Enzyme và sự xúc tác sinh học

4/10/2013 1 TS. Nguyễn Minh Xuân Hồng Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm – ĐH Nơng Lâm Tp. HCM 1. KHÁI NIỆM: - Chất xúc tác sinh học: vận tốc cao, đặc thù. - Cĩ trong tế bào mọi vi sinh vật - Tham gia phản ứng in vivo và in vitro. - > 2000 enzyme đã được khám phá. - Ứng dụng rộng rãi: CNTP, chăn nuơi, y dược... 4/10/2013 2 2. CẤU TRÚC CỦA ENZYME - Protein: cấu trúc bậc I, II, III, IV. - Cofactor (nếu cĩ): bản chất phi protein. 2.1 Bản chất của enzyme - Thành phần cấu tạo chỉ cĩ protein: một hoặc nhiều chuỗi polypeptide. - Khối lượng phân tử phụ thuộc số lượng chuỗi hoặc chiều dài chuỗi. - 1 Dal = 1,67 * 10-24g 2.1.1 Enzyme một cấu tử 4/10/2013 3 - Ngồi protein (apoenzyme) cịn cĩ thêm cofactor. - Apoenzyme ảnh hưởng đến tính đặc hiệu cơ chất. - Cofactor ảnh hưởng đến đặc điểm phản ứng xúc tác. - Cofactor: + Ion kim loại: Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+ liên kết chặt với apoenzyme. + Dẫn xuất của vitamin: liên kết chặt hoặc lỏng với apoenzyme. 2.1.2 Enzyme nhị cấu tử - Tính hòa tan: tan trong nước  dung dịch keo. - Tính lưỡng cực. - Tính dễ biến tính. - Dễ bị phân giải bởi protease. 2.2. Tính chất lý hóa 4/10/2013 4 - Enzyme một cấu tử Trung tâm hoạt động là nhóm chức của acid amin liên kết lại. Ví dụ: Nhóm SH của cystein Nhóm OH của serin NH 2 của lysin COOH của aspartic và glutamic COOH của AA cuối mạch. 2.3. Trung tâm hoạt động của enzyme - Enzyme hai cấu tử Ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có thêm cofactor (cation kim loại hay coenzyme: nhĩm ngoại, cosubstrate). 4/10/2013 5 3. Cơ chế hoạt động xúc tác của Enzyme 4/10/2013 6 Cường lực xúc tác: - Enzyme có tất cả tính chất của chất xúc tác + Cần sử dụng với một lượng nhỏ. + Sau phản ứng được trả lại nguyên như trạng thái ban đầu. - Ưu điểm của enzyme: Cường lực xúc tác mạnh hơn chất xúc tác vô cơ. Ví dụ: H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 18 Kcalo pt + 11,7 Kcalo Catalase + 5,5 Kcalo 4/10/2013 7 Cơ chế xúc tác - Thuyết hợp chất trung gian (Enzyme) ( cơ chất) (chất trung gian) (Enzyme) (Sản phẩm) Giải thích hệ thống phản ứng đồng thể (Enzyme và cơ chất cùng một trạng thái) 4/10/2013 8 Điều kiện để enzyme kết hợp cơ chất: Đk.1. Thuyết Fisher: Thuyết ổ khóa – chìa khóa Trung tâm hoạt động enzyme có cấu trúc không gian phù hợp với cơ chất. Đk.2. Thuyết tiếp xúc cảm ứng (Koshland) Khi tương tác E và S xảy ra, có sự thay đổi cấu hình không gian của trung tâm hoạt động E sao cho phù hợp với cơ chất S. Thuyết này được giải thích cơ chế tác dụng của: alpha - amilase, ribonuclease, hexokinase 4/10/2013 9 Đk.3. Một số enzyme cần hoạt hóa mới hoạt động được - •Thuyết hấp phụ + Chất xúc tác hấp phụ cơ chất lên bề mặt chúng  nồng độ cơ chất vùng bề mặt chất xúc tác tăng  tạo điều kiện phản ứng xảy ra dễ dàng. + Dùng giải thích cơ chế xúc tác phản ứng giữa 2 chất dị thể . -Ví dụ: Cơ chất thể lỏng (khí) Enzyme thể rắn. 4/10/2013 10 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác 4.1. Nhiệt độ •Aûnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng: + Ở to thấp (0o - 40oC): V khi to  + Ở t o cao: V  khi to  (enzyme biến tính) + 80 o C – 100oC: Đa số enzyme bị mất hoạt tính + t o opt  Vmax (hoạt tính tối đa) + t o opt động vật = 40 o C – 50oC + t o opt thực vật: 50 o C – 60oC Hệ số Q 10 : đo độ nhạy về nhiệt độ của phản ứng enzyme khi nhiệt độ tăng lên 10º. 4/10/2013 11 4.2. Aûnh hưởng của pH pH opt  Vmax pH thay đổi  ảnh hưởng mức độ phân ly của các nhóm  Thay đổi trung tâm hoạt động enzyme  ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa cơ chất Aûnh hưởng của pH 4/10/2013 12 4.3. Aûnh hưởng của nồng độ cơ chất [S] đến vận tốc phản ứng enzyme Phương trình Michaelis-Menten: [S]K [S]V =V M max  Hằng số Michaelis Km = E S E-S - Km: Hằng số Michaelis + [S]   V  + V = Vmax  V không tăng dù S tăng + V = thì Km = S - Hằng số Michaelis đặc trưng cho ái lực enzyme và cơ chất. Km càng nhỏ thì ái lực enzyme và cơ chất càng lớn. 4/10/2013 13 Lineweaver-Burk  1 V0  KM  [S]0 Vmax [S]0  KM Vmax 1 [S]0  1 Vmax Invert both sides:  x - intercept  -1 KM 1 [S]0 1 V0  slope KM Vmax  y - intercept  1 Vmax 4.4 Sự hoạt hóa enzyme - Định nghĩa: Chất hoạt hoá có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme. - Chất hoạt hóa: Ion kim loại – vitamin – chất hữu cơ. 4/10/2013 14 Quá trình hoạt hóa: xảy ra theo 1 trong 4 hướng - Cắt bỏ 1 đoạn peptid kìm hãm  lộ trung tâm hoạt động. Trypsinogen  Trypsin Pepsinogen  Pepsin - Thành lập cầu S-S để hoàn chỉnh trung tâm hoạt động của enzyme. - Thành lập phức hợp với kim loại. - Hoạt hóa nhờ hiện tượng cảm ứng của chất gây hiệu ứng dị không gian. 4.5 Aûnh hưởng của chất kìm hãm (ức chế) lên vận tốc phản ứng. - Định nghĩa chất kìm hãm Chất kìm hãm là chất làm yếu hay ngưng tác dụng xúc tác của enzyme. 4/10/2013 15 Phân loại chất kìm hãm 1) Kìm hãm thuận nghịch - Khi có mặt chất kìm hãm: hoạt tính enzyme yếu; - Khi loại bỏ chất kìm hãm: hoạt tính enzyme bình thường. 1.1) Kìm hãm thuận nghịch cạnh tranh - •Xảy ra khi enzyme không có tính đặc hiệu tuyệt đối - •Chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất E + I EI E + S ES E + P  Khi có chất kìm hãm cạnh tranh, Km tăng, ái lực enzyme – cơ chất giảm  vận tốc phản ứng giảm. 4/10/2013 16 Kìm hãm thuận nghịch cạnh tranh Malonic acid Succinic acid Fumaric acid 1.2) Kìm hãm thuận nghịch không cạnh tranh - •• Chất kìm hãm I gắn vào E tự do và ES. - Cấu trúc I không giống [S]  không có cạnh tranh 4/10/2013 17 1.2) Kìm hãm thuận nghịch không cạnh tranh - Các phản ứng có thể xảy ra I + E EI E + S ES E + P ES + I IES EI + S IES • Vận tốc phản ứng từ ES P bị chậm lại. I có thể gắn ở 1 trung tâm E khác với trung tâm mà S gắn vào (Trung tâm dị không gian). 2) Kìm hãm không thuận nghịch - Chất ức chế [I] liên kết hay phá hủy trung tâm hoạt động của enzyme. - Khi loại [I] enzyme vẫn không trở lại trạng thái ban đầu. 4/10/2013 18 Reversible vs. Irreversible Inhibition Reversible Irreversible Complex formation k1 k1 E + I  EI E + I  EI k-1 Formation rate min, sec usually longer, minutes, hours What you study KI, usually k1 (rate constant) Response to dialysis, gel filtration recover activity no recovery dilution Q10 ≤1.1 usually 2-3 Reversible Inhibition competitive Substrate and inhibitor compete for the same, overlapping, or mutually exclusive sites: there is no ESI.  KI  [E][I] [EI] E + S ES E + P EI + S + I KI X KM k2  Vo  V max [S]0 (1 [I] KI )KM  [S]0 4/10/2013 19 Reversible Inhibition noncompetitive E + S ES E + P EI + S ESI + I KI X KI - I KM k2 KM an inhibitor binds reversibly to E or the ES complex and blocks the catalytic step. Substrate and inhibitor MUST bind independently at separate sites on the enzyme.  Vo  V max [S]0 (1 [I] K I )(K M  [S]0)  [EI]  [E][I] KI  [ESI]  [ES][I] KI Two inhibitory forms of the enzyme Two dissociation constants to account for them Reversible Inhibition mixed type E + S ES E + P EI + S ESI + I KI X KI - I KM k2 KM Substrate & inhibitor binding are neither independent nor mutually exclusive. Binding of one alters K of the other by a factor of   Vo  V max [S]0 K M (1 [I] K I ) [S]0(1 [I] K I )  [EI]  [E][I] KI  [ESI]  [ES][I] KI Two inhibitory forms of the enzyme Two dissociation constants to account for them 4/10/2013 20 Reversible Inhibition uncompetitive  Vo  V max [S]0 K M  [S]0(1 [I] K I ) E + S ES E + P ESI + I KI X KM k2  [ESI]  [ES][I] KI Only one inhibitory form of the enzyme There is no E•I complex Double Reciprocal Plots 1/Vo 1/So Competitive Inhibition [I] 1/Vo 1/So Noncompetitive Inhibition [I] 1/Vo 1/So Uncompetitive Inhibition [I] -1/KM -1/KM -1/KM 1/Vmax 1/Vmax 1/Vmax 4/10/2013 21 Getting KI slope or intercept replots If slope changes (competitive or noncompetitive) If 1/V-intercept changes, (noncompetitive or uncompetitive) For one inhibitor concentration, solve the appropriate equation For more than one [I], plot the parameter (slope or intercept) vs [I] To get KI, divide the intercept of the replot by the slope of the replot  Slope Slope[I]0(1 [I] KI )  Slope Slope[I]0  Slope[I]0 KI [I]  Intercept  Intercept[I]0(1 [I] KI )  Intercept  Intercept[I]0  Intercept[I]0 KI [I] Y = S lo p e o r 1 / V -i n te rc e p t [I]  Slope  Y[I] 0 KI  Intercept  Y[I]0  KI  Replot Intercept Replot Slope Double Reciprocal Plots [I] -1/KM 1/Vmax Mixed Type Inhibition 1/V0 1/[S]0  = 2 Vmax = 100 KM = 2  1 [S]0   1 KM  1 V0  1 Vmax 1 1         slope KM Vmax 1 [I] KI        intercept  1 Vmax 1 [I] KI       4/10/2013 22 5 Tính đặc hiệu của enzyme - Đặc hiệu quang học Mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một trong những dạng đồng phân quang học: Dạng D – Dạng L – Dạng Cis – Dạng Trans Tính đặc hiệu của enzyme Acid Fumaric L . acid Malic ( Dạng Trans) 4/10/2013 23 Tính đặc hiệu của enzyme - Đặc hiệu nhóm •+ Enzyme phải tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định. •+ Cấu tạo của một trong 2 cấu tử tạo thành liên kết đó phải xác định. Ví dụ: Carboxy peptidase: . Xúc tác thủy phân liên kết peptid. . Liên kết peptid này phải gần gốc COOH tự do. 5 Tính đặc hiệu của enzyme - Đặc hiệu tuyệt đối Enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định. Ví dụ: Urease chỉ thủy phân urê. - Đặc hiệu tương đối Tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học, không phụ thuộc vào bản chất hóa học cơ chất. Ví dụ: Lipase: Thủy phân liên kết Ester của Lipid. 4/10/2013 24 - A: Enzyme Glucose 6P dehydrogenase B: Phosphatase C: Phosphoglucomutase D: Phospho hexo Isomerase 7. Phân loại và danh pháp 7.1. Tên thông dụng. Pepsine, trypsine, amilase, catalase 7.2. Tên hệ thống Phần 1: Tên cơ chất Phần 2: Tên kiểu phản ứng + ase Ví dụ: Malate dehydrogenase 4/10/2013 25 7. Phân loại và danh pháp Hội nghị quốc tế sinh hóa 1964: Mỗi enzyme được mã hóa bằng 4 con số: Ví dụ: EC. 3.4.5.6 Số thứ 1: chỉ nhóm chính của enzyme Số thứ 2: chỉ nhóm phụ Số thứ 3: phân nhóm phụ Số thứ 4: thứ tự trong nhóm 1) Enzyme oxyd hóa khử: oxydoreductase - Enzyme xúc tác phản ứng oxyd hóa khử Tên gọi: Nhóm cho H + – nhóm nhận H+ - oxydoreductase - Enzyme nhị cấu tử Protein + coenzym NAD: Nicotinamid adenine dinucleotid NADP: Nicotinamid adenine dinucleotid phosphate - NAD - NADP 4/10/2013 26 Enzyme oxyd hóa khử: oxydoreductase - Enzyme phổ biến: Dehydrogenase: vận chuyển hydrogen Oxydase: oxyd hóa Cytochrome: vận chuyển điện tử Peroxydase: H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 2) Enzyme vận chyển: Transferase - Xúc tác phản ứng chuyển vị các gốc (nhóm chức) từ chất này sang chất khác. Phosphotransferase: chuyển gốc phosphate Glycoxyl –transferase: chuyển gốc glucoxyl Carboxyl transferase: chuyển gốc CO 2 4/10/2013 27 3) Enzyme thủy phân: Hydrolase - Xúc tác phản ứng thủy phân với sự tham gia của H 2 O - Các enzyme phổ biến • + Esterase: thủy phân liên kết ester • + Glucosidase: thủy phân liên kết glucoside (Amilase, maltase) • + Peptidase: thủy phân liên kết peptid (protease, pepsin, papain) • + Amidase: thủy phân liên kết của các amin + Urease, glutaminase 4) Enzyme lyase - Xúc tác phản ứng phân cắt một nhóm không có sự tham gia của H 2 O. Ví dụ: + Enzyme decarboxylase + Enzyme aldolase C – C + Enzyme hydratase: tách hay nhận H 2 O 4/10/2013 28 5) Enzyme Isomerase - Xúc tác phản ứng đồng phân hóa Dạng Cis  dạng trans Dạng D  dạng L Dạng Aldehyd  dạng cetone Chuyển nhóm nội phân tử: Mutase - Enzyme phổ biến: Triophosphate isomerase Glucophosphate isomerase 6) Enzyme ligase hay synthetase - Xúc tác phản ứng tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất khác.