/68) Tăng + - 16,2 (11/68) 82,4 (56/68) 64,7 (44/68) Tương đương ~ ~ 0 7,4 (5/68) 10,3 (07/68) Tổng 100 (68/68) 100 (68/68) 100 (68/68) (+): biểu hiện tăng; (-): biểu hiện giảm; (0): không biểu hiện; (~): biểu hiện tương đương. Kiểm định định thống kê bằng test dấu hiệu (giá trị P). Trong số 68 bệnh nhân được phân tích, băng 3 (proMMP-9) được xác định thấy trong cả 68 mẫu, tuy nhiên, băng 4 (MMP-9) chỉ được xác định thấy trong 57 mẫu và biểu hiện của các băng này tăng trong mẫu mô u so với mô LCU (P0,05). Mối liên quan giữa hoạt tính của ProMMP-2 và MMP-2 với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT Hoạt tính của ProMMP-2 và MMP-2 ở mô u của bệnh nhân UTĐTT đã được phân tích theo một số đặc điểm lâm sàng của bệnh. Tuy nhiên, hoạt tính của chúng không phụ thuộc vào độ tuổi, giới tính, mức độ biệt hóa, kích thước khối u và mức độ xâm lấn của khối u ở thành ruột (P > 0,05), nhưng hoạt độ của cả ProMMP-2 và MMP-2 lại phụ thuộc vào tình trạng hạch di căn (P < 0,05). Mặc dù cả ProMMP-2 và MMP-2 đều có xu hướng tăng theo giai đoạn bệnh, nhưng ProMMP-2 thể hiện sự tăng rõ rệt với P < 0,05 (bảng 3). Thống kê ở 68 bệnh nhân thì thấy 48 bệnh nhân không có hạch di căn và 20 bệnh nhân có hạch di căn. Biểu hiện hoạt tính của ProMMP-2 và MMP-2 đều tăng ở nhóm bệnh nhân có hạch di căn (hình 4A). Trong phân loại giai đoạn của bệnh UTĐTT, người ta chia thành 5 giai đoạn (0, I, II, III, IV), trong đó càng đến giai đoạn cuối càng thể hiện rõ hiện tượng di căn. Trong nghiên cứu này, hoạt độ của ProMMP-2 và MMP-2 đã tăng từ giai đoạn I đến giai đoạn III của bệnh (hình 4B). Điều này phản ánh vai trò của MMP-2 liên quan với hiện tượng di căn của UTĐTT. Hình 4. Hoạt độ của ProMMP-2 và MMP-2 theo hạch di căn (A) và giai đoạn bệnh (B) ở bệnh nhân UTĐTT Bảng 3. Mối liên quan giữa hoạt tính của ProMMP-2 (băng 5) và MMP-2 (băng 6) ở mô u với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT Đặc điểm Số lượng mẫu Hoạt độ chuẩn hóa ProMMP-2 MMP-2 Độ tuổi <50 13 9,6 20,8 ≥50 55 10,4 17,9 P* 0,391 0,086 Giới tính Nam 22 15,0 9,3 Nữ 46 18,6 9,5 P* 0,186 0,394 Biệt hóa Cao 4 21,1 8,5 Vừa 57 17,1 9,4 Kém 7 18,6 10,1 P** 0,585 0,959 Kích thước khối u <3,0 18 22,5 11,1 ≥3; ≤3,5 23 17,1 10,2 >3,5 27 14,4 7,7 P** 0,155 0,156 Hạch di căn (N) N0 48 14,8 8,7 N1,2 20 23,8 11,2 P* 0,003 0,036 Mức độ xâm lấn của khối u (T) T2 16 14,4 7,5 T3,4 52 18,4 10,0 P* 0,113 0,147 Giai đoạn bệnh I 14 13,3 6,7 II 34 15,5 9,6 III 20 23,8 11,2 P** 0,022 0,086 Giai đoạn I: T2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0; kiểm định thống kê bằng test t-student (*) và test Kruskal-Wallis (**) (giá trị P). Mối liên quan giữa hoạt tính của ProMMP-9 và MMP-9 với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT Cùng với ProMMP-2 và MMP-2, các băng tương ứng với ProMMP-9 và MMP-9 cũng được quan sát thấy trên bản gel điện di. Các băng này có khối lượng phân tử lớn với độ di động điện di chậm hơn các băng ProMMP-2 và MMP-2 (hình 1). Tuy nhiên, các băng tương ứng với ProMMP-9 và MMP-9 có hoạt tính khá mạnh trong các mẫu phân tích, nên chúng thường chồng lấn lên nhau trong các giếng của bản gel điện di. Do đó, hoạt tính của chúng được đánh giá thông qua dấu hiệu cùng với mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh (bảng 4). Bảng 4. Mối liên quan giữa hoạt tính của ProMMP-9 (băng 3) và MMP-9 (băng 4) với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT Đặc điểm Hoạt độ ProMMP-9 Hoạt độ MMP-9 Số lượng mẫu - + Số lượng mẫu - + Độ tuổi <50 11 0 11 12 2 12 ≥50 42 7 45 38 6 32 P 0,197 0,142 Giới tính Nam 21 2 19 16 3 13 Nữ 42 5 37 34 3 31 P 0,777 0,314 Biệt hóa Cao 7 1 6 6 0 6 Vừa 53 5 48 41 5 36 Kém 3 1 2 3 1 2 P 0,436 0,350 Kích thước khối u <3,0 21 1 20 17 1 16 ≥3; ≤3,5 22 4 18 17 3 14 >3,5 20 2 18 16 2 14 P 0,337 0,570 Hạch di căn (N) N0 47 5 42 36 4 32 N1,2 16 2 14 14 2 12 P 0,838 0,756 Mức độ xâm lấn của khối u (T) T2 18 4 14 14 3 11 T3,4 45 3 42 36 3 33 P 0,076 0,201 Giai đoạn bệnh I 16 4 12 12 3 9 II 31 1 30 24 1 23 III 16 2 14 14 2 12 P 0,078 0,183 (+): biểu hiện tăng; (-): biểu hiện giảm; giai đoạn I: T2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0. Kiểm định thống kê bằng test c2 (giá trị P). Kết quả phân tích ở bảng 4 đã cho thấy, hoạt tính của ProMMP-9 (băng 3) và MMP-9 (băng 4) ở bệnh nhân UTĐTT không phụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng của bệnh gồm: độ tuổi, giới tính, mức độ biệt hóa, kích thước khối u, hạch di căn hạch, mức độ xâm lấn khối u ở thành ruột và giai đoạn của bệnh (P>0,05). So sánh với các nghiên cứu đã công bố trên thế giới, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với một số nghiên cứu về biểu hiện hoạt tính của MMPs trên mô ung thư đại trực tràng. Theo Waas et al. (2002) [17], hoạt tính của gelatinase (dạng enzyme và proenzyme) đều tăng ở mô u so với mô bình thường. Liabakk et al. (1996) [12] cũng chỉ ra sự biểu hiện tăng về hoạt tính của ProMMP-2, MMP-2 và MMP-9 ở mô u so với mô bình thường và dạng u tuyến. Murnane et al. (2009) đã xác định thấy sự biểu hiện hoạt tính của MMP-2 ở 99% đối tượng bệnh nhân ung thư đại trực tràng được nghiên cứu (269 bệnh nhân) và 95% các trường hợp này có MMP-2 tăng ở mô u (cao gấp khoảng 10 lần so với mô bình thường). Cùng với MMP-2, các dạng khác của gelatinase như ProMMP-2 và ProMMP-9, trừ MMP-9 đều tăng hoạt tính ở mô u so với mô bình thường. Trong các gelatinase, xét nghiệm MMP-2 được đánh giá là có hiệu quả nhất trong chẩn đoán sự có mặt của ung thư đại trực tràng với độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng bằng 84% và 93% [13]. Dữ liệu của chúng tôi cũng ủng hộ nhận định này với hoạt tính của MMP-2 được xác định thấy trong tất cả các mẫu được phân tích, hoạt độ ở mô u cao hơn khoảng 3 lần so với mô LCU, băng hoạt tính được quan sát thấy một cách rõ ràng. Trong nghiên cứu này, hoạt độ của ProMMP-2 không có sự khác biệt giữa mô u và mô LCU, nhưng hoạt độ của MMP-2 lại cao hơn ở mô u (bảng 1). Tỷ số MMP-2/ProMMP-2 cũng tăng lên ở mô u so với mô LCU (P<0,05). Điều này có thể do chất ức chế MMP-2 bị giảm ở mô u [3, 9]. TIMP-2 đã được chứng minh là chất ức chế của MMP-2 [1]. Tuy nhiên, TIMP-2 lại có vai trò kép: ức chế hoạt động của MMP-2 và hoạt hóa MMP-2 từ ProMMP-2 theo con đường phụ thuộc vào MT1-MMP [5, 15]. Hoạt hóa MMP-2 được coi như là đặc đặc trưng của hiện tượng ác tính trong UTĐTT [14]. Việc kiểm soát hoạt hóa của của gelatinase có thể giúp ích ngăn ngừa quá trình tiến triển ác tính của khối u [18]. Liên quan đến một số đặc điểm bệnh học của bệnh, kết quả nghiên cứu này cũng tương đồng với một số nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy có mối tương quan dương giữa hoạt tính của MMP-2 với tiềm năng xâm lấn và di căn của khối u [4, 18]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Waas at el. (2002) [17] lại cho kết quả không tương đồng với các nghiên cứu trên: không tìm thấy mối liên quan gữa hoạt tính gelatinase với các đặc điểm lâm sàng của bệnh bao gồm cả mức độ xâm lấn của khối u (T), Theo nghiên cứu này, chỉ có mô chuyển tiếp giữa mô u và mô bình thường của nhóm bệnh nhân có di căn mới có hoạt tính enzyme cao hơn so với trường hợp không có di căn. Nghiên cứu ở mức độ protein trên mô của bệnh nhân UTĐTT, Kostova et al. (2014) [10] đã cho thấy, biểu hiện của MMP-9 có mối tương quan dương với mức độ xâm lấn sâu của khối u, MMP-2 có tương quan dương với sự xuất hiện của hạch di căn. Hơn nữa, các tác giả này còn nhận thấy có mối tương quan dương giữa biểu hiện của MMPs trên mô với mức huyết thanh của CEA, MMP-2 và MMP-9. Nhằm đánh giá khả năng sử dụng MMP như là yếu tố chỉ thị trong dự đoán tiến triển ác tính của UTĐTT, Langenskiöld et al. (2005) [10] đã xác định biểu hiện ở mức protein của gelatinase ở cả mô u, mô bình thường và huyết tương của người bệnh và đã cho thấy biểu hiện của MMP-2 trong huyết tương của bệnh nhân có xuất hiện hạch di căn tăng đáng kể so với những bệnh nhân không có hạch di căn, MMP-2 ở mô u thuộc giai đoạn T3 và T2 cao hơn giai đoạn T4. Họ cho rằng có thể sử dụng MMP-2 trong huyết tương như là yếu tố dự đoán sự tiến triển ác tính của UTĐTT [11] và biểu hiện của MMPs trên mô cũng là một chỉ thị quan trọng đánh giá tiến triển ác tính của bệnh và có thể được sử dụng như yếu tố tiên lượng cho bệnh UTĐTT. KẾT LUẬN Kết quả phân tích từ 68 bệnh nhân UTĐTT đã cho thấy, hoạt tính của MMP-2 và MMP-9 tăng lên ở mô u so với mô lân cận u, hoạt tính của ProMMP-2 và MMP-2 trong mô u tăng lên ở nhóm bệnh nhân có hạch di căn và tăng theo giai đoạn bệnh. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của MMP-2 trong tiến triển ác tính và di căn của khối u và có thể có ích trong xác định UTĐTT. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện nhờ kinh phí của đề tài QGTĐ.13.06 và sự giúp đỡ của BS. Phạm Kim Bình (bệnh viện Việt Đức) về việc cung cấp mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Alizadeh A. M., Shiri S., Farsinejad S., 2014. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol., 35(9): 8483-8523. American cancer society, 2014. Colorectal cancer. cancer/colonandrectumcancer/detailedguide/colorectal-cancer-survival-rates. Tra cứu 01/12/2014. Baker E. A., Bergin F. G., Leaper D. J., 2000. Matrix metalloproteinases, their tissue inhibitors and colorectal cancer staging. Br. J. Surg., 87(9): 1215-1221. Baker E. A., Leaper D. J., 2002. Measuring gelatinase activity in colorectal cancer. Eur. J. Surg. Oncol, 28(1): 24-29. Dollery C. M., Libby P., 2006. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc. Res., 69(3): 625-635. Gialeli C., Theocharis A. D., Karamanos N. K.., 2011. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. FEBS J., 278(1): 16-27. Groblewska M., Mroczko B., Gryko M., Kędra B., Szmitkowski M., 2010. Matrix metalloproteinase 2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2 in the diagnosis of colorectal adenoma and cancer patients. Folia Histochem, Cytobiol., 48(4): 564-571. Herszényi L., Hritz I., Lakatos G., Varga M. Z., Tulassay Z., 2012. The behavior of matrix metalloproteinases and their inhibitors in colorectal cancer. Int. J. Mol. Sci., 13(10): 13240-13263. Hua H., Li M., Luo T., Yin Y., Jiang Y., 2011. Matrix metalloproteinases in tumorigenesis: an evolving paradigm. Cell. Mol. Life Sci., 68(23): 3853-3868. Kostova E., Slaninka-Miceska M., Labacevski N., Jakovski K., Trojachanec J., Atanasovska E., Janevski V., Jovanovik R., Janevska V., 2014. Expression of matrix metalloproteinases 2, 7 and 9 in patients with colorectal cancer. Vojnosanit. Pregl., 71(1): 52-59. Langenskiöld M., Holmdahl L., Falk P., Ivarsson M. L., 2005. Increased plasma MMP-2 protein expression in lymph node-positive patients with colorectal cancer. Int. J. Colorectal Dis., 20(3): 245-252. Liabakk N. B., Talbot I., Smith R. A., Wilkinson K., Balkwill F., 1996. Matrix metalloprotease 2 (MMP-2) and matrix metalloprotease 9 (MMP-9) type IV collagenases in colorectal cancer. Cancer Res,, 56(1): 190-196. Murnane M. J., Cai J., Shuja S., McAneny D., Klepeis V., Willett J. B., 2009. Active MMP-2 Effectively Identifies the Presence of Colorectal Cancer. Int. J. Cancer, 125(12): 2893-2902. Parsons S. L., Watson S. A., Collins H. M., Griffin N. R., Clarke P. A., Steele R. J., 1998. Gelatinase (MMP-2 and-9) expression in gastrointestinal malignancy. Br. J. Cancer, 78(11): 1495-1502. Spinale F. G., 2011. Diversity of Myocardial Interstitial Proteolytic Pathways Gene Deletion Reveals Unexpected Consequences. Circulation, 124(19): 2052-2055. Stewart B. W., Wild C. P., 2014. World cancer report 2014. International Agency for Research on Cancer, France. 26, 560. Waas E. T., Lomme R. M., DeGroot J., Wobbes T., Hendriks T., 2002. Tissue levels of active matrix metalloproteinase-2 and-9 in colorectal cancer. Br. J. Cancer, 86(12): 1876-1883. Zeng Z. S., Cohen A. M., Guillem, J. G., 1999. Loss of basement membrane type IV collagen is associated with increased expression of metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) during human colorectal tumorigenesis. Carcinogenesis, 20(5): 749-755. ACTIVITY OF MATRIX METALLOPROTEINASES (MMP-2 AND MMP-9) IN COLORECTAL CANCER PATIENTS Hoang Ngoc Anh, Nguyen Van Hoan, Bui Phuong Thao, Le Lan Phuong, Pham Thi Bich, Nguyen Thi Tu Linh, Do Minh Ha, Trinh Hong Thai VNU - Hanoi University of Science SUMMARY The role of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in the process of cell proliferation, invasion and metastasis of cancer cells has been reported in some works in the world. In particular, the MMP-2 and MMP-9 which are gelatinases are shown to be in correlation with tumor progression and metastasis in colorectal cancer patient. However, up to now, there is not any work of detecting gelatinase activity in cancer patients of Vietnam. In this research, the activity of MMP-2 and MMP-9 was detected in the tumor and adjacent tissues of colorectal cancer patients by gelatin zymography and gel image analysis using ImageJ program. In the result, the activity of MMP-2 and MMP-9 in 68 patients with colorectal cancer increased significantly in tumor tissues in comparison with adjacent tissues (P <0.01). A correlation between the increased activity of MMP-2 and MMP-9 and a progression of tumor in a group of patients with colorectal cancer in Vietnam was found. The activity of ProMMP-2 and MMP-2 in tumor tissues increased significantly in patients with lymph node metastasis and TNM stage compared with those without (P <0.05). Our result indicated the role of MMP-2 in tumor progression and metastasis and may possibly be useful in detecting the presence of colorectal cancer. Keywords: Colorectal cancer, gelatin zymography, MMP-2, MMP-9 Ngày nhận bài: 22-10-2014