Công nghệ enzym

oza. Tác dөng cӫa Į-amylaza làm amylopectin (AP) cNJng xҧy ra tѭѫng tӵ nhѭng vì nó không phân cҳt ÿѭӧc liên kӃt Į1-6 glucozit ӣ mҥch nhánh cӫa AP nên sau mӝt thӡi gian lâu thì sҧn phҭm sӁ lҫ 72% maltoza, 19% glucoza, dextrin thҩp phân tӱ và izomaltoza (8%). - Tuy nhiên thông thѭӡng trong mӝt thӡi gian ngҳn 30 – 60 phút (thӡi gian nҩu sѫ bӝ nguyên liӋu tinh bӝt hay ÿѭӡng hoá sѫ bӝ khӕi nҩu trong sҧn xuҩt rѭӧu elylic). Į-amylaza chӍ thuӹ phân tinh bӝt chӫ yӃu thành dextrin phân tӱ thҩp và mӝt ít ÿѭӡng maltoza, khҧ Qăng dextrin hoá cao này là tính chҩt cӫa enzim ÿһc trѭng cӫa enzim này. Vì vұy ngѭӡi ta còn gӑi loҥi enzim này là amylaza dextrin hay amylaza dӏch hoá. - Į-amylaza là mӝt metaloenzim (enzim cѫ kim), trong phân tӱ enzim có tӯ 1 – 6 nguyên tӱ C, chúng tham gia vào sӵ hình thành và әn ÿӏnh cҩu trúc bұc 3 cӫa enzim, duy trì cҩu hình hoҥt ÿӝng cӫa enzim, quyӃt ÿӏnh tính bӅn nhiӋt cӫa enzim. - Į-amylaza cӫa vi sinh vұt có nhӳng ÿһc tính rҩt ÿһc trѭng vӅ cѫ chӃ tácdөng, khҧ Qăng chuyӇn hoá tinh bӝt và khҧ năng chӏu nhiӋt: + ThӇ hiӋn hoҥt tính trong vùng axit yӃu: Į-amylaza nҩm mӕc có pHop = 4,5 – 4,9, Fӫa vi khuҭn pHop = 5,9 – 6,1. Ӣ pH<3 enzim bӏ vô hoҥt hoàn toàn trӯĮ-amylaza cӫa CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 56 Asp. Niger có thӇ chӏu ÿѭӧc pH = 2,5 – 2,8 (trong môi trѭӡng sinh tәng hӧp axit xitric Eҵng phѭѫng pháp lên men bӅ mһt). + Į-amylaza cӫa nҩm mӕc có khҧ năng dextrin hoá (dӏch hoá) cao lҥi vӯa tҥo ra Pӝt lѭӧng lӟn glucoza và maltoza. Į-amylaza cӫa vi khuҭn lҥi có hai loҥi: Į-amylaza Gӏch hoá và Į-amylaza ÿѭӡng hoá. + NhiӋt ÿӝ hoҥt ÿӝng cӫa Į-amylaza tӯ các nguӗn khác nhau là khác nhau. (bҧng III-4 trang 108 – Enzim VSV - Tұp I). Trong ÿó ÿáng chú ý hѫn cҧ là Į-amylaza cӫa vi khuҭn có thӇ chiu ÿѭӧc ӣ nhiӋt ÿӝ cao, có thӇ giӳÿѭӧc hoҥt lӵc ngay cҧ khi ÿun sôi trong Qѭӟc mӝt thӡi gian ngҳn. Tính bӅn nhiӋt này là mӝt ѭu ÿLӇm lӟn ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ xӱ lý nguyên liӋu ӣ các công ÿRҥn phҧi dùng nhiӋt ÿӝ cao, hoһc môi trѭӡng nhiӋt ÿӟi nhѭӣ Qѭӟc ta. Ĉa sӕ các chӃ phҭm enzim thѭѫng mҥi thuӝc nhóm amylaza ÿӅu có tính chӏu nhiӋt cao. Nhӳng chӫng vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp Į-amylaza ÿѭӧc sӱ dөng trong công nghӋ: Asp. Oryzae, Asp. Awamori, Asp. Usami, Asp. Batatae, Asp. Niger, Bacillus subtilic, B. lichemiformis, Endomycopsis fibuliger 6.1.2. ȕ-amylaza (tên hӋ thӕng Į-1,4-glucan-maltohidrrolaza mã sӕ 3.2.1.2 EC) - Xúc tác thuӹ phân liên kӃt Į1-4 glucozit (hinh 65 trang 235 – giáo trình). Tuҫn tӵ Wӯng gӕc maltoza mӝt tӯÿҫu không khӱ cӫa mҥch và do maltoza tҥo ra cҩu hìnhȕ vì thӃ enzim này ÿѭӧc gӑi là ȕ-amylaza. - Hҫu nhѭ không thuӹ phân hҥt tinh bӝt nguyên mà chӍ thuӹ phân tinh bӝt hӗ hoá, có khҧ năng thuӹ phân 100% amylaza thành maltoza và 54 – 58 % amylopectin thành maltoza. Quá trình thuӹ phân AP bҳt ÿҫu tӯÿҫu không khӱ cӫa nhánh ngoài cùnh, mӛi nhánh này có 20 – 26 gӕc glucoza nên sӁ tҥo ra ÿѭӧc 10 -13 phân tӱ maltoza. Khi gһp liên kӃt Į1-4ÿӭng kӃ cұn liên kӃt Į1-6 thì ȕ-amylaza ngӯng tác dөng. Phҫn còn lҥi không Eӏ tác dөng này gӑi là ȕ-dextrin chӭa tҩt cҧ các liên kӃt Į1-6 : cho màu tím ÿӓ vӟi Iôt. - NӃu cho cҧĮ và ȕ-amylaza cùng ÿӗng thӡi thuӹ phân tinh bӝt thì hiӋu suҩt thuӹ phân ÿҥt tӟi 95%. - ȕ-amylaza là mӝt albumin, enzim ngoҥi phân (exoenzym), chӍ có trong malt, vүn giӳÿѭӧc hoҥt tính khi không có C, kém bӅn ӣ nhiӋt ÿӝ cao, bӏ vô hoҥt hoàn toàn ӣ 700C. pHop+ trong dӏch tinh bӝt thuҫn khiӃt là 4,6 , còn trong dӏch nâú tinih bӝt là 5,6. top trong Gӏch tinh bӝt thuҫn khiӃt là 40-500C, còn trong dӏch nҩu tinh bӝt là 60-650C. 6.1.3. Glucoamilaza (tên hӋ thӕng Į-1,4-glucan-glucohidrolaza, mã sӕ 3.2.1.3.EC) còn gӑi là amyloglucozidaza. - Thuӹ phân liên kӃt Į1-4 và Į1-6, vì thӃ các nhà nghiên cӭu Nhұt (Onoetal, 1964) ÿӅ nghӏÿһt tên hӋ thӕng là Į1-4 :1,6-glucan-4:6-glucohidrolaza. Enzim này ÿѭӧc các nàh khoa hӑc Nhұt tách ra lҫn ÿҫu tiên tӯ Asp. Awamori (katihara, karushima, 1956). Sau ÿó ÿѭӧc tìm thҩy ӣ Rhizopus delemar, Asp. Niger, Asp. Oryzae, các vi sinh vұt khác, mô ÿӝng vұt. - Glucoamylaza là enzim ngoҥi bào (exoenzim), có khҧ năng thuӹ phân liên kӃt Į1- 2, Į1-3 glucozit (Sawasaki, 1960; Ueyamaetal, 1965; Watanabe Fukimbara, 1960). Nó có khҧ năng thuӹ phân hoàn toàn tinh bӝt, glicogen, Am, Ap, dextrin cuӕi, izomaltoza, mantoza ÿӃn sҧn phҭm cuӕi cùng là glucoza. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 57 - Ĉa sӕ glucoamylaza ÿӅu thuӝc loҥi “chӏu axit”, pHop=3,5 – 5, top= 50 – 600C, mҩt hoҥt tính ӣ t>700C. HiӋn nay enzim này ӣ vӏ trí hàng ÿҫu vӅ hiӋu lӵc thuӹ phân tinh bӝt và các sҧn phҭm trung gian. Vì thӃ viӋc sӱ dөng các chӃ phҭm glucoamylaza tách tӯ các chӫng vi sinh vұt hoҥt ÿӝng trong sҧn xuҩt rѭӧu, bia, mҥch nha, glucoza có mӝt triӇn Yӑng, ý nghƭa vô cùng to lӟn. Nhӳng chӫng vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp glucoamylaza ÿѭӧc sӱ dөng trong công nghӋ là: Asp. Awamori , Asp. Niger, Asp. Usami, Asp. Oryzae, Endomyces sp, Endomycopsis Cápularis, Endomycopsis fibuliger, Rhizopus delemar, Rhizopus Javanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus peka, Rhizopus tonkinensis. 6.1.4. Oligo-1,6-glucozidaza hay dextrinaza tӟi hҥn (dextrin-6-glucanhidrolaza. 3.1.1.10. EC) - Thuӹ phân các liên kӃt Į1-6 glucozit trong izomaltoza, panoza, các dextrin tӟi hҥn và có thӇ chuyӇn hoá chúng ÿӃn các loҥi ÿѭӡng có thӇ lên men ÿѭӧc. Các nòi nҩm mӕc Asp. Awamori, Asp. Usami, Asp. Oryzae sinh tәng hӧp rҩt mҥnh mӁ loҥi enzim này cho nên QӃu ÿѭӡng hoá tinh bӝt ÿã nҩu chín (trong sҧn xuҩt rѭӧu etylic) bҵng chӃ phҭm enzim nuôi cҩy tӯ các nòi vi sinh vұt này sӁ thu ÿѭӧc dӏch ÿѭӡng có khҧ năng lên men cuӕi (lên men dai) rҩt triӋt ÿӇ, góp phҫn nâng cao hiӋu suҩt gây men và hiӋu suҩt tәng thu hӗi rѭӧu. Ngoài ra enzim này cNJng có trong malt, trong mô ÿӝng vұt và cҧ nҩm men, ÿһc biӋt chúng còn có các enzim khác cùng hӑ hàng vӟi enzim này là: amylopectin-1,6- glucozidaza (amylopectin-1,6-glucanhidrolaza 3.2.1.9) và dextrin-1,6-glucozidaza (dextrin-1,6-glucanhidrolaza 3.2.1.33). Cҧ 2 enzim này thuӹ phân dextrin sâu sҳc hѫn cҧ Į và ȕ-amylaza &ҧ 3 enzim kӇ trên (dextrinaza) ÿӅu hoҥt ÿӝng ӣ top= 400C, pHop= 5,1. 6.1.5. Į-glucozidaza hay maltaza (Į-D-glucozit-glucohidrolaza 3.2.1.20 EC) Có nhiӅu loài nҩm mӕc sinh tәng hӧp ra enzim này, tác dөng thuӹ phân ÿѭӡng maltoza thành glucoza nhѭng không thuӹ phân ÿѭӧc tinh bӝt. Nhѭ vұy giӕng nhѭ dextrinaza, enzim này giúp cho quá trình lên men cuӕi chuyӇn ÿѭӡng thành rѭӧu etylic góp phҫn nâng cao hiӋu suҩt lên men. 6.1.6. Transglucozilaza (Į-1,4-glucan: D-glucoza-4-glucozil transferaza 2.4.1.3.EC) Enzim này thѭӡng tӗn tҥi song song vӟi glucoamylaza (trong chӃ phҭm nҩm mӕc Aspergillus), nó có hoҥt tính thuӹ phân và hoҥt tính vұn chuyӇn nhóm. Nghƭa là nó không nhӳng chӍ thuӹ phân maltoza thành glucoza mà còn tәng hӧp nên izomaltoza, izotrioza và panoza, tӭc là có khҧ năng chuyӇn gӕc glucoza ÿӃn gҳn nó vào phân tӱ maltoza hoһc phân tӱ glucoza bӣi liên kӃt Į1-6 glucozit ÿӇ tҥo thành các glucozit nói trên. 6ӵ có mһt cӫa enzim này trong các chӃ phҭm enzim amylaza dùng ÿӇ biӃn hình tinh Eӝt (mҥch nha, ÿѭӡng glucoza, rѭӧu etylic) là ÿLӅu không mong muӕn vì nó xúc tác sӵ Wәng hӧp lҥi các izosaccarit tӯ chính các sҧn phҭm thuӹ phân tinh bӝt, làm giҧm hiӋu suҩt ÿѭӡng hoá, dӏch thuӹ phân có vӏÿҳng không mong muӕn. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 58 6.2. Proteaza. Nhóm enzim proteaza (peptit – hidrolaza 3.4) xúc tác quá trình thuӹ phân liên kӃt peptit (-CO-NH-)n trong phân tӱ protein, polypeptit ÿӃn sҧn phҭm cuӕi cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiӅu proteaza cNJng có khҧ năng thuӹ phân liên kӃt este và vұn chuyӇn axit amin. Theo hӋ thӕng phân loҥi quӕc tӃ thì nhóm enzim này ÿѭӧc chia làm 4 phân nhóm 1/ Aminopeptidaza: thuӹ phân liên kӃt peptit ӣ ÿҫu nitѫ amin ( – NH2 ) cӫa mҥch polypeptit. 2/ Cacboxypeptidaza: xúc tác thuӹ phân liên kӃt peptit ӣ ÿҫu cacbon cӫa mҥch polypeptit. Hai phân nhóm này thuӝc toҥi exo-peptitdaza (enzim ngoҥi phân) 3/ Dipeptit hidrolaza: thuӹ phân các liên kӃt peptit 4/ Proteinaza: xúc tác sӵ thuӹ phân liên kӃt peptit nӝi mҥch (endo-peptitdaza) Các proteaza khá phә biӃn ӣÿӝng, thӵc vұt và vi sinh vұt, trong ÿó ÿáng chú ý hѫn cҧ là có nhiӅu vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp mҥnh mӁ proteaza. Các enzim này có thӇӣ trong tӃ bào (proteaza nӝi bào) hay ÿѭӧc tiӃn vào môi trѭӡng nuôi cҩy (proteaza ngoҥi bào). Giӕng nhѭ amylaza, mӝt sӕ loҥi proteaza ÿã ÿѭӧc dân tӝc các nѭӟc châu Á, trong ÿó có ViӋt Nam sӱ dөng trong mӝt sӕ ngành sҧn xuҩt các sҧn phҭm thӵc phҭm truyӅn thӕng nhѭ: sҧn xuҩt nѭӟc mҳm và các loҥi mҳm, sҧn xuҩt tѭѫng và chao, mӝt sӕ loҥi nem, tré. Bҧng II-3 trang 131, 132 (Enzim VSV- tұp I) giӟi thiӋu mӝt sӕ loҥi VSVcó khҧ năng nuôi cҩy sinh tәng hӧp và thu nhұn enzim proteaza. Theo bҧng này ta thҩy mӝt Vӕ nòi vi khuҭn thuӝc giӕng Bacillus, xҥ khuҭn thuӝc giӕng Streptomyces, nҩm mӕc thuӝc giӕng Aspergillus, Penicillium, Rhizopus là có khҧ năng sinh tәng hӧp enzim proteaza mҥnh nhҩt. Căn cӭ vào cѫ chӃ phҧn ӭng, ÿӝ pHop, Hartley (1960) ÿã phân loҥi các proteinaza vi sinh vұt thành 4 nhóm: proteinaza-serin, P.tiol, P.kim loҥi và P.axit (Bҧng II-6 trang 156, 157 – Enzim VSV- Tұp I). Trӑng lѭӧng phân tӱ cӫa 4 nhóm này Wѭѫng ÿӕi bé: chҷng hҥn MP-serin=20000 – 27000, tuy nhiên nhóm này có mӝt sӕ có M lӟn Kѫn nhѭ enzim cӫa penicillium M = 44000. Asp. Oryzae 5038 và M = 52000, MP.kim loҥi = 33800 – 48400, MP.tiol và axit = 30000 – 40000. 9Ӆÿӝ bӅn thì P.serin bӅn trong giӟi hҥn pH rӝng, tӯ 5 – 10 ӣÿLӅu kiӋn nhiӋt ÿӝ thҩp. P.serin cӫa Bacillus.pumilus khá bӅn trong môi trѭӡng kiӅm ӣ pH=11 vүn giӳÿѭӧc 80% hoҥt ÿӝ ban ÿҫu. Ӣ nhiӋt ÿӝ 3600C nhóm này bӏ mҩt hoҥt tính nhanh chóng. Tuy nhiên các P.serin cӫa Streptomyces fradiae và Stre.reatus Oҥi bӅn nhiӋt ӣ 700C trong 30 phút chӍ Eӏ mҩt 10 -15% hoҥt tính. Các proteinaza kim loҥi kém bӅn nhҩt trong sӕ 4 nhóm này, EӅn trong phҥm vi pH = 6 – 9, nhanh chóng bӏ mҩt hoҥt tính ngoài khoҧng pH này. Ca làm tăng ÿӝ bӅn cӫa nhóm enzim này. Các proteaza-axit bӅn trong phҥm vi pHaxit = 2 – 6, trong môi trѭӡng axit chúng khá EӅn nhiӋt. Các proteaza nói chung ÿѭӧc ӭng dөng rҩt rӝng rãi trong nhiӅu lƭnh vӵc: - Trong chӃ biӃn thuӹ sҧn: khi sҧn xuҩt nѭӟc mҳm (và mӝt sӕ loҥi mҳm) thѭӡng thӡi gian chӃ biӃn thѭӡng là dài nhҩt, hiӋu suҩt thuӹ phân (ÿӝÿҥm) lҥi phө thuӝc rҩt nhiӅu vào ÿӏa phѭѫng, phѭѫng pháp gài nén, nguyên liӋu cá. Nên hiӋn nay quy trình sҧn xuҩt nѭӟc mҳm ngҳn ngày ÿã ÿѭӧc hoàn thiӋn trong ÿó sӱ dөng chӃ phҭm enzim thӵc vұt CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 59 (bromelain và papain) và vi sinh vұt ÿê rút ngҳn thӡi gian làm và cҧi thiӋn hѭѫng vӏ cӫa Qѭӟc mҳm. Tuy nhiên vүn còn mӝt sӕ tӗn tҥi cҫn phҧi hoàn thiӋn thêm vӅ công nghӋ. - Trong chӃ biӃn thӏt, proteaza ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ làm mӅm thӏt và tăng hѭѫng vӏ thӏt. (ngâm thӏt vào dinh dѭӥng preteinaza ӣ pH và nhiӋt ÿӝ xác ÿӏnh – phѭѫng pháp này phә biӃn và thuұn lӧi nhҩt; Tҭm hӛn hӧp làm mӅm thӏt (enzim, muӕi, bӝt ngӑt). Tiêm dung Gӏch enzim vào thӏt; tiêm dung dӏch enzim vào con vұt trѭӟc khi giӃt mә). Sӱ dөng proteinaza ÿӇ sҧn xuҩt dӏch ÿҥm: tӯ Streptomyces fradiae tách ÿѭӧc chӃ phҭm keratineza thuӹ phân ÿѭӧc keratin rҩt có giá trӏÿӇ sҧn xuҩt dӏch ÿҥm tӯ da, lông vNJ. NӃu dùng axit ÿӇ thuӹ phân sӁ mҩt ÿi hoàn toàn các axit amin chӭa lѭu huǤnh, nӃu dùng kiӅm ÿӇ thuӹ phân sӁ bӏ raxemic hoá (chuyӇn dҥng L sang D làm giҧm giá trӏ sinh hӑc cӫa axit amin). Ĉê thuӹ phân sâu sҳc và triӋt ÿӇ protein (trong nghiên cӭu, chӃ tҥo dӏch truyӅn ÿҥm y tӃ) Fҫn dùng các proteinaza có tính ÿһc hiӋu cao và tác dөng rӝng, muӕn vұy ngѭӡi ta thѭӡng dùng phӕi hӧp cҧ 3 loҥi proteinaza cӫa 3 loҥi: vi khuҭn, nҩm mӕc, thӵc vұt vӟi tӍ lӋ tәng Fӝng 1 – 2% khӕi lѭӧng protein cҫn thuӹ phân. Ѭu ÿLӇm cӫa viӋc thuӹ phân protein bӣi enzim là bҧo toàn ÿѭӧc các vitamin cӫa nguyên liӋu, không tҥo ra các sҧn phҭm phө, không làm sүm màu dӏch thuӹ phân. - Trong chӃ biӃn sӳa: ngѭӡi ta chӍ sӱ dөng các proteaza cӫa vi sinh vұt có tính chҩt Wѭѫng tӵ renin hoһc chӍ thay thӃ 25 – 50% renin. (renin là enzim làm ÿong tө sӳa ÿѭӧc Vҧn xuҩt tӯ dҥ dày bê) nhѭ các giӕng liên kӃt Aspergillus Candidus, Penicillium roqueforti, Bacillus mesentericus...ÿѭӧc ӭng dөng ÿӇ sҧn xuҩt phomat. Ngoài ra có thӇ Vӱ dөng proteinaza ÿӇ thu cazein kӻ thuұt (tӯ sӳa) ÿӇ sҧn xuҩt vectri, chҩt màu, keo dán, Kѭѫng liӋu. - Trong chӃ biӃn bia và nѭӟc giҧi khát: proteinaza ÿѭӧc dùng ÿӇ làm trong bia và Qѭӟc quҧ. - Trong công nghiӋp dӋt: papain và proteinaza vi sinh vұt ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ làm sҥch Wѫ tҵm, tҭy tѫ nhân tҥo (các sӧi nhân tҥo ÿѭӧc bҵng các dung dӏch cazein, gelatin) ÿӇ sӧi ÿѭӧc bóng, dӉ nhuӝm. - Trong công nghiӋp da: proteinaza ÿѭӧc dùng ÿӇ làm mӅm, làm sҥch và tҭy lông da, làm tăng tính ÿàn hӗi, cҧi thiӋn ÿLӅu kiӋn làm viӋc, tránh ô nhiӉm môi trѭӡng. - Trong công nghiӋp xà phòng, các chҩt tҭy rӱa, mӻ phҭm: thêm enzim proteinaza trong các loҥi xà phòng diӋt khuҭn, kem dѭӥng da, xà phòng có tính tҭy rӱa cao. - Trong y hӑc: sӱ dөng nhiӅu enzim proteinaza ÿӇ sҧn xuҩt thuӕc hӛ trӧ tiêu hoá, Qҩu cao ÿӝng vұt, chӳa bӋnh nghӁn mҥch máu, tiêu viêm vӃt thѭѫng. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 60 6.3. Pectinaza - Pectin là cѫ chҩt cӫa enzim pectinaza. Pectin rҩt phә biӃn trong thӵc vұt, là hӧp chҩt polime tӵ nhiên tӗn tҥi có 3 dҥng: protopectin, pectin và axit pectinic. Protopectin không tan có dҥng thӵc vұt xanh, tҥo cho rau quҧ xanh có ÿӝ cӭng nhҩt ÿӏnh, bӏ thuӹ phân bӣi axit hay nhiӋt ÿӝ, enzim sӁ chuyӇn thành pectin hoà tan (quá trình chín cӫa quҧ có thӇ gӑi là quá trình chuyӇn hoá này). Pectin là este metila cӫa axit polygalacturonic. Tính chҩt quan trӑng nhҩt cӫa pectin là dӉ tҥo gel ӣ nӗng ÿӝ dӏch ÿѭӡng cao 65% trong môi trѭӡng 1% axit. Axit pectinic là mӝt axit polygalacturonic nhѭng chӍÿѭӧc este hoá mӝt phҫn nhӓ bӣi metanol. Còn axit putic hay polypectic là axit ÿã ÿѭӧc giҧi phóng khӓi nhóm metõy (– OCH3). Muӕi tѭѫng ӭng có tên là pectinat và pectat. Liên kӃt chính trong pectin là Į1-4 glucozit. - HiӋn nay, hӋ thӕng enzim pectinaza ÿѭӧc chia thành 2 nhóm chính: hydrolaza và transeliminaza vӟi ÿһc ÿLӇm chung nhҩt là làm giҧm ÿӝ nhӟt cӫa dung dӏch pectin và làm giҧm phân tӱ lѭӧng cӫa các sҧn phҭm tҥo thành. 6.3.1. Hydrolaza: (pectihydrolaza) Thuӝc nhóm này có 2 enzim chӫ yӃu là: pectinesteraza và polygalacturonaza. - Pectinesteraza: (3.1.1.11.EC) - gӑi tҳt PE: enzim xúc tác thuӹ phân liên kӃt este trong phân tӱ pectin hoá axit pectinic ÿӇ giҧi phóng sҧn phҭm là metanol và axit polygalacturonic. PE chӍ phân cҳt các nhóm metoxy ÿӭng cҥnh nhóm – COOH tӵ do. 9ӏ trí tҩn công nhóm metoxy ӣ vӏ trí 5 dӉ hѫn ӣ vӏ trí 3 và 7 (2 gӕc – COOH ). Ĉӝ pHop cӫa PE thu ÿѭӧc tӯ các nguӗn khác nhau: Tӯ vi sinh vұt : 4,5 – 5,5 Tӯ thӵc vұt : 5,0 – 8,0 PE cӫa nҩm mӕc có top = 30 – 450C, bӏ vô hoҥt ӣ t = 55 – 62 0C, PE ÿѭӧc hoҥt hoá bӣi Ca2+ và Mg2+. - Polygalacturonaza (PG. 3.2.1.15.EC; poly – Į1,4 – galacturonit glucanhidrolaza) Enzim này ít gһp trong thӵc vұt, chӫ yӃu có trong vi khuҭn và nҩm mӕc. Ĉây là mӝt phӭc hӋ enzim và thѭӡng có tính ÿһc hiӋu cao ÿӕi vӟi cѫ chҩt. Dӵa vào ÿó ngѭӡi ta chia ra 4 kiӇu sau: + Polymetyl-galacturonaza (PMG - poly – Į1,4 – galacturonit – metyl este glucanhidrolaza. 3.2.1.41EC). PMG lҥi ÿѭӧc phân thành 2 nhóm nhӓ phө thuӝc vào vӏ trí phân cҳt liên kӃt Į1,4ӣ trong hay ӓ cuӕi và ÿҫu mҥch. · Endo glucozidaza polymetyl galacturonaza kiӇu I (endo – PMG – I). Ĉây là enzim có tính chҩt dӏch hoá, pectin có mӭc ÿӝ metyl hoá càng cao (nhiӅu gӕc metoxy – OCH3) COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3COOCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 61 thì bӏ thuӹ phân càng nhanh và triӋt ÿӇ. Trong môi trѭӡng khi có mһt pectinesteraza (PE) thì enzim này thѭӡng bӏ giҧm hoҥt lӵc. Endo – PMG – I rҩt phә biӃn trong các nòi nҩm mӕc: Asp. Niger, Asp. Awamori, Botrytis cinezea, Neurispora crassa. &ѫ chӃ tác dөng nhѭ hình vӁ: · Exo - glucozidaza polymetyl galacturonaza kiӇu III (exo – PMG – III). Ĉây là enzim có tính chҩt ÿѭӡng hoá, có khҧ năng cҳt tӯng gӕc monome axit galacturonic ra khӓi mҥch bҳt ÿҫu tӯÿҫu không khӱ có nhóm metoxy (– OCH3) &ѫ chӃ tác dөng nhѭ hình vӁ: + Enzim tác dөng lên axit pectinic hay axit pectit - gӑi là polygalacturonaza (PG) FNJng ÿѭӧc phân thành 2 nhóm nhӓ: · Endo glucozidaza polygalacturonaza kiӇu II (endo – PG – II). Ĉây là enzim có tính chҩt dӏch hoá, chӍ thuӹ phân cѫ chҩt khi có mһt nhóm – COOH tӵ do. Hoҥt ÿӝ cӫa endo – PG – II tăng lên nhiӅu khi cѫ chҩt ÿѭӧc xӱ lý trѭӟc bҵng pectinesteraza (ÿӇ tҥo ra nhiӅu gӕc – COOH tӵ do). Nҩm mӕc và vi khuҭn tәng hӧp ÿѭӧc enzim này. &ѫ chӃ tác dөng nhѭ hình vӁ: · Exo - glucozidaza polygalacturonaza kiӇu IV (exo – PG – IV). Thuӹ phân các liên kӃt gҳn vӟi nhóm – COOH tӵ do ӣÿҫu hay mӕi mҥch COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3COOCH3COOCH3 1 2 3 4 5 6 7 COOCH 3 COOCH 3 COOH COOH COOCH 3 COOCH 3 COOCH 3 1 2 3 4 5 6 7 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3 COOHCOOCH3COOH 1 2 3 4 5 6 7 COOH COOCH3 COOH COOH COOHCOOCH3COOH 1 2 3 4 5 6 7 COOH 8 CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 62 6.3.2. Transeliminaza (TE) Ĉây là nhóm enzim ÿѭӧc tìm ra cách ÿây chѭa lâu lҳm (khoҧng năm 1960 – 1961) bao Jӗm protopectinaza xúc tác sӵ phân cҳt araban, galactan khӓi protopectin ÿӇ tҥo thành pectin hoà tan và enzim transeliminaza phân cҳt phi thuӹ phân (không có sӵ tham gia cӫa phân tӱ H2O) pectin ÿӇ tҥo ra các gӕc galacturonic có nӕi kép giӳa nguyên tӱ C4 và C5. Phҧn ӭng xҧy ra dӉ dàng ӣ môi trѭӡng trung tính hay kiӅm yӃu. 6.3.3. 0ӝt sӕӭng dөng cӫa chӃ phҭm pectinaza. Các chӃ phҭm enzim pectinaza thѭӡng ÿѭӧc sӱ dөng trong sҧn xuҩt nѭӟc quҧ, sҧn xuҩt Uѭӧu vang, trích ly ÿông dѭӧc (sҳc thuӕc) và trong chăn nuôi. - Ӭng dөng chӃ phҭm pectinaza trong sҧn xuҩt nѭӟc quҧ: Có các mһt hàng nѭӟc quҧ trong, nѭӟc quҧÿөc, nѭӟc quҧ có thӏt quҧ, tҩt cҧÿӅu ÿѭӧc Vҧn xuҩt tӯ nѭӟc ép (chiӃt rút) cӫa quҧ. Do ÿó hiӋu quҧ thu dӏch quҧ cӫa phө thuӝc vào H O H OH OH H C H HO OOCH3 O H O H OH OH H C H H OOCH3 O H O H OH OH H C H HO OOCH3 O H OH OH H C H OOCH3 OH H + CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 63 tính chҩt cӫa nguyên liӋu quҧ (cҩu tҥo, ÿӝ chín, thành phҫn ÿӏnh tính và ÿӏnh lѭӧng cӫa pectin trong quҧ, phѭѫng pháp ép, chiӃt rút) + Khi chӃ biӃn nѭӟc quҧ trong thì chӃ phҭm pectinaza phҧi có endo và exo polygalacturonaza (endo – PGII và exo – PGIV). Enzim pectinesteraza và proteinaza. Hai loҥi enzim ÿӅu làm giҧm ÿӝ nhӟt dӏch quҧ, còn PE góp phҫn vào tác dөng cӫa enzim này, còn protein thuӹ phân protein cӫa vӓ tӃ bào thӵc vұt làm cho dӏch quҧ dӉ thoát ra, cһn và bã dӉ lҳng hѫn. Vӟi các loҥi quҧ có nhiӅu protopectin nhѭ táo, lê, әi thì chӃ phҭm không ÿѭӧc có enzim protopectinaza vì nӃu có sӁ phân huӹ protopectin làm mӅm hoá mô quҧ, Wăng ÿӝ nhӟt cӫa dӏch quҧ nên làm giҧm hiӋu suҩt lҩy nѭӟc quҧ trong. Ngoài ra, nѭӟc quҧ không ÿѭӧc phép chӭa các enzim oxy hoá (ascobatoxydaza, polyphenoloxydaza, peroxydaza) làm hao tәn vitamin C và sүm màu, biӋn pháp sӱ dөng nhiӋt (ÿun nóng) sӁ vô hoҥt hӋ enzim này. + ĈӇ thu ÿѭӧc nѭӟc quҧ vӟi hiӋu suҩt cao, ngѭӡi ta thѭӡng nghiӅn thӏt quҧ, xӱ lý bҵng chӃ phҭm enzim pectinaza, sau ÿó mӟi ÿem vҳt, ly tâm hay ép. Chҷng hҥn: nӃu xӱ lý táo nghiӅn bҵng 0,03% chӃ phҭm pectinaza (200 ÿѫn vӏ hoҥt ÿӝ) PMG (gam) sau 2 – 4 h sӁ Wăng hiӋu suҩt thu dӏch quҧ 20 – 25%. Khi ép nho mà không sӱ dөng chӃ phҭm pectinaza thì hiӋu suҩt ép là 65% nhѭng nӃu sau khi nghiӅn chà quҧ và xӱ lý bҵng 0,2% chӃ phҭm pectinaza trong 3h ӣ 450C sӁ nâng cao hiӋu suҩt ép lên 77 – 82%. Dùng pectinaza còn có tác dөng làm trong do sӵ phá huӹ hӋ keo trong nѭӟc quҧ, vӏ Fӫa quҧ tӕt hѫn và ít bӏÿөc trӣ lҥi. - Ӭng dөng chӃ phҭm pectinaza trong sҧn xuҩt rѭӧu vang: 5ѭӧu vang ÿѭӧc sҧn xuҩt tӯ các loҥi quҧ ngӑt (quҧ có ÿѭӡng): nho, táo, dâu, chuӕi, Gӭa, mѫ, mұn, anh ÿào, sѫn tra (táo mèo) bao gӗm các giai ÿRҥn chӫ yӃu: ÿLӅu chӃ dӏch quҧ lên men, lên men dӏch quҧ , xӱ lý và tàng trӳ vang. ChӃ phҭm pectinaza dùng trong công nghӋ vang ÿӇ làm tăng hiӋu suҩt thu dӏch quҧ và ÿӇ làm trong. Muӕn vұy, chӃ phҭm phҧi bҧo toàn ÿѭӧc hoҥt ÿӝ trong ÿLӅu kiӋn nӗng ÿӝ rѭӧu trung bình 10 – 12% và ÿӝ pH Kѫi axit (4 – 5). Khi xӱ lý bã nho bҵng pectinaza sӁ làm tăng hàm lѭӧng catechin trong Uѭӧu (chҩt chát). Catechin có hoҥt tính cӫa vitamin P nhѭ vұy ÿã làm tăng giá trӏ sinh hӑc Fӫa vang. Ngoài ra vang còn có ÿӝ thuҫn thөc (thành trѭӣng – ageing) nhanh hѫn, hѭѫng thѫm mҥnh hѫn, vӏ dӏu hѫn do có nhiӅu glyxezin và este. - Ӭng dөng pectinaza trong trích ly các dѭӧc liӋu ÿông y (thuӕc bҳc, thuӕc nam). Các Gѭӧc liӋu có nguӗn gӕc thӵc vұt, trong thành phҫn cӫa chúng ngoài các hoҥt chҩt thì luôn luôn có pectin. Tӯ trѭӟc ÿӃn nay ÿӇ thu nhұn ÿѭӧc các thành phҫn hoҥt chҩt trong dѭӧc liӋu (ÿӇ trӏ bӋnh cҩp thӡi (ngay lúc ÿó), ÿӇ ÿLӅu chӃ dҥng cӗn (rѭӧu), thuӕc (uӕng và xoa bóp), ÿӇÿLӅu chӃ dung dӏch thuӕc, viên nén, vien nang, ÿһc biӋt hiӋn nay ÿӇ sҧn xuҩt thuӕc tiêm và dӏch truyӅn tӯ chính các vӏ thuӕc ÿông y, các thӵc phҭm chӭc năng (fuctional food)) ngѭӡi ta dùng các phѭѫng pháp: chiӃt rút bҵng nѭӟc nhiӋt (còn gӑi là sҳc thuӕc – và ÿây là phѭѫng pháp phә biӃn nhҩt),bҵng cӗn (ngâm rѭӧu thuӕc), trích ly bҵng dung môi thích hӧp (axeton, ete, nitѫ lӓng, axeton lҥnh). Do có thành phҫn pectin nên quá trình sҳc thuӕc khó khăn, không trích ly ÿѭӧc triӋt ÿӇ hoҥt chҩt, dӏch thuӕc bӏ biӃn chҩt sau mӝt thӡi gian ngҳn. ĈӇ khҳc phөc nhӳng khó khăn này, ngѭӡi ta dùng chӃ phҭm enzim pectinaza ÿӇ phân giҧi các mô thӵc vұt ÿӇ các hoҥt chҩt ÿѭӧc giҧi phóng ra dӉ dàng và triӋt ÿӇ CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 64 Kѫn khi sҳc thuӕc. Tuy nhiên, vì sӱ dөng cho mөc ÿích sҧn xuҩt thuӕc chӳa bӋnh nên khi dùng chӃ phҭm enzim phҧi có ÿӝ tinh khiӃt rҩt cao ÿӇ không mang theo nhӳng hoҥt chҩt lҥ vào thuӕc, phҧi có hoҥt ÿӝ cao ÿӇ chӍ dùng vӟi mӝt lѭӧng tӕi thiӇu. Có thӇ tiӃn hành theo sѫ bӝ sѫÿӗ công nghӋ sau: - Ӭng dөng chӃ phҭm pectinaza trong chăn nuôi: Khҭu phҫn ăn cӫa gia súc, gia cҫm thѭӡng chӭa mӝt lѭӧng thӭc ăn thô, thӭc ăn xanh nhҩt ÿӏnh (rѫm rҥ, cӓ, thân cây, cám...) trong khi ÿó ӣÿѭӡng tiêu hoá cӫa chúng lҥi thiӃu các enzim phân giҧi xenluloza, hemixenluloza, pectin. ChӍ có nhӳng ÿӝng vұt nhai lҥi có Gҥ cӓ phát triӇn ÿҫy ÿӫ (trên 6 tháng tuәi) hay gia cҫm có manh trnàg dài (ngӛng, ÿà ÿLӇu) Pӟi có hӋ vi sinh vұt sӕng cӝng sinh trong dҥ cӓ là có khҧ năng sinh ra các hӋ enzim ÿӇ giúp ÿӝng vұt tiêu hoá mӝt phҫn các chҩt dinh dѭӥng này, tuy vұy khoҧng 1/3 nhóm chҩt này không ÿѭӧc ÿӗng hoá. ĈӇ nâng cao khҧ năng tiêu hóa hҩp thө, ngѭӡi ta có thӇ thêm vào thӭc ăn chăn nuôi các chӃ phҭm enzim phân giҧi nhóm gluxit này - ÿӅu là chӃ phҭm có hoҥt tính pectinaza, xenluloza và hemixenluloza cao. + Ĉӕi vӟi các ÿӝng vұt nhai lҥi (trâu, bò, dê, cӯu, ngӵa): do có hӋ vi sinh vұt sӕng trong dҥ cӓ tham gia tích cӵc vào quá trình tiêu hoá thӭc ăn. Khi thêm chӃ phҭm enzim pectinaza và xenluloza cao ӣÿӝ pH = 6 – 7 (axit tính) sӁ có lӧi làm tăng ÿӝ tiêu hoá cӫa thӭc ăn. + Ĉӕi vӟi ngӛng và ngan (vӏt xiêm): ÿây là 2 loài gia cҫm nuôi lҩy thӏt, ÿăc biӋt là có loài ÿӇ sҧn xuҩt ra gan béo (gan nguyên liӋu sҧn xuҩt ra mһt hàng pete gan rҩt nәi tiӃng). Hai loài này có năng lӵc sinh trѭӣng rҩt cao, ngѭӡi ta cӕ gҳng nuôi ÿӇÿҥt ÿӝ tăng trӑng cao và thӡi gian ngҳn (ӣÿӝ tuәi gia cҫm non tuәi có giá trӏ thѭѫng phҭm cao). Muӕn vұy ngѭӡi ta nuôi vӛ béo bҵng cách nhӗi thӭc ăn có sӱ dөng các chӃ phҭm pectawamorin 0,04% so vӟi khҭu phҫn. 6.4. Xenluloza: - Hҵng năm có khoҧng 230 tӍ tҩn chҩt hӳu cѫÿѭӧc tәng hӧp bҵng quá trình quang hӧp ӣ thӵc vұt, trong ÿó có tӕi ÿa 70 tӍ tҩn (30%) xenluloza. Ĉây là polyme tӵ nhiên ȕ-D- glucoza ÿѭӧc nӕi vӟi nhau qua liên kӃt ȕ-D-1,4-glucan, mӭc ÿӝ polyme hoá cӫa phân tӱ xenluloza: 200 – 15000, trung bình 3000, trӑng lѭӧng phân tӱ 50.000 – 2.500.000. Xenluloza là hӧp chҩt tӵ nhiên khá bӅn, không tan trong nѭӟc, chӍ bӏ trѭѫng phӗng do hút nѭӟc, bӏ phân huӹ khi ÿun nóng vӟi kiӅm hay axit hoһc do các enzim ÿѭӧc gӑi chung là xenluloza. 'ѭӧc liӋu Làm nhӓ Trӝn enzim Thuӹ phân lҫn 1 Hãm Trӝn enzim Thuӹ phân lҫn 2 Hãm chiӃt Ĉun nóng /ӑc ĈLӅu chӍnh và pha chӃCô ÿһc Ĉóng chai Thanh trùng CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 65 - Theo nhӳng hiӇu biӃt hiӋn nay thì quá trình phân huӹ xenluloza nhӡ enzim ÿѭӧc thӵc hiӋn nhӡ phӭc hӋ xenluloza, bao gӗm các enzim C1, Cx và ȕ-glucosidoza. Enzim C1 có tính chҩt không ÿһc hiӋu. Dѭӟi tác dөng cӫa C1, các loҥi xenluloza bӏ hҩp thө nѭӟc, trѭѫng lên và chuҭn bӏ cho sӵ tác ÿӝng cӫa các enzim khác. NӃu tách riêng C1 cho hoҥt ÿӝng ÿӝc lұp thì tác dөng này lҥi không thҩy rõ ràng. Vì vұy ngѭӡi ta cho rҵng ÿó chӍ là Pӝt yӃu (factor), không phҧi là enzim Cx còn gӑi là enzim ȕ-1,4 glucanaza, thuӹ phân các xenluloza ngұm nѭӟc bӣi C1 nói trên (polyanhydroglucoza hydrat hoá) thành xenluloza. Chӳ x có nghƭa là enzim gӗm nhiӅu thành phҫn khác nhau và ngѭӡi ta thѭӡng chia làm 2 loҥi chính là: exo-ȕ-1,4 glucanaza và endo-ȕ-1,4 glucanaza. Exo-ȕ-1,4 glucanaza xúc tác viӋc tách liên kӃt các ÿѫn vӏ glucoza tӯ ÿҫu không khӱ (non-reducing end) cӫa chuӛi xenluloza (hình trang 122 – VSV tұp II). Endo-ȕ-1,4 glucanaza phân cҳt liên kӃt ȕ-1,4 glucozit ӣ bҩt kǤ vӏ trí nào cӫa chuӛi xenluloza. Có tác giҧ (Ogawa và Toyama, 1967) cho rҵng còn có mӝt enzim trung gian C2 giӳa C1 và Cx. Enzim này trѭӟc hӃt tác ÿӝng vào xenluloza ÿã bӏ làm trѭѫng nѭӟc bӣi C1 rӗi thuӹ phân thành các dextrin xenluloza hoà tan. Sau ÿó Cx sӁ tiӃp tөc thuӹ phân các xenlo dextrin này thành xenlobioza. ȕ-glucosidoza là enzim rҩt ÿһc hiӋu, thuӹ phân xenlobioza tthành xenlohexoza (D- glucoza) mã sӕ enzim này là: 3.2.1.21 EC. - Nguӗn enzim xenluloza: Có thӇ nói quá trình phân giҧi xenluloza bӣi vi sinh vұt là mӝt trong nhӳng chu trình quan trӑng nhҩt cӫa tӵ nhiên. Ngѭӡi ÿҫu tiên nghiên cӭu khҧ năng phân giҧi xenluloza Fӫa các vi sinh vұt kӷ khí là popov vào năm 1875, tiӃp ÿó là omelianxki. Các môi trѭӡng nghiên cӭu phân lұp vi sinh vұt loҥi này trӣ thành kinh ÿLӇn. Còn ngѭӡi ÿҫu tiên phát hiӋn khҧ năng phân giҧi xenluloza bӣi vi khuҭn hiӃu khí là G.Van Iterson vào năm 1903. Trѭӟc ÿó, hoҥt ÿӝng phân giҧi xenluloza bӣi vi sinh vұt sӕng trong dҥ cӓ cӫa các ÿӝng Yұt nhai lҥi ÿã ÿѭӧc chӭng minh (1955). ĈӃn năm 1971, ngѭӡi ta ÿã phân lұp ÿѭӧc mӝt Vӕ loài vi sinh vұt có khҧ năng phân giҧi xenluloza trong dҥ cӓ (trang 126, VSV, tұp II). Trong ÿó có 2 giai ÿRҥn nghiên cӭu kӻ hѫn cҧ là Ruminococus và R.flavefacicus. 9Ӆ sau này, rҩt nhiӅu vi sinh vұt phân giҧi xenluloza ÿѭӧc tìm thҩy trong ÿҩt, nѭӟc, phân bón hӳu cѫ. Ĉáng chú ý hѫn cҧ là viӋc ӭng dөng vi khuҭn thuӝc nhóm celludomonas vào viӋc lên men phân giҧi bã mía và rác thҧi thӵc vұt. Sѭu tұp giӕng QM (QM collection) cӫa HHTH Massachusetts cNJng có khoҧng 14000 chӫng nҩm có khҧ Qăng phân giҧi xenluloza, trong ÿó các chӫng nәi tiӃng nhѭ trichoderma viride, Sporotrichum P.ruinosum, penicllium pusillum, Aspergillus fumigatú, Asp.terreus... - Ӭng dөng cӫa xenluloza: + Phá vӥ thành tӃ bào (cellwall) thӵc vұt ÿӇ nuôi cҩy các tӃ bào trên (tӃ bào không có màng) ÿӇ lai tҥo chúng vӟi nhau nhҵm tҥo giӕng thӵc vұt + Sҧn xuҩt trѭӡng glucoza thӵc phҭm, nguyên liӋu công nghiӋp hoһc nuôi cҩy nҩm men gia súc. Ӣ Nhұt, hãng Megiseika ÿã sӱ dөng Trichoderma.Konigii và hãng Kinkiyakylt ÿã sӱ Gөng T.viride nuôi cҩy theo phѭѫng pháp bӅ mһt ÿӇ sҧn xuҩt xenlulaza. Sѫ ÿӗ phân [ѭӣng thí ÿLӇm (pilot) sҧn xuҩt siro glucoza tӯ các nguӗn xenluloza phӃ liӋu nhӡ xenluloza cӫa T.viride nhѭ sau. (hình V-13 trang 164 – VSV hӑc - tұp II) CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 66 + Lên men ÿѭӡng chuyӇn hoá (tҥo thành bӣi sӵ thuӹ phân xenluloza do enzim) thành etanol nhiên liӋu ÿӝng cѫÿӕt trong (xe hѫi, xe máy) + Tách tinh bӝt ra khӓi hҥt và cӫ bҵng cách dùng các enzim tách tӃ bào (cell separating enzyme – CSE). Ĉây là hӋ thӕng enzim tác ÿӝng vào phҫn protopectin cӫa vӓ (hҥt, cӫ) ÿӇ giҧi phóng tinh bӝt, mӝt sӕ chӫng nҩm Rhizopus sinh tәng hӧp loҥi enzim này. + Sҧn xuҩt tә hӧp EM (Effect Microbiology – vi sinh vұt hӳu hiӋu) trong xӱ lý rác thҧi. 6.5. Saccaraza và glucooxydaza. - Saccaraza: ÿây là mӝt nhóm enzim bao gӗm: invertaza, dextranaza, levansaccaraza... xúc tác thuӹ phân các liên kӃt glucozit cӫa saccaroza và mӝt vài loҥi ÿѭӡng khác. Trong Vӕ các enzim này thì invertaza (B-D-fructofaranozit – fructohidrolaza, mã sӕ 3.2.1.26 EC) là có ý nghƭa khoa hӑc và thӵc tiӉn hѫn cҧ. Enzim này rҩt phә biӃn trong nҩm men và Qҩm mӕc: Saccharomyces cerevisiae, Sach. Carlsbergensis, Sach. Pastenriabus, Aspergillus Oyae, Asp. Niger... Invertaza là enzim nӝi bào (endoenzyme), pHop = 4,5, top = 65 – 700C. Invertaza ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi trong công nghӋ thӵc phҭm ÿӇ nghӏch ÿҧo ÿѭӡng chӕng hiӋn tѭӧng kӃt tinh ÿѭӡng (lҥi ÿѭӡng) trong sҧn xuҩt bánh kҽo (dung dӏch ÿѭӡng Qӗng ÿӝ 65% thì kӃt tinh nhѭng có invertaza thì ӣ nӗng ÿӝ 80% vүn không kӃt tinh), tăng ÿӝ ngӑt khi thuӹ phân ÿѭӡng saccaroza thành glucoza và fructoza, sҧn xuҩt bӝt mǤ nhân Wҥo, sҧn xuҩt dӏch ÿѭӡng y tӃ (dӏch truyӅn glucoza). - Enzim oxy hoá: glucooxydaza – catalaza. + Glucooxydaza (B-D-glucoza: O2 oxydoreductaza; 1.1.3.4 EC) là enzim oxy hoá - khӱ, chӍ tác dөng lên B-D glucoza khi có mһt oxy, oxy hoá glucoza thành gluconic và H2O2: + Catalaza: mӝt enzim oxy hoá – khӱ hay ÿi cùng enzim glucooxydaza ÿӇ khӱ hoá H2O2 tiӃp tөc: 7әng hӧp cҧ (1) và (2) ta có: C6H12O6 + O2 + H2O Glucooxydaza C6H12O7 + H2O2 (1) H2O2 catalaza H2O + 1/2O2 (2) C6H12O6 + 1/2O2 C6H12O7 (3) CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 67 7ӭc là cӭ 1 phân tӱ gam glucoza cҫn 0,5 ptg O2. Tính chҩt này cӫa enzim có mӝt ý nghƭa thӵc tӃ rҩt lӟn là phӭc hӋ enzim này có thӇ loҥi bӓ oxy trong môi trѭӡng phҧn ӭng, tránh ÿѭӧc sӵ oxy hoá bӣi chính oxy không khí (môi trѭӡng). Nhѭ vұy có thӇ kéo dài thӡi gian bҧo quҧn mà không cҫn phҧi tác ÿӝng cӫa biӋn pháp hút chân không (ÿóng gói chân không). Glucooxydaza có nhiӅu ӣ các loài nҩm mӕc Penicilium notatun, Pen.chrysogenum, Pen.vitale, Aspergillus.Niger. + ChӃ phҭm enzim glucooxydaza và ÿһc biӋt là nӃu dùng kӃt hӧp vӟi chӃ phҭm Catalaza có rҩt nhiӅu ӭng dөng trong thӵc tiӉn: 1) Chӕng rӍ mһt trong các bao bì kim loҥi 2) Nâng cao giá trӏ cӫa bӝt lòng trҳng trӭng (albumin): Trong albumin có mӝt Oѭӧng ÿѭӡng glucoza tӵ do 0,5%, lѭӧng ÿѭӡng này là tác nhân tham gia phҧn ӭng Maillard làm sүm màu bӝt trӭng trong thӡi gian bҧo quҧn. Có thӇ loҥi trӯ tác ÿӝng này Eҵng chӃ phҭm enzim glucooxydaza nhѭ trên. 3) Bҧo quҧn bӝt sӳa, ÿӗ cӭng không có rѭӧu, cà phê, dҫu mӥ, phomat, ÿӗ hӝp. 4) Giӳ tѭѫi rau quҧ trѭӟc khi dҩm chín nhѭ: chuӕi, cà chua, táo,...Muӕn vұy ngѭӡi ta gói enzim cùng vӟi glucoza, chҩt ÿӝn rӗi cho vào giӳa khӕi quҧ tѭѫi ÿang bҧo quҧn kín. Enzim sӁ loҥi trӯ oxy trong môi trѭӡng bҧo quҧn ÿӇ giӳ cho quҧ tѭѫi lâu. 5) TiӃn hành các phân tích hoá sinh chҭn ÿoán bӋnh nhѭ: phân tích ÿѭӡng trong huyӃt, nѭӟc tiӇu (bӋnh tiӇu ÿѭӡng, tăng, hҥÿѭӡng huyӃt). CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 68 Chѭѫng 7: PHѬѪNG PHÁP XÁC ĈӎNH HOҤT ĈӜ MӜT SÔ LOҤI ENZIM (Copfacto: chҩt phӕi hӧp hay chҩt cӝng tác cӫa enzim DEAE – celluloza: diethylamino – athylcelulose) 7.1. Ĉѫn vӏÿo hoҥt ÿӝ: 0ӭc ÿӝ hoҥt ÿӝng cӫa enzim trong chӃ phҭm là thông tin quan trӑng vӅ lѭӧng enzim trong ÿӕi tѭӧng nghiên cӭu, vì rҵng trong nhӳng ÿLӅu kiӋn xác ÿӏnh, tӕc ÿӝ phҧn ӭng enzim tӍ lӋ vӟi lѭӧng enzim trong hӛn hӧp phҧn ӭng. Lѭӧng enzim theo quy ѭӟc quӕc tӃ ÿѭӧc biӇu diӉn bҵng ÿѫn vӏ enzim: Ĉѫn vӏ tiêu chuҭn enzim là lѭӧng enzim có khҧ năng xúc tác chuyӇn hóa 1 micro mol Fѫ chҩt sau 1 phút ӣ nhӳng ÿLӅu kiӋn xác ÿӏnh cho trѭӟc - Trong trѭӡng hӧp enzim chӍ phân giҧi mӝt sӕ liên kӃt cӫa phân tӱ cѫ chҩt (ví dө proteinaza vӟi cѫ chҩt protein, amilaza vӟi cѫ chҩt tinh bӝt) thì ÿѫn vӏ hoҥt ÿӝ tiêu chuҭn Fӫa enzim không tính micromol cѫ chҩt bӏ chuyӇn hoá mà tính bҵng micromol ÿѭѫng Oѭӧng cӫa các nhóm tѭѫng ӭng ÿѭӧc tҥo thành. Tӭc là tính theo sӕ liên kӃt (peptit hay glucozit) bӏ phân giҧi. - Trong trѭӡng hӧp phҧn ӭng giӳa 2 loҥi phân tӱ theo kiӇu thì ÿѫn vӏ enzim là lѭӧng enzim xúc tác chuyӇn hóa 1 micromol cѫ chҩt A hoһc B, hoһc 2 micromol cѫ chҩt A (hoһc B) nӃu A=B sau 1 phút. - Khi xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim trong pha lӓng (dӏch thӇ) thì tính sӕÿѫn vӏ enzim trong 100 ml. - &ѫ chҩt dùng các ÿѫn vӏ dүn xuҩt cӫa ÿѫn vӏÿӇ biӇu diӉn: mili ÿѫn vӏ, kilô ÿѫn vӏ. - Trong quá trình tách và làm sҥch (tinh chӃ) enzim thì ÿӇÿánh giá hiӋu quҧ cӫa quá trình này, ngѭӡi ta dùng ÿѫn vӏ hoҥt riêng: ÿó là sӕÿѫn vӏ enzim tính trên 1 mg protein. Ĉѫn vӏ này ÿánh giá mӭc ÿӝ thuҫn khiӃt cӫa enzim. - 1Ӄu biӃt chính xác trӑng lѭӧng phân tӱ cӫa enzim thì có thӇ xác ÿӏnh ÿѭӧc hoҥt ÿӝ phân tӱ cӫa nó: là sӕ phân tӱ cѫ chҩt (hoһc sӕ ÿѭѫng lѭӧng các nhóm tѭѫng ӭng) bӏ chuyӇn hoá dѭӟi tác dөng cӫa 1 phân tӱ enzim sau 1 phút. - 1Ӄu biӃt ÿѭӧc sӕ trung tâm hoҥt ÿӝng trong phân tӱ enzim có thӇ biӃt ÿѭӧc hoҥt ÿӝ cӫa trung tâm xúc tác. Ĉó là sӕ phân tӱ cѫ chҩt bӏ chuyӇn hoá do 1 trung tâm xúc tác cӫa enzim sau 1 phút. Nhѭ vұy nӃu enzim chӍ có mӝt trung tâm xúc tác thì ÿҥi lѭӧng này trùng vӟi hoҥt ÿӝ phân tӱ enzim. - 1ӗng ÿӝ enzim trong dung dӏch ÿѭӧc biӇu diӉn bҵng sӕÿѫn vӏ hoҥt ÿӝng trong 1 ml. - Nhӳng ÿLӅu cҫn lѭu ý khi xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim: + Bҧn chҩt các enzim là protein nên thѭӡng không bӅn vӳng, rҩt nhҥy cҧm vӟi các tác nhân lý, hoá. Vì vұy khi làm thí nghiӋm vӟi enzim cҫn tránh các yӃu tӕ có thӇ gây A + B C + D CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 69 biӃn tính vô hoҥt enzim nhѭ: t0 cao, pH quá axit, quá kiӅm, kim loҥi nһng và muӕi cӫa chúng...tránh tҥo bӑt trong dung dӏch vì mӝt sӕ enzim có thӇ bӏ kìm hãm trên bӅ mһt phân chia pha. + Các ÿLӅu kiӋn (thông sӕ) phҧn ӭng (t0, pH, áp suҩt...) phҧi ӣ trong giӟi hҥn enzim có thӇ tӗn tҥi bӅn vӳng và ÿѭӧc giӳ cӕÿӏnh trong suӕt thӡi gian phҧn ӭng. Muӕn Yұy phҧi tiӃn hành phҧn ӭng trong dung dӏch có pH xác ÿӏnh, bình phҧn ӭng phҧi ÿһt trong máy siêu әn nhiӋt, các chҩt phҧn ӭng (cѫ chҩt, cofacto...) phҧi có nhiӋt ÿӝ cӫa bình phҧn ӭng trѭӟc khi nҥp vào. + Phҧn ӭng enzim ÿѭӧc tiӃn hành trong ÿLӅu kiӋn dѭ cѫ chҩt và cofacto. Cҫn tính trѭӟc ÿӇ sao cho khi kӃt thúc phҧn ӭng chӍ cô ÿӝ 20% cѫ chҩt ban ÿҫu bӏ chuyӇn hoá. trѭӟc ÿó cҫn xác ÿӏnh nӗng ÿӝ cѫ chҩt thích hӧp cho phҧn ӭng bҵng các thí nghiӋm qui hoҥch ÿӝng. + Thӡi gian xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ không nên quá lâu, thѭӡng trong khoҧng 5 – 30 phút. 7ӕt nhҩt là xác ÿӏnh tӕc ÿӝ phҧn ӭng ӣ phút ÿҫu tiên (30 – 60s) vì tӕc ÿӝ phҧn ӭng әn ÿӏnh enzim chѭa bӏ các tác ÿӝng ҧnh hѭӣng nhiӅu ÿӃn hoҥt ÿӝ. Trong mӝt sӕ trѭӡng hӧp QӃu hoҥt ÿӝ enzim quá thҩp hay cҫn nghiên cӭu ҧnh hѭӣng cӫa mӝt sӕ yӃu tӕ hoá hӑc, hoá sinh (kim loҥi, gӕc axit, bazѫ...) cҫn phҧi ӫ enzim vӟi cѫ chҩt có yӃu tӕ khҧo sát trong thӡi gian ÿӫ lâu (>1h). + Khi xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim, bên cҥnh mүu thí nghiӋm (enzim tác dөng vӟi cѫ chҩt) cҫn làm mүu kiӇm tra (kiӇm chӭng, mүu trҳng) trong ÿó enzim ÿã bӏ mҩt hoҥt ÿӝng (hoһc không có enzim) trѭӟc khi tiӃp xúc vӟi cѫ chҩt. Mүu này cNJng thӵc hiӋn giӕng mүu thí nghiӋm nhѭng chӍ khác là phҧi vô hoҥt (ÿình chӍ hoҥt ÿӝ) enzim hoһc là không thêm enzim. Hoҥt ÿӝ enzim ÿѭӧc tính bҵng hiӋu sӕ lѭӧng cѫ chҩt (hay sҧn phҭm phҧn ӭng) giӳa mүu thí nghiӋm và kiӇm tra. 7.2. Các phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim: Có thӇ phân chia thành 2 loҥi phѭѫng pháp: liên tөc và gián ÿRҥn. - Phѭѫng pháp liên tөc: sӱ dөng máy móc, thiӃt bӏÿһc biӋt hoҥt ÿӝng tӵÿӝng liên tөc (chuҭn ÿӝ, so sánh, ÿo ÿҥc) vӟi cѫ cҩu tӵÿӝng ghi lҥi liên tөc sӵ biӃn ÿәi cӫa các chҩt và các thông sӕ phҧn ӭng (hiӇn thӏ bҵng bҧng, biӇu, ÿӗ thӏ, biӇu ÿӗ, enzim ÿӗ...) trong suӕt thӡi gian tác dөng cӫa enzim. Nhѭ vұy phѭѫng pháp này có nhiӅu ѭu ÿLӇm, hoàn toàn tӵÿӝng, có kӃt quҧ ngay, cùng Pӝt lúc có thӇ có nhiӅu mүu theo mӝt chѭѫng trình ÿӏnh sҹn. Ĉây là xu hѭӟng và thӵc tiӉn hiӋn nay vӟi công nghӋ cao (high – tech) - Phѭѫng pháp gián ÿRҥn: cho enzim tác dөng vӟi cѫ chҩt, sau nhӳng khoҧng thӡi gian nhҩt ÿӏnh thì lҩy mүu phҧn ӭng ÿӇ phân tích kӃt quҧ. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 70 Có thӇ gӑi phѭѫng pháp này là phѭѫng pháp cәÿLӇn nhѭng hiӋn nay vүn còn ÿѭӧc sӱ Gөng phә biӃn trѭѫng nghiên cӭu thăm dò, sѫ bӝ, thí nghiӋm ÿҥi cѭѫng, ÿӏnh tính. ChӍ có Pӝt sӕ ít thao tác vӟi enzim tinh khiӃt ÿѭӧc xem là hiӋn ÿҥi. Sau ÿây ta xem xét mӝt sӕ phѭѫng pháp cө thӇ. 7.2.1. Phѭѫng pháp ÿo ÿӝ nhӟt: Thѭӡng dùng cѫ chҩt cӫa enzim có ÿӝ nhӟt lӟn hѫn (hoһc nhӓ hѫn) sҧn phҭm phân huӹ cӫa nó. Sӵ biӃn ÿәi ÿӝ nhӟt này là thѭӟc ÿo hoҥt ÿӝ enzim. Phѭѫng pháp này thѭӡng dùng ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim thuӹ phân cho amylaza, proteinaza. 7.2.2. Phѭѫng pháp phân cӵc kӃ: Thѭӡng dùng khi cѫ chҩt cӫa enzim hoһc sҧn phҭm phân giҧi cӫa nó có khҧ năng làm quay mһt phҷng ánh sáng phân cӵc và góc quay riêng cӫa chúng có khác nhau. Ngѭӡi ta thѭӡng dùng phѭѫng pháp này ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ cӫa saccaraza. Cѫ chҩt cӫa enzim này là ÿѭӡng saccaroza có góc quay riêng là +66,50 (phía phҧi). Sҧn phҭm thuӹ phân cӫa nó là glucoza (góc quay riêng +52,50) và fructoza (góc quay riêng là -92,40 - phía trái). Khi enzim tác dөng lên saccaroza theo mӭc ÿӝ thuӹ phân mà góc quay tәng cӝng giҧm dҫn và chuyӇn tӯ phҧi sang trái. Ĉây là phҧn ӭng nghӏch ÿҧo ÿѭӡng rҩt kinh ÿLӇn trong nghiên Fӭu ÿӝng hӑc phҧn ӭng, ÿѭӡng tҥo ra gӑi là ÿѭѫng nghӏch ÿҧo (tӯ phҧi sang trái mһt phҷng ánh sáng phân cӵc). Tác nhân xúc tác thông thѭӡng (không phҧi enzim) là axit vô Fѫ (HCl, H2SO4). 7.2.3. Phѭѫng pháp áp kӃ: Ĉѭӧc dùng khi phҧn ӭng enzim tҥo thành hay hҩp thө khí, chҷng hҥn các loҥi phҧn ӭng oxy hoá có sӵ tham gia cӫa phân tӱ oxy (oxy hoá hiӃu khí), decacboxy hoá, deamin hoá (loҥi CO2, NH3). Ngoài ra có thӇ dùng phѭѫng pháp này ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ cӫa enzim trong quá trình phҧn ӭng không trӵc tiӃp làm biӃn ÿәi thӇ tích nhѭng kho thông qua các phҧn ӭng trung gian tiӃp theo (thӇ hiӋn gián tiӃp hoҥt ÿӝng cӫa enzim và do ÿó thӇ hiӋn hoҥt ÿӝ cӫa nó) lҥi tҥo thành hoһc hҩp thө khí. Ví dө: - Các phҧn ӭng tҥo axit hӳu cѫ do enzim oxy hoá khӱ lipaza xúc tác có thӇ dung dӏch ÿӋm bicacbonat (HCO3-) ÿӇ tҥo thành CO2 (theo phҧn ӭng - Các phҧn ӭng deamin hoá dѭӟi tác dөng cӫa enzim peptithydrolaza, sau phҧn ӭng cho tác dөng vӟi axit nitѫUѫÿӇ tҥo thành N2 - Các phҧn ӭng lên men cәÿLӇn (yӃm khí và hiӃu khí) có thӇ thӵc hiӋn trong bình Enron, hҩp thө CO2 bҵng dung dӏch BaSO4. 7.2.4. Phѭѫng pháp phә quang kӃ: Thѭӡng dùng ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ các enzim mà cѫ chҩt, coenzim hoһc sҧn phҭm phҧn ӭng có khҧ năng hҩp thө ánh sáng khác nhau ӣ nhӳng bѭӟc sóng xác ÿӏnh. Sӵ biӃn ÿәi ÿӝ Kҩp thөӣ bѭӟc sóng ҩy trong quá trình phҧn ӭnh là ÿo hoҥt ÿӝ enzim. Phѭѫng pháp này ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi ÿӇ nghiên cӭu các enzim thuӝc nhóm oxy hoá khӱ oxydoreductaza, chҷng hҥn: - Các ÿehydrogenaza vӟi coenzim NAD+ hoһc NADP+. Tӕc ÿӝ phҧn ӭng enzim ÿѭӧc xác ÿӏnh theo mӭc ÿӝ khӱ hoһc oxy hoá coenzim cӫa chúng. Dҥng khӱ NADH, NADPH và dҥng oxy hoá cӫa các coenzim này khác nhau rõ rӋt vӅ khҧ năng hҩp thөӣ bѭӟc sóng H+ + HCO3- H2O + CO2) (NH3 + HNO HNO3 + N ) CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 71 340 nm, sӵ biӃn ÿәi này phҧn ánh mӭc ÿӝ chuyӇn hoá giӳa 2 dҥng và cNJng chính là tӕc ÿӝ và hoҥt ÿӝ phҧn ӭng enzim. - Enzim tyrosunaza xúc tác sӵ oxy hoá các hӧp chҩt phenol thành các quinon. Phҧn ӭng này làm tăng ÿӝ hҩp thө ӣ bѭӟc sóng 280 nm. Ĉây là phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ tyrosinaza (gӑi là phѭѫng pháp A hay phѭѫng pháp tyrosin 280). Tѭѫng tӵ nhѭ trên, EPPO xúc tác oxy hoá cѫ chҩt pyrpcatechin. Phѭѫng pháp này chӍ cҫn lѭӧng nguyên liӋu nghiên cӭu rҩt ít, lҥi có ÿӝ nhҥy cao, cho phép xác ÿӏnh nhanh chóng, chính xác hoҥt ÿӝ enzim. Vì vұy ÿây là mӝt trong nhӳng phѭѫng pháp ÿѭӧc sӱ dөng phә biӃn nhҩt ÿӇ nghiên cӭu enzim hӑc. Thұm chí có trѭӡng Kӧp phҧn ӭng enzim không làm biӃn ÿәi rõ rӋt quang phә hҩp thө thì mӝt tác nhân khác (enzim hay mӝt tác nhân khác) tác dөng làm sҧn phҭm pҧhm ӭng ÿӇ thay ÿәi sӵ hҩp thө. 7.2.5. Phѭѫng pháp chuҭn ÿӝ liên tөc: Ĉѭӧc dùng ÿӇ nghiên cӭu các phҧn ӭng enzim mà kӃt quҧ cӫa nó tҥo thành axit hoһc bazѫ. Lúc ÿó dùng thiӃt bӏ tӵÿӝng thêm kiӅm hoһc axit vào ÿӇ giӳ pH môi trѭӡng phҧn ӭng cӕÿӏnh, ÿӗng thӡi tӵÿӝng ghi ÿѭӡng biӇu diӉn lѭӧng kiӅm hoһc axit ÿã tiêu tӕn vào phҧn ӭng trung hoà. Lѭu lѭӧng kiӅm hoһc axit này phҧn ánh tӕc ÿӝ phҧn ӭng enzim. Phѭѫng pháp này có thӇÿѭӧc mô tҧ mӣ rӝng ra ÿӇ nghiên cӭu các ÿӕi tѭӧng khác nhѭng trên nguyên tҳc liên tөc ÿӏnh lѭӧng (sҧn phҭm tҥo thành hay lѭӧng cѫ chҩt tiêu hao), chҷng hҥn gián tiӃp ÿo thӃ oxy hoá khӱ vӟi ÿLӋn cӵc tiêu chuҭn khi nghiên cӭu các enzim oxy hoá. 7.2.6. Phѭѫng pháp sҳc ký: Ĉây là phѭѫng pháp hiӋn ÿҥi, hiӋn nay ÿѭӧc sӱ dөng rҩt nhiӅu và trong nhiӅu trѭӡng Kӧp dùng ÿӇ tinh chӃ enzim. Tҩt cҧ các phѭѫng pháp sҳc ký ÿӅu có thӇ áp dөng ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim. Tӯ phѭѫng pháp lâu ÿӡi nhҩt nhѭ sҳc ký giҩy, sҳc ký trao ÿәi ion cho ÿӃn các phѭѫng pháp hiӋn ÿҥi nhѭ sҳc ký lӓng cao áp, sҳc ký khí kӃt hӧp vӟi các phѭѫng pháp phân tích hiӋn ÿҥi khác (phân tích axit ami tӵÿӝng, cӝng hѭӣng tӯ hҥt nhân, cӵc phә). Lѭӧng enzim và cѫ chҩt cNJng nhѭ sҧn phҭm phҧn ánh rҩt ít cNJng cho kӃt quҧ chính xác, nhanh chóng. 7.2.7. Phѭѫng pháp hoá hӑc: Dùng các phҧn ӭng hoá hӑc khác nhau ÿӇ ÿӏnh lѭӧng cѫ chҩt bӏ hao hөt hoһc sҧn phҭm phҧn ӭng tҥo thành dѭӟi tác dөng cӫa enzim. Các phҧn ӭng này thuӝc loҥi atӑ màu ÿһc trѭng, tҥo màu vӟi thuӕc thӱÿһc trѭng, ....nói chung là mӝt dҩu hiӋu ÿӇ nói lên mӭc ÿӝ hay thӡi ÿLӇm kӃt thúc phҧn ӭng. (ví dөÿLӇm tѭѫng ÿѭѫng khi ÿӏnh phân axit – bazѫ ÿѭӧc xác ÿӏnh bӣi sӵÿәi màu fenolftalein, quì tím...) Trong tҩt cҧ các phѭѫng pháp vӯa nêu, tuǤ theo ÿLӅu kiӋn, yêu ccҫu nghiên cӭu thӵc tӃ mà quyӃt ÿӏnh phѭѫng thӭc tiӃn hành (chҷng hҥn tiӃn hành trong ÿLӅu kiӋn thӡi gian nhѭ nhau, hay nӗng ÿӝ enzim, nӗng ÿӝ cѫ chҩt không ÿәi ...) qui hoҥch thӵc nghiӋm ÿӇ xác ÿӏnh các thông sӕ tӕi ѭu. 7.3. Chuҭn bӏ dӏch chiӃt enzim ÿӇ xác ÿӏnh hoҥWÿӝ. ChӃ phҭm enzim có thӇӣ dҥng rҳn, lӓng, bao gӗm giá thӇ (cѫ chҩt, chҩt ÿӝn, hҥt cӕc) các bӝ phұn khác nhau cӫa cѫ thӇ sinh vұt sinh enzim (mô, tӃ bào, khuҭn ty, bào tӱ...) và CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 72 môi trѭӡng sinh tәng hӧp enzim (chӫ yӃu là nѭӟc) có thӇ chӭa cҧ enzim trong ÿó. Trong quá trình nuôi cҩy, nҭy mҫm, enzim có thӇ tiӃn hành vào môi trѭӡng (enzim ngoҥi bào) hoһc enzim tӗn tҥi trong tә chӭc cѫ thӇ sinh vұt (mô, tӃ bào), vì vұy phҧi cҫn xӱ lý nhҵm Oҩy enzim ÿӇ xác ÿӏnh. -9ӟi enzim ngoҥi bào: + NӃu quá trình nuôi cҩy hay tích luӻ enzim bҵng phѭѫng pháp bӅ sâu trong môi trѭӡng lӓng. Sau khi lҩy mүu xong cҫn làm sҥch nhanh chóng xuӕng 00C rӗi ly tâm tӕc ÿӝ cao 5000 – 6000 vòng/phút ÿӇ thu ÿѭӧc dung dӏch trong suӕt. + NӃu quá trình nuôi cҩy hay tích luӻ enzim bҵng phѭѫng pháp bӅ mһt trên môi trѭӡng Uҳn (hay hҥt cӕc) thì lҩy mүu 10 – 20 gam, chiӃt rút bҵng dung dӏch ÿӋm tѭѫng ӭng vӟi pH xác ÿӏnh trong ÿLӅu kiӋn lҥnh (00C) ÿӇ enzim khkông bӏ biӃn tính hay giҧm hoҥt tính, Oѭӧng dung dӏch này khoҧng 200 ml (gҩp 10 – 20 lҫn chӃ phҭm). Lӑc qua phӉu hay ly tâm vҳt ÿӇ thu ÿѭӧc dung dӏch trong suӕt. -9ӟi enzim nӝi bào: Phҧi phá vӥ tӃ bào ÿӇ giҧi phóng enzim tӵ do bҵng nhiӅu phѭѫng pháp: + Phѭѫng pháp cѫ hӑc: phә biӃn nhҩt là nghiӅn thông thѭӡng (trong cӕi sӭ, thuӹ tinh, máy nghiӅn quay tay, máy nghiӅn có ÿӝng cѫ), nghiӅn vӟi cát, vөn thuӹ tinh. + Phѭѫng pháp vұt lý: dùng sóng siêu âm ÿӇ phá vӥ cҩu trúc tӃ bào, mô. + Phѭѫng pháp hoá sinh: dùng enzim thích hӧp (xenluloza, pectinaza) ÿӇ phân huӹ màng tӃ bào, mô ÿӇ giҧi phóng enzim (trѭӟc hӃt có thӇ nhұn ÿѭӧc tӃ bào trҫn rҩt có giá trӏ trong nghiên cӭu tӃ bào hӑc, enzim hӑc). TiӃp ÿó có thӇ dùng các phѭѫng pháp chiӃt rút thích hӧp (dùng dung dӏch ÿӋm, dùng (NH4)2SO4, axeton...) và hӑc ÿӇ nhұn ÿѭӧc dung dӏch trong suӕt Trong trѭӡng hӧp sau khi xác ÿӏnh xong hoҥt ÿӝ cӫa dӏch chiӃt cҫn tính toán hoҥt ÿӝ Fӫa chӃ phҭm ban ÿҫu (qui vӅ hàm lѭӧng chҩt khô tuyӋt ÿӕi) CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 73 TÀI LIӊU THAM KHҦO 1- NguyӉn Trӑng Cҭn (chӫ biên), NguyӉn Thӏ HiӅn, Ĉӛ Thӏ Giang, Trҫn Thӏ HuyӅn, Công nghӋ emzim, NXB Nông NghiӋp TPHCM, 1998. 2- NguyӉn Lân DNJng, Phҥm Thӏ Trân Châu, NguyӉn Thanh HiӅn, Lê Ĉình Lѭѫng, Ĉoàn Xuân Mѭӧn, Phҥm Văn Ty - Mӝt sӕ phѭѫng pháp nghiên cӭu vi sinh vұt Kӑc, tұp III – NXBKH và kӻ thuұt, Hà Nӝi 1987. 3- Lê ngӑc tú (chӫ biên) và các tác giҧ - hoá sinh công nghiӋp NXBĈH và THCN 1977. 4- Lê ngӑc tú (chӫ biên) và các tác giҧ - enzym vi sinh vұt, tұp I, II - NXBKH và kӻ thuұt, Hà Nӝi 1982. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 74 0өc lөc Chѭѫng 1: NGUYÊN LIӊU THU ENZIM VÀ PHÂN BӔ....................................................................3 1.1. Nguӗn ÿӝng vұt: ........................................................................................................................................3 1.2. Nguӗn gӕc thӵc vұt:..................................................................................................................................4 1.3. Nguӗn vi sinh vұt:......................................................................................................................................4 Chѭѫng 2: 6ҦN XUҨT CÁC CHӂ PHҬM ENZIM TӮ VI SINH VҰT............................................5 2.1. ĈLӅu hoà quá trình sinh tәng hӧp enzim trong môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt..............................5 2.2. TuyӇn chӑn và cҧi tҥo giӕng vi sinh vұt cho enzim có hoҥt lӵc cao:...............................................11 2.3. Phѭѫng pháp bҧo quҧn giӕng vi sinh vұt :..........................................................................................12 2.4. Môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt sinh tәng hӧp enzim:......................................................................13 2.5. Các phѭѫng pháp nuôi cҩy vi sinh vұt:................................................................................................17 2.6. Tách và làm sҥch chӃ phҭm enzym :....................................................................................................22 Chѭѫng 3: .Ӻ THUҰT SҦN XUҨT CHӂ PHҬM TӮ HҤT CӔC NҬY MҪM (MALT).........24 3.1. Nguyên liӋu ÿҥi mҥch:............................................................................................................................24 3.2. Làm sҥch và phân loҥi hҥt:.....................................................................................................................25 3.3. 5ӱa, sát trùng và ngâm hҥt:....................................................................................................................26 3.4. 1ҭy mҫm:.................................................................................................................................................28 3.5. 6ҩy malt:....................................................................................................................................................34 3.6. Tách mҫm, rӉ, bҧo quҧn malt:...............................................................................................................37 3.7. .ӻ thuұt sҧn xuҩt mӝt sӕ loҥi malt ÿһc biӋt:.........................................................................................38 Chѭѫng 4: 6ҦN XUҨT ENZIM TӮ THӴC VҰT..................................................................................40 4.1. 6ҧn xuҩt ureaza tӯÿұu rӵa:.....................................................................................................................40 4.2. Thu nhұn bromelain tӯ dӭa:..................................................................................................................40 Chѭѫng 5: ENZIM CӔĈӎNH.......................................................................................................................44 5.1. Giӟi thiӋu chung:......................................................................................................................................44 5.2. 0ӝt sӕ phѭѫng pháp chӫ yӃu chӃ tҥo enzim cӕÿӏnh :......................................................................44 5.3. 0ӝt sӕ liên kӃt trong viӋc cӕÿӏnh enzim.............................................................................................45 5.4. Ҧnh hѭӣng cӫa sӵ cӕÿӏnh ÿӃn hoҥttính cӫa enzim...........................................................................46 5.5. Các reactor chӭa enzim cӕÿӏnh:...........................................................................................................48 5.6. . Sӱ dөng enzim cӕÿӏnh trong y hӑc và trong công nghiӋp:.............................................................50 Chѭѫng 6: GIӞI THIӊU MӜT SӔ LOҤI ENZIM CHӪ YӂU VÀ KHҦ NĂNG ӬNG 'ӨNG 55 6.1. Amylaza....................................................................................................................................................55 6.2. Proteaza.....................................................................................................................................................58 6.3. Pectinaza....................................................................................................................................................60 6.4. Xenluloza:.................................................................................................................................................64 6.5. Saccaraza và glucooxydaza...................................................................................................................66 Chѭѫng 7: PHѬѪNG PHÁP XÁC ĈӎNH HOҤT ĈӜ MӜT SÔ LOҤI ENZIM............................68 7.1. Ĉѫn vӏÿo hoҥt ÿӝ:...................................................................................................................................68 CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Trang: 75 7.2. Các phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim:.........................................................................................69 7.3. Chuҭn bӏ dӏch chiӃt enzim ÿӇ xác ÿӏnh hoҥWÿӝ....................................................................................71