Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli

Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli Protein nguyên thể (native) Protein dung hợp (fusion protein) • Đoạn gene mã hóa 2 hoặc nhiều protein. Vector biểu hiện • Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ. • Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào. • Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gene được tạo dòng. • Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG. • Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng chính xác với promoter. Hệ thống biểu hiện ở prokaryote Promotor 1. lacZ promotor: pUC, M13 vector, vector lamda hoặc Bluescript - Điều hòa bởi lacI repressor 2. Lambda PL promotor 3. T7 promotor 4. araBAD promotor Hệ thống điều hòa bởi 2 promotor Vector biểu hiện với lacZ Vector biểu hiện với lacZ Trình tự gắn với ribosome (ribosomal binding site) • Cần thiết để khởi đầu dịch mã • ở E. coli thường có trình tự -GAGG- đứng trước codon khởi đầu dịch mã. • Trình tự Shine-Dalgarno ở E. coli: AGGAGGU • Trình tự Kozak ở Eukaryote: (gcc)gccRccAUGG Lợi thế của protein dung hợp • Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch mã nếu dung hợp ở đầu N-ter • Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide • Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein • Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch Các thẻ (tag) đánh dấu • GST (glutathion-S-transferase): – Kết hợp và bảo vệ protein – Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực • Maltose binding protein – Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch – Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose) • Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel Phát hiện protein dung hợp • Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện di trên gel. • Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung hợp – Nuôi dòng vi khuẩn – Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ) – Tách chiết dịch bằng SDS – Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS PAGE) – Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting 1 2 3 4 Protein Ladder Western blot (anti-His tag conjunged HRP) SP1 - 4o C 3 0 o C 1 6 o C SP2 - 4o C 3 0 o C 1 6 o C 40kD 70kD Tinh sạch protein 1. Thể vùi (inclusion) 2. Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh sạch thể vùi - Hòa tan thể vùi 3. Thu nhận protein Tinh sạch protein