Chọn giống cây trồng ngắn ngày - Chuơng 5: Sức sống và bệnh hạt giống

1 1 Chương 5 Sức sống và bệnh hạt giống 2 1. Sức sống hạt giống 1.1. Khái niệm: Hiệp hội kiểm nghiệm hạt giống quốc tế (International Seed Testing Association) định nghĩa:Toàn bộ đặc tính xác định tiềm năng của hạt trong hoạt động sống, thực hiện trao đổi chất hoặc mất năng lượng trong quá trình nảy mầm và xuất hiện cây con. Năm 1979, Uỷ ban phân tích sức sống hạt giống Quốc tế đa ra định nghĩa khác: Sức sống hạt giống là đặc tính của hạt xác định tiềm năng nảy mầm nhanh, đồng nhất và phát triển thành cây con bình thường trên đồng ruộng”. 3 Trong đó định nghĩa phản ánh 4 khả năng của hạt:  Hoạt động trao đổi chất phản ánh hoạt động hô hấp của hạt.  Tỷ lệ nảy mầm cao, đồng nhất và sinh trưởng cây con.  Tỷ lệ nhú, đồng nhất và sinh trưởng của cây con trên đồng ruộng.  Khả năng nhú cây con trong điều kiện phù hợp 4 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống hạt giống:  Yếu tố di truyền  Môi trường và dinh dưỡng của cây mẹ  Giai đoạn chín khi thu hoạch  Kích thước hạt  Khối lượng hạt  Tính toàn vẹn của hạt  Sự hư hỏng và tuổi hạt  Sâu bệnh 5 Vật chất di truyền Các nhà chọn giống cải tiến những đặc điểm của hạt như độ chắc, chống chịu sâu bệnh, hàm lượng protein và kích thước hạt để nâng cao sức sống của hạt. Những yếu tố trên ảnh hưởng đến nảy mầm đồng ruộng và nâng cao năng suất cây trồng. Ngoài ra các nhà chọn giống cũng quan tâm đến sức sống của hạt lai. 6 Sức sống ưu thế lai  Sức sống ưu thế lai là sự thể hiện của con lai có giá trị cao hơn bố mẹ tự phối.  Sự vượt trội của con lai biểu hiện tốt trong điều kiện có áp lực (stress condition).  Ví dụ: Hạt ngô lai, lúa lai có thể nảy mầm và sinh tr- ưởng nhanh hơn hẳn bố mẹ của chúng.  Tiềm năng sinh trưởng này do các cơ quan tử và hệ thống enzim bổ sung trong quá trình hấp thu và sử dụng carbon. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nụng Học ) - Học Viện Nụng Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 2 7 Độ chắc của hạt  Hạt cứng là một đặc tính di truyền không phù hợp cho quá trình nảy mầm.  Tuy nhiên tính trạng hạt cứng của một số giống cây trồng giúp bảo vệ hạt với tuổi thọ hạt.  Khắc phục tính rắn chắc của hạt bằng cách lai giữa một dòng hạt mềm với một dòng rất rắn ở thế hệ F1 là dạng trung gian hoặc gần mềm như bố mẹ. 8 Tổn thơng cơ giới  Tổn thương cơ giới xảy ra trong quá trình thu hoạch, chế biến hạt, tính mẫn cảm với tổn thương cơ giới được điều khiển bởi di truyền.  Atkin (1958) và Wester (1970) đã chứng minh các giống ngô nổ chống chịu cơ giới tốt hơn các giống ngô trắng.  Walters và Caviness khi nghiên cứu sức sống của hạt đậu tương cho thấy tính tổn thương của hạt là tính trạng di truyền số lượng từ đó gợi ý cho các nhà chọn giống quan tâm cải tiến chất lượng hạt thông qua chọn tạo giống cải tiến. 9 Thành phần hoá học của hạt  Giống ngô có hàm lượng lysine cao thường sức khoẻ hạt giống yếu, hạt nhỏ, hạt co ngót méo mó.  Nass và Crane (1970) đã tìm ra rất nhiều gen cho biểu hiện của nội nhũ ảnh hưởng đến nảy mầm của hạt ở 15, 20 và 25oC. Những hạt có gen A1 tạo ra hạt giống có sức khoẻ tốt hơn không có gen này. 10 Môi trường trong quá trình phát triển của hạt  Môi trường ảnh hưởng đến phát triển và chất lượng của hạt giống. Vì vậy khi sản xuất giống phải được thực hiện ở những vùng thuận lợi.  Điều kiện môi trường làm giảm sâu bệnh hại hạt cũng như rủi ro trong giai đoạn thu hoạch. 11 Độ ẩm và dinh dưỡng trong đất  Độ ẩm không thích hợp trong quá trình phát triển của hạt dẫn đến sức sống hạt giống thấp.  Độ phì nhiêu của đất thấp dẫn đến cây trồng có hạt nhỏ. Hạt của những cây mép ruộng thường có sức sống và sức khoẻ hạt giống tốt hơn.  Legatt (1948) chứng minh rằng hạt đậu thiếu hụt Boric sẽ tạo ra cây con không bình thường. 12  Hạt đậu tương sản xuất ở nơi đất có molypden cao chúng không yêu cầu bón phân molypđen khi trồng ngay cả điều kiện đất thiếu molypđen.  Lạc mẫn cảm đặc biệt với đất thiếu các nguyên tố vi lượng. Đất có Bo và Ca thấp tạo ra hạt lạc biến màu, rễ hút nước kém.  Lúa mỳ bón nhiều đạm là nguyên nhân tăng protein trong hạt và tăng tỷ lệ nảy mầm và sức khoẻ hạt giống. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nụng Học ) - Học Viện Nụng Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 3 13 Độ chín của hạt Mc. Donald (1975) cho rằng có mối liên hệ giữa thông số chín của hạt với kích thước hạt và sức sống hạt giống. Hạt đậu tương lớn biểu hiện nảy mầm, sức sống cũng như tiềm năng năng suất tốt hơn hạt đậu tương nhỏ. Hạt ngô lai tỷ lệ nảy mầm không phụ thuộc vào kích thước hạt. Như vậy sức sống hạt giống phụ thuộc chủ yếu vào độ chín của hạt chứ không phải là kích thước hạt lớn hay bé. 14 Môi trường thu hoạch và sau thu hoạch  Sự hư hỏng hạt giống sau khi chín, trước thu hoạch do ảnh hưởng của môi trường làm giảm nhanh giá trị gieo trồng và sức khoẻ hạt giống (ví dụ như: ma và độ ẩm cao).  Simpson và Stone (1935) chứng minh rằng hạt giống bông mất khả năng gieo trồng 20-30% sau 1 tuần dưới điều kiện mưa.  Hạt đậu tương thu hoạch chậm vì thời tiết cũng mất khả năng gieo trồng và dễ bị tổn thương trong quá trình thu hoạch, chế biến và bảo quản. 15 * Bảo quản hạt giống Thời gian bảo quản, phương pháp bảo quản và môi trường bảo quản (nhiệt độ, độ ẩm và hàm lượng oxy) có ảnh hưởng đến sức sống hạt giống. 16 1.3. Kiểm tra sức sống hạt giống Kiểm nghiệm sức sống hạt giống thông qua một số thông số có thể lượng hoá được.  Thông thường là những thông số xác định sự suy thoái của hạt.  Tất cả những thay đổi trong quá trình hư hỏng của hạt giống có liên quan đến sức sống của hạt. 17  Sức sống hạt giống là một chỉ tiêu rộng hơn nảy mầm Kiểm nghiệm sức sống hạt giống là một chỉ số quan trọng hơn tiêu chuẩn nảy mầm trong đánh giá chất lượng hạt giống. Những biến đổi trước khi mất khả năng nảy mầm đều được sử dụng làm cơ sở để kiểm nghiệm sức sống hạt giống. Thông số có thể xác định sớm quá trình mất khả năng nảy mầm là những biến đổi suy thoái thành tế bào, vì vậy cần kiểm nghiệm tính toàn vẹn của thành tế bào. 18 Màng tế bào là một chỉ tiêu kiểm tra sức sống vì: Thành tế bào là nơI diễn ra các hoạt động trao đổi chất của hạt giống bao gồm hoạt động hô hấp cung cấp năng lượng cho hạt trong suốt quá trình nảy mầm và sinh trưởng. Màng lới nội chất cũng là một cơ quan tử của màng tế bào trên đó có rất nhiều enzim hình thành nên axít Ribonucleic để sao mã. Do vậy bất kỳ một suy giảm chức năng nào của thành tế bào cũng giảm nguồn năng lượng tổng số ATP được hình thành. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nụng Học ) - Học Viện Nụng Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 4 19 Hoạt động trao đổi chất là một chỉ tiêu đánh giá sức sống:  Mức ATP, RNA và hô hấp giảm sau bảo quản tạo điều kiện già tự nhiên nhanh của hạt giống.  Mất khả năng hô hấp và tổng hợp hoá sinh dẫn đến tỷ lệ nảy mầm giảm và mất tính đồng đều của hạt giống. Một số chỉ tiêu khác:  Thời gian bảo quản  Nhiễm sâu bệnh, hạt hư hỏng do bất thuận về môi trường cũng biểu hiện làm giảm tỷ lệ nảy mầm đồng ruộng.  Thông số cuối cùng để đánh giá sức sống hạt giống là: Tỷ lệ nảy mầm. 20 Kiểm nghiệm sức sống hạt giống có thể phân ra thành nhiều loại trên cơ sở các thông số giám định: Kiểm nghiệm trực tiếp: là kiểm nghiệm trực tiếp trên môi trường đồng ruộng với một số phương pháp để xác định được khả năng nảy mầm dưới điều kiện bất lợi đồng ruộng. Ví dụ: Kiểm nghiệm lạnh là đưa hạt giống thử trên điều kiện lạnh của đồng ruộng (nơi có nhiệt độ thấp). Kiểm nghiệm gián tiếp: Là xác định những thành phần sinh lý đặc thù của hạt ví dụ test độ dẫn điện để giám định liên kết của tế bào. 21 Kiểm nghiệm sức sống hạt giống cũng có thể phân loại trên cơ sở tổ hợp các thành phần xác định sức sống hạt giống. Kiểm nghiệm sinh lý: xác định một số khía cạnh sự nảy mầm của hạt hoặc sinh trưởng của cây con. Kiểm nghiệm sinh hoá: đánh giá các phản ứng hoá học như hoạt động enzim hoặc hô hấp liên quan đến biểu hiện của sự nảy mầm. Kiểm nghiệm vật lý: như kích thước hạt, mật độ hạt, độ chín của hạt.. có liên quan đến sức sống hạt giống. 22 Một phương pháp khác để xác định sức sống hạt giống phân ra hai loại là kiểm nghiệm môi trường bất thuận và kiểm nghiệm nhanh. Kiểm nghiệm môi trường bất thuận (Stress Test): là kiểm nghiệm trên một hay một số môi trường khác nhau như: nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp, có đất hoặc không có đất, loại đất cho vào môi trường đánh giá có tính chất khác nhau (chủ yếu đánh giá sự nảy mầm - lá mầm, chiều dài mầm..) Kiểm nghiệm nhanh: các phản ứng hoá học liên quan đến sức sống hạt giống, không mất thời gian lâu như kiểm nghiệm trong điều kiện bất thuận. 23 1.4. Nguyên tắc kiểm tra sức sống hạt giống Chi phí thấp Chi phí lao động, trang thiết bị các phòng thí nghiệm, phương tiện dụng cụ cần tính toán rất kỹ lưỡng vì nếu không chi phí kiểm nghiệm một mẫu hạt giống cao khó được thực tế chấp nhận. Nhanh Nhiều phương pháp kiểm nghiệm tuy nhiên lựa chọn phương pháp cho kết quả nhanh nhất để đáp ứng yêu cầu của sản xuất và nhà kinh doanh hạt giống. 24 Không phức tạp Lựa chọn phương pháp đơn giản phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm để không phải trang bị hay đào tạo thêm. Đạt được mục tiêu kiểm tra Đảm bảo chính xác tiêu chuẩn hoá các chỉ số số lượng và của chất lượng tránh sử dụng những mẫu thay thế. Tương đương với thực hiện trên đồng ruộng 5 25 1.5. Các phương pháp kiểm tra sức sống hạt giống  Thông thường kiểm nghiệm sức sống hạt giống được thực hiện trong điều kiện tối ưu do vậy kết quả thường cao hơn thực tế đồng ruộng.  Vì vậy ngoài kiểm nghiệm trong phòng cần kiểm nghiệm đồng ruộng bổ xung là cần thiết để đánh giá sức sống hạt giống có kết quả tin cậy hơn.  Một số phương pháp đợc chấp nhận của người sản xuất và kinh doanh hạt giống được trình bày sau đây: 26 a. Xử lý lạnh  Kiểm tra trong điều kiện lạnh là phương pháp sớm nhất để đánh giá sức sống hạt giống, được áp dụng rộng rãi với ngô, đậu tương.  Hạt được đặt trong môi trường đất hoặc giấy thấm và lạnh cho những giai đoạn đặc thù, trong giai đoạn này có hoạt động hấp phụ và hoạt động của vi sinh vật.  Tiếp theo xử lý lạnh hạt được đặt trong điều kiện thuận lợi cho nảy mầm và sinh trưởng. 27 b. Xử lý thúc đẩy già hoá nhanh Nguyên lý của phương pháp là xử lý hạt trong một thời gian nhất định ở 2 môI trường thay đổi. Xử lý hạt ở điều kiện nhiệt độ cao (41oC) và độ ẩm (100%) trong thời gian ngắn 3-4 ngày. Hạt sau xử lý chuyển ra điều kiện nảy mầm tối ưu Phương pháp này nhanh, ít tốn kộm và sử dụng cho tất cả các loài và có thể đánh giá từng hạt. Kết quả đánh giá đáng tin cậy nhưng chú ý độ ẩm hạt trước khi xử lý. 28 c. Kiểm tra thông qua tính dẫn điện  Thành tế bào bị hư hỏng, dung dich tế bào chất phóng thích ra môI trường, dung dịch này có đặc tính dẫn điện nên có thể phát hiện được bằng các máy đo độ dẫn điện.  Tuy nhiên độ ẩm ban đầu của hạt, kích thước hạt có ảnh hưởng đến tỷ lệ các chất phóng thích ra từ hạt nên cần có những tiêu chuẩn nhất định.  Hạt đã xử lý bằng những chất kháng sinh cũng có thể ảnh hưởng đến tính dẫn điện nên phải làm sạch các chất xử lý hạt trước khi kiểm nghiệm bằng phương pháp này. 29 e- e- e- e- 30 d. Xử lý nảy mầm mát Thực hiện ở phòng thí nghiệm tiêu chuẩn với mức nhiệt độ thấp 18oC và không dựa vào hoạt động của vi sinh vật để áp lực cho sự nảy mầm của hạt. Những cây trồng nhiệt đới (cây bông) thì sức sống, nảy mầm và sinh trưởng kém hơn. Kết quả kiểm tra sử dụng giải thích cho nguyên lý sức sống hạt giống tốt là có thể tạo ra một cây bình thường. 6 31 e. Tỷ lệ sinh trởng của cây con  Sức sống hạt giống là khả năng để tổng hợp có hiệu quả các vật chất mới và chuyển sản phẩm này đến phôi nảy mầm kết quả tăng trọng lượng khô. Tỷ lệ sinh trưởng của cây con xây dựng trên cơ sở nguyên lý này.  Sức sống hạt giống được biểu hiện mg trọng lượng khô của cây con (mg/cây con).  Sau khi đánh giá các phần sinh trưởng của phôi thành một cây con bình thờng tạo nên từ các cơ quan dự trữ (lá mầm hoặc phôi), cây con được sấy khô trong cốc thí nghiệm ở nhiệt độ 80oC trong 24 giờ để xác định tốc độ tăng trọng lượng chất khô của nó. 32 * Phân loại sức khoẻ cây con  Phân loại sức khoẻ cây con thành ba mức: 1. Yếu, 2. Bình thờng 3. Khoẻ.  Phương pháp này không yêu cầu phương tiện và sử dụng thuật ngữ quen thuộc và hấp dẫn với các nhà phân tích hạt giống.  Phương pháp này cũng có hàng loạt những khó khăn như để phân chia cây con bình thường cần rất tỷ mỷ, và dựa các đặc điểm mô tả biến động nhiều. 33 f. Kiểm tra Tetrazolium (TZ) Dựa vào hoạt động của phân tử TZ phản ứng với nguyên tử hydro giải phóng từ hoạt động của các enzim thuỷ phân trong mô sống.  Kết quả hình thành dung dich nước có màu đỏ forman, dựa trên màu đỏ để đánh giá sức sống hạt giống cũng như giá trị gieo trồng của hạt giống. Đặt hạt đã nhuộm màu trong bảng so màu để xác định sức sống ở các mức độ: - Không có khả năng nảy mầm - Sức sống thấp - Sức sống trung bình - Sức sống cao 34 35 g.Tốc độ nảy mầm  Tốc độ nảy mầm là chỉ tiêu để xác định sức sống hạt giống.  Lô hạt nảy mầm giống nhau thường rất khác nhau về tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng. Số ngày để đạt được tỷ lệ nảy mầm 90% là chỉ số nảy mầm của hạt. Để đánh giá lô hạt chất lượng thấp hơn giá trị phần trăm (50%) có thể được sử dụng. 36 Lần đếm cuối cùng Số cây bình thờng +............+ Lần đếm đầu tiên X = Số cây bình thờng Công thức tính tỷ lệ nảy mầm của Maguire: Tỷ lệ nảy mầm tương tự được Czabator (1962), Djavanshir và Pourbeik (1976) đề xuất với cỏc cõy thõn gỗ như sau: 7 37 38 h. Kiểm tra bằng phơng pháp Hiltner (gieo hạt dưới lớp gạch sỏi vụn) Phương pháp gieo hạt dưới lớp gạch, sỏi vụn để xác định khả năng nảy mầm của hạt ngũ cốc khi nhiễm nấm bệnh(Fusarium). Hạt được gieo trong gạch vụn ẩm hoặc trong hộp cát rồi trải lớp gạch vụn ẩm dày 3 cm lên trên. Đặt hộp trong phòng tối điều chỉnh nhiệt độ một thời gian nhất định tùy loài. Những hạt bị bệnh, tổn thương cơ giới hoặc hư hỏng không thể nảy mầm xuyên qua lớp gạch vụn. Phần trăm cây con bình thường được xem là mức độ sức sống hạt giống. 39 i. Xử lý hạt trong dung dịch hạn chế thẩm thấu  Hạt nảy mầm trong các dung dịch có tiềm năng thẩm thấu đặc thù như Sodium clorid (NaCl), Glycerol, Sucrose, Polyethylene Glycol (PEG), và Manitol.  Hạt giống có sức sống tốt là có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện nhân tạo này và do vậy đây là một phương pháp để xác định sức sống hạt giống 40 k. Phương pháp kiểm tra hô hấp  Sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây con yêu cầu sử dụng năng lợng trao đổi chất nhận được từ quá trình hô hấp.  Vì vậy giảm tỷ lệ hô hấp của hạt nảy mầm sẽ giảm sinh trưởng của cây con.  Phương pháp đánh giá sức sống hạt giống thông qua tỷ lệ hô hấp thực hiện nhanh và số lượng mẫu lớn.  Những hạt bị dập vỡ cơ giới kết quả đo không chính xác. 41 2. Bệnh hạt giống 2.1. Vi sinh vật trờn hạt Theo Sinclair (1979) hạt giống là một thế giới vi mụ của vi sinh vật đặc biệt là nấm, vi khuẩn, virus và đụi khi cả giun trũn. Vi sinh vật sống trờn bề mặt của hạt khụng làm mất sức sống của hạt nhưng là nguyờn nhõn làm yếu rễ và cõy con và ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm nảy mầm hạt giống. Vi sinh vật sống ở cỏc bộ phận của hạt như lỏ bắc, vỏ quả và vỏ hạt sẽ xõm nhập vào cõy con, mầm. Một số sống và tồn tại bờn trong hạt như mụ của phụi và nội nhũ cú thể kỡm hóm nảy mầm hay suy yếu cõy con. 42 2.2. Xử lý ngăn ngừa bệnh hạt giống a. Xử lý trước thu hoạch Xử lý bệnh hạt giống trước thu hoạch là một biện phỏp ngăn ngừa bệnh hạt giống hữu hiệu và cú thể thực hiện bằng ba phương phỏp sau: 1) Chọn khu vực sản xuất sạch bệnh 2) Áp dụng kỹ thuật canh tỏc tiến bộ 3) Kiểm tra kỹ lưỡng và loại bỏ sớm cõy bị sõu bệnh 8 43 Ngoài chọn nơi sản xuất cần ỏp dụng kỹ thuật sản xuất tiến bộ là một giải phỏp ngăn ngừa bệnh hạt giống như: Trồng giống sạch bệnh Xử lý hạt giống (bằng thuốc hoỏ học) trước khi gieo trồng Rắc hạt trờn đồng cựng với thuốc trừ nấm, vi khuẩn và thuốc hoỏ học khỏc. Ngắt hay nhổ bỏ cõy bị bệnh Khụng tưới phun tạo mụi trường ẩm độ thuận lợi cho nấm bệnh phỏt triển. Kiểm tra xử lý và loại bỏ cõy bệnh trước khi thu hoạch. 44 Bệnh nấm ở ngụ do độ ẩm mụi trường cao 45 Nấm Fusarium trờn hạt giống lỳa mạch 46 Bệnh ghẻ nấm ở lỳa mạch 47 b. Xử lý trong quỏ trỡnh thu hoạch  Xử lý bệnh hạt giống trong quỏ trỡnh thu hoạch và sau thu hoạch là giải phỏp cuối cựng diệt trừ tận gốc bệnh hại trờn hạt gồm cỏc phương phỏp: + Tẩy uế bề mặt hạt bằng hoỏ chất + Phõn loại hạt bệnh và hạt sạch + Xử lý nước núng + Xử lý chất khỏng sinh hữu cơ  Xử lý chất khỏng sinh và khỏng sinh hữu cơ khụng chỉ xử lý trờn bề mặt hạt một số chất cú thể thấm vào trong hạt nờn diệt cả bệnh nằm trong mụ hạt.  Xử lý nước núng cần xem xột nhiệt độ nước diệt mầm bệnh nhưng khụng gõy hại hạt giống. 48 Treated Untreated Xử lý nấm bệnh trờn hạt đối với giống đậu tương 9 49 2.3 Nấm bệnh liờn kết với hạt  Nấm là nguyờn nhõn lớn nhất gõy hại cõy trồng, trờn hoặc trong hạt và phổ biến hơn bệnh vi khuẩn và virus.  Hơn 8000 loài nấm hại cõy trồng cú trong hạt giống.  Nấm hại hạt giống gồm hai loại ký sinh và hoại sinh.  Nấm hoại sinh khụng lựa chọn ký chủ nờn cú thể tỡm thấy trờn hạt nhiều loài cõy trồng nhưng nấm ký sinh cú sự lựa chọn ký chủ nờn tỡm thấy trong phạm vi một số loài nhất định. 50  Nấm ký sinh gõy thiệt hại sản lượng cõy trồng vỡ: + Nấm ký sinh gõy hại dẫn đến hạt khụng nảy mầm + Nấm ký sinh trờn hạt sau đú phỏt tỏn bệnh trờn đồng ruộng + Nấm ký sinh trờn hạt trước thu hoạch làm giảm năng suất và chất lượng hạt  Nấm gồm tổ hợp cỏc sợi nấm, chỳng sinh sản bằng bào tử như hạt ở thực vật bậc cao.  Cũng như hạt cõy trồng, bào tử nấm rất đa dạng về kớch thước, màu sắc, để nhỡn thấy cần phải quan sỏt bằng kớnh hiển vi.  Một số nấm khụng cú bào tử giới tớnh mà sinh sản bằng cỏc cấu trỳc sinh dưỡng. 51 52 Bệnh trờn củ cõy khoai lang 53 2.4. Phương phỏp xỏc định bệnh nấm hạt giống a. Kiểm tra nấm trờn Agar Agar là cacbohydrat trung tớnh chế từ rong biển, nú chứa một lượng nhỏ dinh dưỡng cho sinh trưởng của nấm, vỡ thế khi kiểm tra cần bổ xung thờm chất chiết từ cõy như củ khoai tõy, quả và rau. Agar trung tớnh được pha chế như sau: agar dạng bột cộng lượng nước phự hợp và bổ sung dinh dưỡng làm mụi trường. Hỗn hợp này được khử trựng trong nồi hấp 15 - 20 phỳt và làm lạnh đến 50oC và cú thể cho thờm chất khỏng sinh. Hỗn hợp rút cẩn thận vào đĩa petri, trỏnh làm nhiễm bẩn, để nguội sau 20 phỳt là cú thể sử dụng được. 54  Hạt kiểm tra làm sạch bề mặt trước bằng NaOCl 1%  Từng hạt được kẹp và đặt lờn mặt agar, đỉnh của kẹp được vệ sinh bằng cỏch nhỳng nú trong cồn 70% rồi hơ qua ngọn lửa đốn cồn.  Sau khi cấy đĩa petri được ủ 20-25oC khoảng 8 ngày với hạt nhiễm bệnh cú thể nhận biết trờn cơ sở đặc điểm của cơ quan sinh dưỡng và bào tử.  Ngày nay cú thể sử dụng đĩa petri nhựa thay thế thuỷ tinh cho phộp tiết kiệm lao động và khụng phải làm sạch sau khi hay trước khi nuụi cấy. 10 55 b. Phương phỏp giấy thấm  Phương phỏp kiểm tra bệnh hạt bằng giấy thấm tương tự như kỹ thuật kiểm tra nảy mầm.  Đặt hạt trờn giấy thẩm ẩm và ủ trong điều kiện thuận lợi cho nấm phỏt triển.  Cho nước bóo hoà vào giấy thấm, nếu nước quỏ đậm thỡ gạn bớt đi trước khi đặt hạt với kẹp, trỏnh hạt dớnh liền nhau.  Hạt trờn giấy thấm cú thể nảy mầm và sinh trưởng.  Nhiều loại nấm được kớch thớch phỏt triển bởi ỏnh sỏng xanh và tối xen kẽ và tiếp theo được xỏc định như phương phỏp agar. 56 c. Phương phỏp tớnh độc  Kiểm tra tớnh độc là tỏch những nấm bệnh nghi ngờ từ kiểm tra trờn agar và giấy thấm.  Nuụi cấy trờn agar để nhận biết bào tử và cơ quan dinh dưỡng của nấm rồi lõy nhiễm lờn cõy trồng (thường là cõy con) để quan sỏt triệu chứng bệnh.  Tiếp sau lại lấy nuụi cấy bệnh lại trờn mụi trường phự hợp để xỏc định chớnh xỏc.  Phương phỏp cú thể sử dụng để nhận biết bất kỳ loại bệnh nào trờn hạt.  Lõy nhiễm mầm bệnh lờn cõy cú thể bằng chớch hoặc phương phỏp khỏc (Phun, rắc và trà cơ học). 57 d. Phương phỏp khụng nuụi cấy  Một số loại bệnh trờn hạt cú thể quan sỏt qua mẫu hạt hoặc kỹ thuật khụng nuụi cấy đặc biệt, vớ dụ nấm cựa gà cú thể quan sỏt thấy khi cú mặt của cỏc vẩy sừng tối và rất lớn tạo nờn quả thể, nấm mốc ở cỏc loại hạt hầu hết cú thể quan sỏt được bằng mắt thường.  Kiểm tra bằng quan sỏt cũng cú hiệu quả với nấm than ở lỳa mỳ, nấm hoa cỳc ở lỳa nước, những nấm này thường vỡ khi tuốt và làm sạch hạt giống, nhưng nú phỏt tỏn đến cỏc hạt khỏc trong lụ hạt và ảnh hưởng nghiờm trọng đến chất lượng hạt giống. 58  Phương phỏp xỏc định tỷ lệ nấm bệnh trong lụ hạt bằng quan sỏt như sau: 1. Làm mềm cỏc hạt bằng ngõm trong dung dịch NaOH qua đờm 2. Tỏch phụi trong nước ấm và gạn lọc lại qua rõy kiểu giõy bột. 3. Rửa nhanh với dung dịch lactophenol và nước, cỏc phụi sẽ nổi cũn vỏ trấu và nội nhũ sẽ chỡm xuống đỏy cú thể gạn đi. 4. Đặt phụi đó tỏch trờn đĩa thuỷ tinh đỏy dày đó được khử trựng trước bằng đun trong lactophenol 10 đến 20 phỳt. 5. Xếp phụi theo trật tự và kiểm tra sợi nấm trờn kớnh kiển vi phúng đại. 59 2.5. Bệnh nấm hoại sinh trờn hạt giống  Nấm hoại sinh sinh trưởng ở cỏc mụ chết, mặc dự nú tồn tại trờn toàn bộ hạt, nhưng chỳng khụng là nguyờn nhõn gõy bệnh cõy trồng như nấm ký sinh.  Bào tử của nấm hoại sinh hầu như tồn tại khắp nơi trờn hạt cũng như trong khụng khớ.  Chỳng cú số lượng rất lớn trờn hạt đó và đang bảo quản và sẽ nẩy mầm, sinh trưởng với số lượng vụ cựng lớn với bất kỳ điều kiện bảo quản nào khụng vượt quỏ độ ẩm 75% và 15oC. 60 Bệnh nấm trờn hạt dưa Bệnh nấm trờn hạt đậu 11 61 2.6. Bệnh vi khuẩn a. Bệnh vi khuẩn hạt giống Bốn phương phỏp kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn cơ bản là: 1 - Quan sỏt nhiễm vi khuẩn trờn cỏc đặc điểm ngoài vỏ hạt 2 - Chuẩn đoỏn trờn triệu chứng của cõy khi lõy nhiễm từ dịch chiết vi khuẩn từ lụ hạt giống 3 - Tỏch chiết vi khuẩn để nhận biết trực tiếp 4 - Phối hợp cỏc phương phỏp trờn. 62 b. Phương phỏp kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn hạt giống  Kỹ thuật huyết thanh  Kỹ thuật huyết thanh trờn cơ sở chuỗi phản ứng giữa khỏng nguyờn và khỏng thể.  Kỹ thuật này cú thể nhận biết dương tớnh của cả vi khuẩn và virus.  Huyết thanh miễn dịch chứa trong khỏng thể đặc thự chuẩn bị như sau: Khỏng nguyờn được nhiễm vào (vi khuẩn hay virus) trong mỏu của động vật, thường là thỏ, mỏu ngay lập tức chống lại khỏng nguyờn bằng tạo ra khỏng thể.  Huyết thanh miễn dịch dựng để kiểm tra cú mặt của vi khuẩn trong hạt giống. 63  Phương phỏp thực hiện:  Hạt giống được nghiền với nước tạo thành dung dịch trộn trong mụi trường agar.  Huyết thanh đối khỏng cho loại vi khuẩn đặc thự được đưa vào mụi trường.  Nếu xảy ra kết tủa chứng tỏ cú mặt của khỏng nguyờn (vi khuẩn gõy hại).  Nếu khụng xảy ra kết tủa tỏc nhõn bệnh khụng cú mặt. 64  Gõy nhiễm cõy trồng  Gõy nhiễm cõy trồng là một phương phỏp hữu ớch để nhận biết vi khuẩn và virus đặc thự gõy hại trong hạt giống.  Hạt kiểm tra được ngõm trong nước đó khử trựng vài giờ sau đú chắt lọc lấy nước và lõy nhiễm vào cõy con, khoẻ mạnh.  Đụi khi nghiền hạt thành dung dịch đồng nhất để lõy nhiễm vào cõy con.  Sau khi lõy nhiễm theo dừi chặt chẽ triệu chứng bệnh để đỏnh giỏ thụng qua triệu chứng biểu hiện để xỏc định tỏc nhõn gõy bệnh. 65 66  Một phương phỏp thường được sử dụng, đặc biệt đỏnh giỏ bệnh virus hại hạt giống là chà sỏt một hỗn hợp của dịch hạt (dịch mẫu hạt) và chất độn kim loại lờn bề mặt lỏ.  Chất độn chõm vào mụ và đưa nguồn bệnh vào cõy và triệu chứng bệnh biểu hiện.  Yờu cầu của phương phỏp là sử dụng cõy con khoẻ, sạch bệnh, trồng trong điều kiện vụ trựng (nhà kớnh nhà lưới).  Triệu chứng bệnh cú thể biểu hiện sau 2-4 tuần lõy nhiễm. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nụng Học ) - Học Viện Nụng Nghiệp Việt Nam 12 67 2.7. Bệnh virus hạt giống Carroll (1979) đó ghi nhận:  Cú khoảng 200 loại virus gõy bệnh ở cõy trồng.  100 loại đó được biết, cũn 500 loại virus khỏc khụng gõy bệnh hạt giống.  Cú 80 loại virus chuyển qua hạt, một số ớt trờn bề mặt hạt cũn lại tồn tại bờn trong hoặc bờn ngoài phụi. 68 a. Kiểm nghiệm sinh học Kiểm nghiệm sinh học gồm quan sỏt trực tiếp trờn hạt hoặc trồng và quan sỏt triệu chứng trờn cõy trồng. Kiểm nghiệm qua triệu chứng của cõy con là quan sỏt triệu chứng phỏt triển bệnh trờn cõy con. Kiểm nghiệm thụng qua biểu hiện triệu chứng trờn cõy con cũng cú thể thực hiện bằng cỏch nghiền hạt hay cõy con từ lụ hạt kiểm tra, bột nghiền lõy nhiễm cơ học vào cõy con khoẻ, quan sỏt triệu chứng bệnh phỏt triển nhận biết nguyờn nhõn gõy bệnh. 69  Kiểm nghiệm trực tiếp trờn hạt thực hiện cả trờn hạt bỡnh thường và hạt khụng bỡnh thường.  Chiết dịch hạt lõy nhiễm lờn cõy chỉ thị hay cõy trồng rồi theo dừi phỏt triển và đặc điểm của triệu chứng bệnh trờn cõy con.  Cú thể kiểm tra 1 hạt hay hỗn hợp một số hạt 70 b. Kiểm nghiệm bệnh virus hạt bằng huyết thanh Nguyờn lý kiểm nghiệm bệnh virus hạt giống bằng huyết thanh tương tự như kiểm nghiệm bệnh vi khuẩn. Phương phỏp trờn cơ sở phản ứng giữa virus trong hạt hoặc dịch hạt với mẫu huyết thanh miễn dịch trong mỏu của động vật (thỏ). Cú 5 kỹ thuật thử huyết thanh được Carroll đề xuất năm 1979 như sau: 71 Kỹ thuật khuyếch tỏn kộp:  Hạt được nghiền và chuyển vào khoang cắt trong mụi trường khuyếch tỏn (thường là gel agar).  Sau đú đưa vào một huyết thanh miễn dịch chuyờn biệt của virus nghi ngờ cần kiểm tra vào khoang riờng.  Virus khỏng nguyờn và khỏng thể khuếch tỏn về hai phớa khỏc nhau. Sự khuếch tỏn về hai hướng khỏc nhau gọi là khếch tỏn kộp. Khi hai phản ứng huyết thanh tiếp cận đến 1 điểm trong gel tại nơi tập trung, phức hợp của phõn tử khỏng nguyờn và khỏng thể kết tủa cố định. 72  Kỹ thuật khuyếch tỏn toả trũn  Phương phỏp khuyếch tỏn toả trũn giống như khuyếch tỏn kộp nhưng nú chỉ khuyếch tỏn virus khỏng nguyờn trong khoang của mụi trường agar.  Huyết thanh chứa khỏng thể với một virus đặc thự được đưa vào mụi trường agar trong cựng khoang với hạt hoặc cõy con, nếu virus cú mặt chỳng sẽ khuyếch tỏn trong khoang.  Khi chỳng kộo dài đến bề mặt khoang chỳng phối hợp với khỏng thể để kết tủa ở vựng gặp nhau hỡnh thành chuỗi hoặc quầng xung quanh của khoang. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nụng Học ) - Học Viện Nụng Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 13 73 Phương phỏp kiểm tra nhựa mủ  Xay 100 hạt sau đú 0,1g hạt xay cho vào 2 ml dung dịch đệm để cho vào cối gió nghiền.  Khoảng 20 ml của dịch chiết hạt này cho vào pipet 100ml và 10 ml với nhựa mủ đỏnh dấu đó cú trong đú.  Nhựa mủ đỏnh dấu bao gồm huyền phự của polystyrence nhựa mủ hỡnh cầu (đường kớnh khoảng 0,81 àm).  Nhựa mủ hỡnh cầu nhạy cảm hoặc bao trựm tế bào khỏng thể cho một virus đặc thự.  Lắc pipet khoảng 15 phỳt và quan sỏt dưới kớnh hiển vi phõn lớp. Khi virus cú mặt trong mẫu kiểm tra nhựa mủ huyền phự sẽ kết bụng. 74  Phương phỏp Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)  Kỹ thuật ELISA cú độ nhạy cao, một số nghiờn cứu cho rằng cú thể phỏt hiện virus ở nồng độ 0,1 àg/ml.  Phương phỏp sử dụng phỏt hiện virus đốm vũng ở hạt thuốc lỏ, khảm ở hạt đậu tương với tỷ lệ rất thấp (1-4%).  Phương phỏp cần cú kỹ thật, trang thiết bị và khỏ tốn kộm thường được sử dụng kiểm nghiệm nhưng hạt và giống cõy trồng quý và giỏ trị cao. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nụng Học ) - Học Viện Nụng Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/