Khái niệm
- Thực phẩm bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học sẽ bị giảm chất lượng, biến chất, hư hỏng và gây ngộ độc cho người sử dụng.
- Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật là khi người sử dụng những thực phẩm đã bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh và xảy ra tình trạng bệnh lý do vi sinh vật hoặc do độc tố của vi sinh vật gây ra.
448 trang |
Chia sẻ: Tiểu Khải Minh | Ngày: 17/02/2024 | Lượt xem: 166 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Vi sinh thực phẩm - Chương 1: Giới thiệu về vi sinh trong thực phẩm, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
se
| buihongquan@gbd.edu.vn
Kết quả thử nghiệm Coagulase
(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương
(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất
Thử nghiệm Coagulase
12/22/2017 277 | buihongquan@gbd.edu.vn
Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi
gelatinase.
Cơ sở sinh hóa:
Gelatine polypeptide + acid amin
Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường
đông đặc
Vi sinh vật phân hủy gelatine môi trường lỏng
12/22/2017 278
gelatinase
Thử nghiệm gelatinase
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm gelatinase
Đối chứng:
(+): Aeromonas hydrophila
(-): E. coli
Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine
Dạng ống nghiệm thạch sâu
Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.
12/22/2017 279 | buihongquan@gbd.edu.vn
Đọc kết quả
(+) môi trường tan chảy
(-) môi trường không tan chảy
12/22/2017 280
Thử nghiệm gelatinase
| buihongquan@gbd.edu.vn
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose
theo các con đường khác nhau
Cơ sở sinh hóa:
Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao
Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí
12/22/2017 281 | buihongquan@gbd.edu.vn
Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media
(Hugh & Leifson media)
Chỉ thị pH: bromocresol purple
12/22/2017 282
pH 6,8
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
| buihongquan@gbd.edu.vn
Trực khuẩn gram âm
O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa
F (fermentation) Serratia marcescens
Cầu khuẩn gram dương
O (oxidation) Micrococcus luteus
F (fermentation) Staphylococcus aureus
12/22/2017 283
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
|
buihongquan@gbd.edu.vn
Đọc kết quả:
12/22/2017 284
A: đối chứng
B: phản ứng OXH
C: phản ứng lên men
TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate
Cơ sở sinh hóa:
12/22/2017 285
3 2 3 2 2, , , ,
nitrataseNO NO NH N NH OH NO
NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride chất màu
hồng
NO3 + bụi kẽm màu hồng
| buihongquan@gbd.edu.vn
Phương pháp tiến hành:
Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứâ nitrate
Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện củâ nitrite
Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ
để định tính nitrate
12/22/2017 286
Thử nghiệm nitrâtâsê (khử nitrâtê)
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm nitrâtâsê (khử nitrâtê)
12/22/2017 287 | buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm oxydase
Mục tiêu: phát hiện vi sinh vật có hệ enzym oxydase (hệ
cytochrome C)
Cơ sở sinh hoá
Cytochrome C khử + H+ + O2 Cytochrome C OXH+ H2O
Cytochrome C OXH+ TMPD khử TMPD OXH(màu xanh)
12/22/2017 288 | buihongquan@gbd.edu.vn
Thuốc thử
TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine
Bảo quản lạnh trong tối
Thời hạn bảo quản: 2 tuần
Đối chứng (+): Serratia marcescens
(-) : Proteus rettgeri
12/22/2017 289
Thử nghiệm oxydase
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thực hiện:
Lấy vi sinh vật từ Nutrient Agar đặt lên giấy thấm
Nhỏ thuốc thử TMPD
Quan sát sau 30 giây
Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh
Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng
12/22/2017 290
Thử nghiệm oxydase
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm oxydase
12/22/2017 291 | buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm ONPG
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß-
galactosidase – enzyme cảm ứng.
Cơ sở sinh hóa:
ONPG o-nitrophenol
12/22/2017 292
Màu vàng Không màu
| buihongquan@gbd.edu.vn
Lactose agar
Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (-)
ủ quâ đêm
37oC
Màu vàng
Thử nghiệm ONPG
12/22/2017 293 | buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm khả năng lầ̀m tan huyết
Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan
hồng cầu
Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ
Cơ sở sinh hoá:
Các haemolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động
vật
Vi sinh vật khác nhau heamolysine khác nhau
cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau
12/22/2017 294 | buihongquan@gbd.edu.vn
Phân loại: 3 kiểu tan huyết
Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ
Tan huyết không hoàn toàn (α): xung quanh và dưới khuẩn
lạc chuyển đục và có màu khác
Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết
12/22/2017 295
Thử nghiê ̣m khẩ nâ ng ̉ ̣ ̉ lầ̀m tân huyết
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm CAMP
Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan
huyết giữâ các vi sinh vật, nhờ viê ̣c tậo thầnh yếu
tố CAMP
Cơ sở sinh hóa:
S. aureus tiết β-lysin gây tan hồng cầu
Streptococcus nhóm B tiết CAMP gây tan huyết
β-lysin + CAMP gây tan huyết mạnh, hoàn toàn
Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+)
với Streptococcus nhóm khác (-)
12/22/2017 296 | buihongquan@gbd.edu.vn
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
(+)
(-)
12/22/2017 297 | buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm tính di động
Mục đích: Xác định khả năng di động củâ vi sinh vật.
Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao
Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường
thạch mềm (0,5% agar).
Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan
ra khỏi vết cấy.
Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy,
môi trường không bị đục.
12/22/2017 298 | buihongquan@gbd.edu.vn
(+) (+) (-)
Thử nghiệm tính di động
12/22/2017 299 | buihongquan@gbd.edu.vn
Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định
danh vi sinh vật
Mỗi loài vi sinh vật có những đặc tính sinh hóa khác nhau
Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp
xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó.
Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường
ruột
12/22/2017 300 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 301 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 302
Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E
(bioMerieux, Inc)
| buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 303 | buihongquan@gbd.edu.vn
Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Định nghĩa:
Vi khuẩn hiếu khí: Vi khuẩn phát triển và hình thành
khuẩn lạc trong điều kiện có ôxi phân tử.
Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm là tổng
số khuẩn lạc mọc được trên đĩa petri chứa môi trường
thạch chuẩn cho vi khuẩn như PCA, sau khi ủ ở thời
gian và nhiệt độ xác định (tùy tiêu chuẩn, thường là ủ
72 giờ ở nhiệt độ 30oC).
12/22/2017 305 | buihongquan@gbd.edu.vn
Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Các tên gọi:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí: theo TCVN
Tổng số (khuẩn lạc) đếm được trên đĩa (TPC:Total
Plate Count)
Tổng số (khuẩn lạc) hiếu khí đếm được trên đĩa
(APC: Aerobic Plate Count)
Tổng số vi sinh vật sống (TVC: Total Viable Count)
Số đếm đĩa chuẩn (SPC: Standard Plate Count)
12/22/2017 306 | buihongquan@gbd.edu.vn
Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Ý nghĩa:
• Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm.
• Thực phẩm có đạt số tổng vi khuẩn hiếu khí dưới 1
mức cụ thể theo tiêu chuẩn thì mới được sử dụng. Còn
không thì là thực phẩm không hợp vệ sinh,cần loại bỏ
hoặc tái xử lý.
• Có thể nhiễm trong nguyên liệu, chế biến, bảo quản.
• Đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng,
thời gian bảo quản).
12/22/2017 307 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 308
Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí trong một số sản
phẩm sữâ (CFU/ml)
Tên sản
phẩm
Sữâ bột
cho trẻ
êm dưới
12 tháng
tuổi
Sữâ bột Sữâ đặc
có
đường
Sữâ tươi
tiệt
trùng
Chỉ tiêu 104 5.104 104 101
Qui định của Bộ Y tế - 2002
Tổng vi khuẩn hiếu khí
| buihongquan@gbd.edu.vn
Nguyên tắc:
Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường dinh dưỡng từ
1 lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lạc
được hình thành từ một tế bào.
Kết quả được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình
thành khuẩn lạc (CFU: Colony Forming Unit) trong
một đơn vị khối lượng (thể tích) thực phẩm (CFU/g
hoặc CFU/ml).
12/22/2017 309
Tổng vi khuẩn hiếu khí
| buihongquan@gbd.edu.vn
Môi trường:
Plate Count Agar (PCA)
Dịch pha loãng: Saline peptone water (SPW):
8,5 gam NaCl và 1 gam pepton trong 1000ml nước. Có
tác dụng pha loãng mẫu và ít ảnh hưởng tới sinh lý tế bào
vi sinh vật.
12/22/2017 310
Tổng vi khuẩn hiếu khí
| buihongquan@gbd.edu.vn
Phương pháp thực hiện
Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu
Chuyển mẫu vào môi trường nuôi cấy
Ủ (30oC trong 72 giờ)
Đếm khuẩn lạc
12/22/2017 311
Tổng vi khuẩn hiếu khí
| buihongquan@gbd.edu.vn
Đồng nhất mẫu
Nếu là mẫu lỏng thì lắc trộn đều.
Nếu là mẫu rắn thì cắt nhỏ bằng kéo, dao vô trùng
trên khay vô trùng.
10g mẫu + 90ml Saline Peptone Water, đồng nhất
mẫu bằng stomacher trong 30 giây, mục đích để
trộn đều mẫu, phân bố vi sinh vật đều trong dịch
mẫu mẫu đã được pha loãng 10 lần (tới đậm độ
10-1)
12/22/2017 312 | buihongquan@gbd.edu.vn
Máy đồng nhất mẫu
12/22/2017 313 | buihongquan@gbd.edu.vn
Pha loãng mẫu
12/22/2017 314
Mẫu ban đầu,
sau khi đồng
nhất có nồng
độ pha loãng
10-1
10-1
101
10-2
102
10-3
103
10-4
104
Pha loãng
Độ pha loãng
10-5
105 Độ pha loãng cuối
| buihongquan@gbd.edu.vn
Đĩa petri vô
trùng
PCA
45oC
Khoảng
15 ml
Dung dịch
mẫu đã pha
loãng
1 ml
Lắc đều đĩa petri
Để nguội
Ủ 30oC/3 ngày
Đếm số khuẩn lạc
và tính kết quả
12/22/2017 315 | buihongquan@gbd.edu.vn
Mẫu
lỏng:
100
10-1 10-2 10-3
1ml 1ml 1ml
TNTC 456 178
10-4
1ml
19
1ml
Đem ủ
12/22/2017 316 | buihongquan@gbd.edu.vn
100 10-1 10-2 10-3
1ml 1ml 1ml
Đọc kết quả
1ml
Đem ủ
12/22/2017 317 | buihongquan@gbd.edu.vn
Đếm kết quả chỉ tiêu
Đếm tất cả khuẩn lạc mọc trên môi trường
Khuẩn lạc mọc loang dưới 1/3 đĩa tính là 1 khuẩn lạc
Chọn đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250 để tính kết quả
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa
ni: số đĩa tại mỗi nồng độ
V: thể tích cấy vào đĩa (=1 ml)
fi: độ pha loãng
Đơn vị là CFU/g hoặc CFU/ml
12/22/2017 318
iii fVnfVn
N
A
...111
| buihongquan@gbd.edu.vn
Đếm kết quả
Ví dụ: trong một trường hợp tính mẫu cụ thể
Nồng độ pha loãng
Kết quả
10-3 10-4
Đĩa 1 235 26
Đĩa 2 246 36
Đĩa 3 198 14
12/22/2017 319
(CFU/g)
...111 iii fVnfVn
N
A
5102,3
0001,012001,013
3626198246235
A
| buihongquan@gbd.edu.vn
Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc
đếm được trên 1 đĩâ lớn hơn 250
ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250,
kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm
được trên 1 đĩâ nhỏ hơn 25
ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25,
kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/g.
12/22/2017 320 | buihongquan@gbd.edu.vn
Coliforms và E.coli
Định nghĩa
o Coliform là nhóm trực khuẩn
Gram âm, không sinh bào tử, hiếu
khí hoặc kị khí tùy nghi, lên men
lactose sinh acid và sinh hơi ở
37oC trong 24 – 48 giờ
o Coliform chịu nhiệt = coliform +
lên men lactose và sinh hơi trên
mt canh EC ở 44oC trong 24 giờ.
o Coliform phân = coliform chịu
nhiệt + sinh indole trong canh
Tryptone ở 44,5oC trong 24 giờ
o E.coli = coliform phân + IMViC
(++--)
12/22/2017 321 | buihongquan@gbd.edu.vn
Một số chỉ tiêu
Chỉ tiêu coliform và E.coli trong một số loại thực phẩm
Tên sản
phẩm
Xúc xích Chả cá Trứng
tươi
Sữâ tươi
tiệt trùng
Coliform
(trong 1g)
50 10 102 0
E.Coli
(trong 1g)
3 3 3 0
12/22/2017 322
Qui định của Bộ Y tế - 4/1998
| buihongquan@gbd.edu.vn
TSA
ở 45oC
5 ml
Dịch pha
loãng 10-1
1 ml
Lắc
để yên 1 – 2h
VRB
ở 45oC
10 ml
Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ
Phục hồi
VSV
Chọn lọc
KL
coliform
12/22/2017 323 | buihongquan@gbd.edu.vn
Khuẩn lạc coliform đặc trưng trên môi trường VRB
có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật,
đường kính ≥0,5mm
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng
Tính: N = tổng số kl đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy
12/22/2017 324 | buihongquan@gbd.edu.vn
Chọn 5 KL đặc trưng
cấy sang 5 ống BGBL
Ủ 37oC/24 – 48h
Kiểm tra khả năng
lên men Lactose và
sinh hơi
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy) 12/22/2017 325 | buihongquan@gbd.edu.vn
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy)
Tổng số coliform (cfu/g)
R
nVf
N
C
Tính số lượng coliform
12/22/2017 326 | buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH LƯỢNG FEACAL COLIFORM
(PP ĐẾM KHUẨN LẠC)
Qui trình định lượng F. coliform tương tự như qui
trình định lượng coliform, chỉ khác nhau ở những
điểm sau:
o Ủ đĩâ môi trường VRB ở 44,0 ± 0,5oC trong 24 – 48
giờ
o Cấy khẳng định vào canh EC ủ 44,0 ± 0,5oC trong 24 –
48 giờ.
o Các khuẩn lạc sinh hơi trên EC được cấy qua môi
trường canh Tryptone để thử nghiệm indole
o Khuẩn lạc dương tính khi sinh hơi trên EC và có pư
indole dương tính.
12/22/2017 327
Tỉ lệ xác nhận
R = (Số KL indol (+)) / (Số KL đã cấy)
R
nVf
N
C
| buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN
12/22/2017 328
10-1
10-2
10-3
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10ml LSB
1ml
1ml
1ml
| buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN
12/22/2017 329
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.2 2.3
3.3
10ml EC
1.1 1.2 1.5
2.2
1.1 1.2
Endo/EMB
Indol
Kết quả 2,0,0 MPN =4.5 | buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH TÍNH E.COLI
12/22/2017 330
Lấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBL
Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ
Chọn các ống sinh hơi cấy sâng Endo âgâr
Mẫu không sinh hơi được xêm là âm tính với E.coli
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng
1mm để cấy sâng TSA hây BHI
| buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH TÍNH E.COLI
12/22/2017 331
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa:
Canh tryptone, MR-VP, Simmon Citrate, để thử
nghiệm IMViC
Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-)
Một trong những pư trên sai thì không phải là E.coli
Kết luân: phát hiện (hây không phát hiện) E.coli
trong 1g (1ml) mẫu.
| buihongquan@gbd.edu.vn
khuẩn lạc E. coli dạng dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm
12/22/2017 332 | buihongquan@gbd.edu.vn
Staphylococcus aureus
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
12/22/2017 333
Thuộc họ Staphylococcaceae
Còn gọi là Tụ cầu vàng
Sống hiếu khí tùy nghi
| buihongquan@gbd.edu.vn
Khóa phân loài củâ S. aureus
(Biological classification)
Giới (Kingdom): Bacteria
Nghành (Phylum): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Staphylococcaceae
Giống (Genus): Staphylococcus
Loài (Species): S. aureus
12/22/2017 334 | buihongquan@gbd.edu.vn
PƯ catalase, coagulase dương tính
PƯ oxidase âm tính
Hầu hết có khả năng gây tan huyết (95%)
Lên men tạo acid từ mannitol
12/22/2017 335 | buihongquan@gbd.edu.vn
Phát triển được trên môi trường chứâ 15% NaCl
Trên môi trường không chọn lọc tậo sắc tố vàng
Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt
12/22/2017 336 | buihongquan@gbd.edu.vn
Sự phân bố trong tự nhiên
Thường tìm thấy trên da, tóc hay các nơi ẩm thấp
ở người và động vật máu nóng
Các vết trầy xước hay lở loét là nơi tập trung củâ
S. aureus
Nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua việc chế biến
và sản xuất không hợp vệ sinh
Nhiệt độ 10 – 45oC, pH 4,6 – 9,3, tối ưu 37oC và pH
7
12/22/2017 337 | buihongquan@gbd.edu.vn
Dấu hiệu nhiễm và các bệnh do S. aureus
12/22/2017 338 | buihongquan@gbd.edu.vn
Khả năng gây ngộ độc thực phẩm
Sinh 5 độc tố ruột: enterotoxin A, B, C, D, E bền nhiệt
Viêm dạ dày ruột: ăn thức ăn bị nhiễm độc tố
Viêm ruột non – đại tràng: ăn thức ăn bị nhiễm tụ cầu với
số lượng lớn (>105 vi khẩn/1g thức ăn)
Sinh độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc
12/22/2017 339 | buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH LƯỢNG S. aureus
Nguyên tắc
Sử dụng môi trường chọn lọc để bắt những khuẩn
lạc đặc trưng củâ S. aureus
Môi trường Baird Parker Agar (BPA) hoặc Chapman
Agar
Khuẩn lạc đặc trưng: đường kính 0,5 – 1 mm, lồi, đen
bóng có vòng trắng đục hẹp, vòng sáng rộng
Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định
S. aureus có phản ứng coagulase dương tính – làm
đông huyết tương
12/22/2017 340 | buihongquan@gbd.edu.vn
QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. aureus
12/22/2017 341
Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1)
lên bề mặt môi trường Baird Parker
agar, trẩi đều bằng que tam giác
Ủ ngược đĩâ
ở 37 ± 0,5oC
trong 48 giờ
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (N ) và t
số khuẩn lạc không đặc trưng (Na)
Chuyển 5 kl đặc trưng và 5 kl không đặc
trưng sang mt TSA
Ủ ở 37 ± 0,5oC quâ đêm
KL đặc trưng của S. aureus
trên mt BPA
| buihongquan@gbd.edu.vn
Cấy chuyền vào ống chứâ 0,3ml
huyết tương
Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6,
8 giờ. Nếu không có kết quả dương
tính sẽ ủ đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ
dương tính Rt (KL đặc trưng) và
Ra(KL không đặc trưng)
Kết quả: số S. areus (cfu/g)
)(
1
aatt RNRN
nVf
S
12/22/2017 342
KL đặc trưng KL không đặc
trưng
| buihongquan@gbd.edu.vn
Thử nghiệm coagulase
Mức độ đông tụ huyết tương
12/22/2017 343
Âm tính Dương tính
| buihongquan@gbd.edu.vn
ĐỊNH TÍNH S. aureus Nguyên tắc
Tăng sinh trong môi trường chọn lọc
• Môi trường MSB (Mannitol Salt Broth): salt 7.5% ức chế
Staphylococcus có coagulase (-)
• Ống (+) sẽ chuyển từ màu đỏ sang vàng (S.aureus lên
men mannitol phenol red (đo ̉ vầng)
Mẫu có biểu hiện dương tính được phân lập trên môi trường
chọn lọc
• Môi trường BPA, TGA, Chapman agar
• KL đên nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 0,5 – 1 mm, có
vầng sáng xung quanh
Khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ
• Phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết tương
12/22/2017 344 | buihongquan@gbd.edu.vn
QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH S. aureus
12/22/2017 345
Cấy 1g (ml) vào ống nghiệm chứâ 10ml
MSB
Chọn ống nghiệm dương tính (mt
chuyển màu vàng) cấy chuyển sang
Baird Parker agar hay Chapman agar
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 - 48 giờ
Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 48 giờ
Chọn kl đặc trưng cấy chuyển sâng TSA
MSB
(+)
(-)
BPA
TSA
KL đặc trưng
| buihongquan@gbd.edu.vn
TSA
1 ống (+) Tất cả (-)
Phát hiện Không
Phát hiện
Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm
Cấy vào ON chứa 0,3ml huyết tương ́
Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8
giờ. Nếu không có kết quả dương tính
thi ̀ ủ đến 24 giờ. ̀
Kết quả: S. aureus (+) khi có ngưng kết
huyết tương
Kết luận: phát hiện/không phát hiện
S. aureus
́
̀
12/22/2017 346 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10ml MSB
10-1
10-2
10-3
1ml
1ml
1ml
ĐỊNH LƯỢNG S. aureus BẰNG PP MPN
12/22/2017 347 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.1 1.2 1.3
2.1 2.4
1.1 1.2 1.3
2.2
BPA
2.4
MSB
Chọn những ống MSB
chuyển màu vàng
12/22/2017 348 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.1 1.2 1.3
2.2
1.1 1.2
BPA
Huyết tương
2.4
2.4
Bắt khuẩn lạc đặc
trưng trên BPA
Thử nghiệm Coagulase
12/22/2017 349 | buihongquan@gbd.edu.vn
Đọc kết quả thử
nghiệm coagulase
10-1
10-2
10-3
1
1
0
4 MPN/g
Kết quả MPN
12/22/2017 350 | buihongquan@gbd.edu.vn
Faecal Streptococcus
Định nghĩâ
Là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân
Hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương
Không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ
nhầy
Hầu hết sống hiều khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong
điều kiện kỵ khí
Tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng
12/22/2017 351 | buihongquan@gbd.edu.vn
Chuẩn bị dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
Trải lên MT mEnterococcus agar
(SLANETZ and BARTLEY agar)
ủ 37oC, 48 giờ
Đếm tất cả KL đặc trưng (đo ̉, hòng) ̉ ̀
Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng vào TSA
ủ ở 37oC, 24 giờ
Khẳng định (+):
Chịu muối 6,5%, chịu pH ở 9,6 (+)
Catalase (-); Oxydase (-)
Tỉ lệ khẳng định
Mật độ Streptococcus phân
(CFU/g hay CFU/ml)
̉ ̀
Khuẩn lạc có
màu hồng đến đỏ đậm
Phương pháp đếm KL
(màng lọc)
12/22/2017 352 | buihongquan@gbd.edu.vn
Dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
canh Azide Glucose
(9 ống)
thạch Bilê Esculinê
Thử nghiệm câtâlâsê
AG (+), BE (+), Catalase (-)
Trâ bảng MPN
Mật độ Streptococcus phân
(MPN/g hay MPN/ml)
(+)
(+)
(-)
(+): màu MT: tím → vàng
có cặn
(+)
Không phân hủy H2O2
Phương pháp MPN
12/22/2017 353 | buihongquan@gbd.edu.vn
Clostridium spp.
Trực khuẩn Gram (+)
Sinh bầo tử, ky ̣ khi ́
Hầu hết thuo ̣c nhóm ưâ nhiê ̣t vừa va ̀ ưâ nhiê ̣t, số ít ưâ
lậnh
Khử sulfite thầnh sulfide tậo mầu đên
Mo ̣ t số gây bê ̣nh ở người, mo ̣ t số gây hư hỏng thực
phẩm.
12/22/2017 354 | buihongquan@gbd.edu.vn
Quy trình phaân tích Clostridium
Chọn 2 nồng độ phâ loãng thích hợp. Cho 1ml dung dịch phâ
loãng (mỗi nồng độ 2 ống) vào ống nghiệm có chứâ môi
trường Wilson Blâir cải tiến (Bismuth sulfite agar) làm nguội
ở 45oC. Cho thêm 2ml dung dịch Nâ2SO3 và 5 giọt phèn sắt
5%. Tiếp tục làm như sâu:
Lắc đều
Đun cách thủy 75oC, 15 phút
Làm đông nhânh
Bổ sung thêm vào ống nghiệm một lớp môi trường Wilson
Blâir cải tiến đa ̃ làm nguội ở 45oC. Làm đông nhânh.
Ủ 37oC, 18 – 24 giờ
Đọc kết quả:
Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng củâ Clostridium (tròn,
đen).
12/22/2017 355 | buihongquan@gbd.edu.vn
Môi trường Sulfite polymyxin sulfadiazin (SPS) agar
Nhận biết Clostridium perfringens
12/22/2017 356 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Clostridium perfringens
Môi trường Sulfite polymyxin sulfadiazin (SPS) agar
12/22/2017 357 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Salmonella spp.
12/22/2017 358 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hoá: KIA,
Mannitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine
Decarboxylase Broth, Tryptone Broth (37.0 0.50C/24h)
Cân 25g mẫu + 225g BPW, đồng nhất
(Ủ ở 37.0 0.5oC trong 16 - 24 giờ)
Cấy phân lập sâng XLD agar
(37.0 0.50C/24h)
Chọn KL hòng đo ̉ trong suót,
có/không có tâm đên
̣ ̀ ̉ ́
́ ́
Cấy 0.1ml sang ON chứâ
10ml Selenite Cystein Broth
(37.0 0.50C/24 giờ)
Cấy 0.1ml sang ON chứâ
10ml RV Broth (41.5
0.50C/24h)
Cấy phân lập sâng SS agar
(37.0 0.50C/24h)
Chọn KL trong suót,
có/không có tâm đên
̣ ́
́ ́
̣ ̀ ̉ ́
́ ́
̣ ́
́ ́
12/22/2017 359 | buihongquan@gbd.edu.vn
Phát hiện (không phát hiện) Salmonella / 25g
Biểu hiện củâ Sâlmonêllâ: trên KIA: đỏ/vàng / H2S (+)
/ gas (+); Urea (-); Mannitol (+); Indol (-); LDC (+);
̉
Mẫu có Salmonella khi:
Làm đục môi trường tăng sinh
Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập: khuẩn
lạc tròn, hơi lồi trong, bờ đều có đường kính khoảng 2 –
4mm, đôi khi có tâm đên. Trực khuẩn Grâm âm
Có tính di động: Trên môi trường MIU Salmonella mọc lân
khỏi đường cấy thẳng
Lactose (-): giữ nguyên màu đỏ củâ phần nghiêng
Glucose (+): phần đáy đổi màu từ đỏ sâng vàng
Dihydrosulfide (+): các khuẩn lạc Salmonella có màu đen
Urease (-): làm biến màu môi trường từ đỏ sâng vàng
Indole (-): không làm đỏ thuốc thử
12/22/2017 360 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Salmonella spp.
Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD)
12/22/2017 361 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Salmonella spp.
Môi trường Kligler Iron Agar (KIA)
+
Đối chứng Salmonella
12/22/2017 362 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Salmonella spp.
Môi trường Urea Broth
âm tính Salmonella
+
Salmonella
Đối
chứng
+
12/22/2017 363 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Salmonella spp.
Môi trường Lysine Decarboxylase Broth
+
Salmonella Proteus
12/22/2017 364 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Salmonella spp.
Salmonella
Phản ứng Indole
âm tính Salmonella
Đối
chứng +
12/22/2017 365 | buihongquan@gbd.edu.vn
Phản ứng Voges-Proskauer (VP)
âm tính Salmonella
Thuốc thử VP
+
Đối
chứng
Đối
chứng
Nhận biết Salmonella spp.
Đỏ tươi Đỏ đồng
+
12/22/2017 366 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Bacillus cereus
12/22/2017 367 | buihongquan@gbd.edu.vn
Đặc điểm của Bacillus cereus
Trực khuẩn Gram (+)
Hiếu khí hay kị khí tùy nghi
Tậo no ̣ i bầo tử
Đi đo ̣ng
Lên men glucose sinh hơi
Nitratase (+), VP (+)
Sinh trưởng trong khoẩng 5-500 C, pH 4.5-9.3
Tiết 2 loậi toxin chińh: diarrhoeal toxin (gây tiêu
chẩy) và emetic toxin (gây nôn mửa)
Hiê ̣n diê ̣n trong đất, bụi, sữa, thiṭ, rau quẩ, gia vi,̣ sp
khô
12/22/2017 368 | buihongquan@gbd.edu.vn
Quy trình phân tích
B. cereus (MPN)
Chọn khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase (+) cấy sang TSA hây BHI, ủ
30oC/24h
Lấy 10g mẫu đồng nhất vào 90ml pêptonê đệm, được 10-1
Chọn ống (+), cấy PL sang MYP, ủ 37 0.5oC/24-48h
Pha loãng mẫu 10-2, 10-3, 10-4
Cấy 1ml dd 10-2, 10-3, 10-4 vào 10ml TSP, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 30oC, 30h ́
XĐ số ống (+) (đục) ở mỗi độ phâ loãng ̣
Cấy thử sinh hoá: phenol red glucose broth, gram,
nitrate broth, VP, Tyrosine agar, Lysozyme broth
Kết luận B.cereus: glucose (+), nitratase (+), VP (+), tyrosine (+), lysozyme (+)
́
̣
12/22/2017 369 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Bacillus cereus
Môi trường Mannitol – Egg – Yolk polymyxin (MYP)
12/22/2017 370 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Bacillus cereus
Lên men glucose : dương tính Bacillus
+ Đối chứng + +
12/22/2017 371 | buihongquan@gbd.edu.vn
Phản ứng Voges-Proskauer (VP) dương tính Bacillus
Thuốc thử VP
+
Đối
chứng
+
Nhận biết Bacillus cereus
12/22/2017 372 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Bacillus cereus
Môi trường nitrate broth
12/22/2017 373 | buihongquan@gbd.edu.vn
Vibrio spp.
Hình que/dấu phẩy, Gram (-)
Di đo ̣ng, kỵ khí tùy nghi
Catalase (+), oxydase (+)
Lên men glucose nhưng ko sinh hơi, không sinh
H2S
Tất cẩ cấc loầi đều cần muói để tăng trưởng
(trừ V.cholerae)
12/22/2017 374 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhận biết Vibrio
25g Mẫu + 225 mL nước APW (alkaline peptone
water) 10-1 , ủ 35 ± 20C, 18-24h
Cấy phân lâ ̣p trên TCBS âgâr, ủ 35 ± 20C, 18-24h
Chọn KL đâ ̣c trưng:
V.cholerae: vầng, hơi dệt, bóng, 2-3mm, tâm đục,
rìa trong
V. parahaemolyticus: tròn, xanh lấ, đục, 2-3 mm
V. alginolyticus: lớn, vầng, đục
Cấy lên TSA, ủ 35C, 24h ròi mang thử phẩn ứng
sinh hóa khẩng điṇh Vibrio
12/22/2017 375 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 376 | buihongquan@gbd.edu.vn
1. Acid Nucleic
1.1. Cấu trúc Acid Nucleic:
Acid Nucleic là vật chất mang
thông tin di truyền, có cấu tạo
là một polymer với monomer
là các Nucleotide. Acid
Nucleic gồm hai loại là ARN và
ADN.
Nucleotide: Là cấu trúc cơ
bản của Acid Nucleic. Một
Nucleotide gồm 3 thành phần:
Nhóm Phosphate
Đường pentose(5C)
Bazơ nitơ.
12/22/2017 378 | buihongquan@gbd.edu.vn
1. Acid Nucleic
• Bâzơ nitơ gồm hâi nhóm:
▫ Nhóm Purin: gồm Adêninê (A),
Guanine (G)
▫ Nhóm Pyrimidin: gồm Thyminê
(T), Cytosine (C) và Uracil (U)
• Các Nuclêotidê khác nhâu chỉ khác
nhâu ở nhóm bâzơ nitơ, do đó có 5
loại Nuclêotidê sẽ mâng tên củâ 5
loại bâzơ nitơ
• Trong phân tử Acid Nuclêic, các Nuclêotidê nằm kề nhâu liên kết
với nhâu bằng liên kết photphodiêstêr tạo thành chuỗi dài.
Trình tự chính xác củâ các bâzơ trong ADN và ARN đặc trưng
cho thông tin di truyền củâ tế bào và cơ thể.
12/22/2017 379 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 380 | buihongquan@gbd.edu.vn
1. Acid nucleic
1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic)
Cấu trúc:
Ptử ADN là một chuỗi xoắn kép, gồm hai sợi đơn. Mỗi
sợi đơn là một chuỗi Nucleotide. Có 4 loại Nucleotide: A,
T, G, C.
Hai sợi đơn lk với nhau bằng liên kết hydro theo nguyên
tắc bổ sung: A – T =2 lk H2, G - C = 3 lk H2.
Mỗi sợi đơn có một trình tự định hướng: một đầu 5’
mang nhóm Phosphate tự do, một đầu 3’ mang nhóm
OH tự do (quy ước là 5’ ->3’).
Hai sợi đơn hướng song song và ngược chiều nhau
(antiparallel). Mỗi mạch đơn (ssDNA) mang trình tự các
bâzơ khác nhau-> mang thông tin di truyền khác nhau
12/22/2017 381 | buihongquan@gbd.edu.vn
Chuỗi xoắn kép DNA
12/22/2017 382 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 383
|
buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 384
|
buihongquan@gbd.edu.vn
1. Acid NUCLEIC
1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic)
Đặc tính của DNA
Biến tính: là khả năng sợi kép DNA trong điều kiện nhiệt
độ cao gần điểm sôi hoặc pH < 3 hay trên 10 có thể sẽ
tách rời thành 2 sợi đơn
Hồi tính: Sau khi DNA bị biến tính, nếu điều kiện trên
quay lại trạng thái ban đầu một cách từ từ thì 2 sợi đơn
này lại có thể ghép bổ sung thành sợi kép ban đầu (hồi
tính)
Ứng dụng: lai DNA và PCR.
12/22/2017 385
|
buihongquan@gbd.edu.vn
1. Acid Nucleic
1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic)
Cấu trúc ADN của sinh vật Eucaryote:
• Dạng mạch thẳng (Prokaryote: mạch vòng)
• ADN kết hợp chặt chẽ với Pr histone.
• Nến châ ̣ t trong nhâ n ở nhiều mức độ: nucleosome -> NST
• ADN gồm những trình tự mã hóa (exon) xen kẽ với những TT
ko mã hóa (intron). Tùy mức độ hiện diện trong nhân -. Chia 3
loại
▫ Các TT lặp lại nhiều lần: chiếm 10-15% genome. Là những
TT AND ngắn (10-200kb), ko mã hóa, tập trung ở những
vùng chuyên biệt/NST (tâm động, đầu mút NST)
▫ Các TT lặp lại TB: 25-40%, là những đoạn AND có kt lớn
hơn (100-1000kb). Không mã hóa hoặc mã hóa cho rARN,
tARN, 5SARN
▫ Các TT duy nhất: là các gen mã hóa cho các Protein, có TT
đặc trưng cho từng gen
12/22/2017 386 | buihongquan@gbd.edu.vn
Vai trò của ADN:
ADN là nơi lưu trư các thông tin di truyền, thâm giâ
vào cấu trúc nhiễm sắc thể.
Có khả năng truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ
sâu thông quâ sự sâo chép (tái bản) và phân ly trong
phân bào.
Có khả năng phiên mã tạo râ các phân tử ARN, từ đó
dịch mã để tạo nên các Protêin đặc thù và tạo nên tính
đâ dạng củâ sinh vật.
1. Acid Nucleic
1.2. ADN (Acid Deoxyribonucleic)
12/22/2017 387 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.3. ARN (Acid Ribonucleic)
Phân tử ARN có cấu trúc
tương tự như ADN, nhưng
khác biệt với ADN ở 3 điểm:
Phân tử ARN là một chuỗi
đơn
Đường pentose củâ phân tử
ARN là đường ribose
Thymin được thay bằng
uracil trong phân tử ARN.
Các loại ARN: mARN, tARN,
rARN
12/22/2017 388 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.3.1. ARN thông tin (mARN)
• Chiếm 2 – 5%/tổng lượng ARN trong TB
• Là bản sao TT củâ gen. Có vai trò trung tâm chuyển
TTDT mã hóa trên phân tử ADN đến bộ máy giải mã
để tổng hợp Pr tương ứng.
• Kích thước sợi mARN thường dài, từ 900 – 1200
Nucleotide
• Thời giân tồn tại trong tế bào rất ngắn
12/22/2017 389 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.3.1. ARN thông tin (mARN)
SV nhân sơ: mARN là
bản sao nguyên vẹn củâ
gen, sau phiên mã được
sd ngay làm khuôn để
dịch mã tổng hợp Pr.
SV nhân chuẩn: mARN
sau phiên mã từ gen
trong nhân phải trải qua
1 quá trình hoàn thiện
trước khi ra tế bào chất
tham gia vào dịch mã:
gắn mũ m7G vào đầu 5’,
đuôi poly A vào đầu 3’ và
ghép nối các đoạn mã hóa
với nhau
12/22/2017 390 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 391 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.3.2. ARN vận chuyển (tARN)
Chiếm 10-15%/tổng ARN
trong TB
Là 1 mạch polyNucleotide
ngắn, khoảng 75-95
Nucleotide
Cấu trúc dạng lá trẽ 3-4
nhánh (do sợi đơn tự cuộn
xoắn)
Một nhánh tiếp nhận aa: đầu
tận cùng là CCA. Enzym
Aminoacyl-tARN synthetaza
xúc tác gắn chính xác từng
loại aa vào ptử tARn tương
ứng.
12/22/2017 392 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nhánh đối mã(ânticodon):
mâng bộ bâ đối mã phù hợp
với bộ 3 mã hóa trên mARN.
Một hoặc hâi nhánh phụ:
làm tăng tính ổn định củâ
mARN
Vâi trò: Vận chuyển ââ đến
bộ máy giải mã để tổng hợp
Pro theo mã trên mARN
tương ứng.
1.3.2. ARN vận chuyển (tARN)
12/22/2017 393 | buihongquan@gbd.edu.vn
1.3.3. ARN Ribosome (rARN)
• Là thành phần chính củâ Rbx,
tgia vào QT giải mã
• Chiếm 80%/tổng số ARN TB,
chủ yếu nằm ở TBC.
• Có cấu trúc mạch đơn với
nhiều khúc cuộn, chứâ khoảng
100-150 Nucleotide.
• Theo hệ số lắng chia rARN
thành nhiều loại:
▫ Eukaryote: 28S, 18S, 5,8S và
5S.
▫ Prokaryote: 23S, 16S và 5S
• Rbx gồm: 1 tiều phần lớn và
một tiểu phần nhỏ (Pr +
rARN)
• Nhiều rRNA còn có chức năng
xúc tác như enzyme.
12/22/2017 394 | buihongquan@gbd.edu.vn
395
2. Hệ gen(Genome)
Khái niệm:
Genome (hệ gen):
chứâ toàn bộ vật
chất chứâ TTDT
trong cơ thể sinh vật
được mã hóa trong
AND (ở một số virut
là ARN). Mỗi
genome chứâ tất cả
thông tin cần thiết
để xây dựng và duy
trì cơ thể đó.
12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
2. Hệ gen(Genome)
Genome của vi khuẩn:
Kích thước nhỏ, ở dạng vòng khép
kín.
Chỉ chứâ các đoạn ADN không lặp
lại.
Các gen trong genome phân bố sát
nhau, ít bị gián đoạn bởi các đoạn
ADN không chứâ mã di truyền
(intron). Các gen đều tồn tại đơn
bản. Trên DNA có chứa các gen mã
hóa cho một protein đặc thù
Một số chứâ thêm dạng ADN khác –
plasmid: kích thước bé hơn, dạng
vòng, có khả năng tự nhân bản,
thường chứa một số gen có tính đặc
thù cao (gen kháng kháng sinh, gen
chỉ thị màu).
12/22/2017 396 | buihongquan@gbd.edu.vn
2. Hệ gen(Genome)
Genome của eukaryote:
99% genome nằm trong nhân
TB. Phần còn lại nằm trong một
số cơ quan tử (ty thể, lạp thể).
12/22/2017 397 | buihongquan@gbd.edu.vn
2. Hệ gen(Genome)
Genome của eukaryote:
Genome nhân:
Thường có kích thước lớn (12Mb đến 120.000Mb). Phân
bố trên các NST dạng thẳng. Gồm các thành phần lặp lại
và các thành phần không lặp lại.
Các loại ADN trong genome:
Các TT lặp lại nhiều lần: chiếm 10-15% genome. Là những
TT ADN ngắn (10-200kb), ko mã hóa, tập trung ở những
vùng chuyên biệt/NST (tâm động, đầu mút NST)
Các TT lặp lại TB: 25-40%, là những đoạn ADN có kt lớn
hơn (100-1000kb). Không mã hóa hoặc mã hóa cho rARN,
tARN, 5SARN
Các TT duy nhất: là các gen mã hóa cho các Protein, có TT
đặc trưng cho từng gen
12/22/2017 398 | buihongquan@gbd.edu.vn
2. Hệ gen(Genome)
Genome của eukaryote:
Phần lớn các gen phân bố
trong thành phần ADN không
lặp lại. Các gen chỉ chiếm một
tỷ lệ rất nhỏ so với toàn bộ
genome (1-2% genome). Các
gen thường phân bố xa nhau
và trong gen chứâ nhiều
intron.
Các gen có nhiều bản sao. Các
bản sao củâ một gen được
xếp vào một họ gen. Mỗi gen
trong họ thường hoạt động ở
một thời điểm nhất định
trong quá trình phát triển cá
thể hay trong mô riêng biệt.
12/22/2017 399 | buihongquan@gbd.edu.vn
2. Hệ gen(Genome)
Genome của eukaryote:
Kích thước của genome (ở
trạng thái đơn bội - C): đặc
trưng cho loài, kích thước
củâ genome không tỷ lệ với
mức độ tiến hóa và tính
phức tạp củâ cơ thể.
12/22/2017 400 | buihongquan@gbd.edu.vn
2. Hệ gen(Genome)
Genome của eukaryote:
Genome ty thể: dạng mạch vòng kép, chứâ các gên mã
hóâ cho rARN củâ ty thể và một số ênzymê tgiâ vào
chuỗi hô hấp. Ngoài râ, ty thể còn chứâ các gên mã
hóâ tRNA, Rbsvà một số Pr liên quân đến quá trình
phiên mã, dịch mã, và vận chuyển các Pr khác vào ty
thể từ TBC.
Genome lục lạp: chứâ DNA ở dạng kép, mạch vòng,
chứâ khoảng 200 gen. Các gen mã hoá cho các rARNvà
tARN và các Pr cần cho hoạt động quâng hợp.
12/22/2017 401 | buihongquan@gbd.edu.vn
Kích thước của genome
12/22/2017 402 | buihongquan@gbd.edu.vn
Số lượng gen trong genome
Loài Kích thước
Genome (Mb =
10^bp)
(TT mã hóa
Protein(%)
Số lượng
gen
E. Coli 4.6 90 4.288
S. cerevisiae 12 70 5.885
C. elegans 97 25 19.099
Drosophila 180 13 13.600
Human 3000 3 100.000
12/22/2017 403 | buihongquan@gbd.edu.vn
3. Gene
Khái niệm gen:
Gen là một đoạn ADN mã hóa cho một sản phẩm cần
thiết đối với hoạt động sống của tế bào. Gen -> protein,
rARN, tARN và các loại ARN khác tham gia kiểm soát
hoạt động của genome
Cấu trúc gen:
Gồm hai vùng:
Vùng ADN điều khiển
Vùng mang mã di truyền
404 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
405
Cấu trúc của gen
Vùng DNA điều khiển: nằm trước các đoạn gen mang mã, bắt
đầu từ -1, gồm các vị trí:
Promoter: nhận biết và liên kết với enzim RNA polymerase.
Promotêr thường nằm ngây trước vị trí +1 củâ gên (vị trí Nu
đầu tiên được phiên mã sâng ARN). Ở Procâryotê: nằm
khoảng từ -35 -> -10, ở Eucâryotê từ -25 (-30) -> - 75(-90).
Vị trí hoạt hóa (A) hoặc vị trí ức chế (O): được nhận biết
bởi các Pr điều khiển, chúng có thể liên kết với AND hoặc
ARN pol làm tăng cường hoặc kìm hãm hoạt động củâ gen
trong sao mã
12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
406
2. Cấu trúc của gen (tiếp)
Vùng DNA mang mã di truyền: Là đoạn ADN được phiên mã sang
mRNA theo chiều 5’ 3’ trên sợi đâng tổng hợp (bd từ +1). Gồm:
Vùng 5’ và 3’ không dịch mã: liên quan tính bền vững củâ
mRNA; tham gia kiểm soát dịch mã..
+TT không dịch mã đầu 5’ (5’UTR): tính từ Nu phiên mã đầu
tiên đến bộ 3 Nu khởi đầu dịch mã (AUG hoặc GUG).
+ TT không dịch mã đầu 3’ (3’ UTR): tính từ một trong 3
codon dừng dịch mã đến hết trình tự kết thúc phiên mã
Khung đọc mở:
Phần DNA củâ gen mã hóa tạo chuỗi polypeptide
Bắt đầu bằng một codon khởi đầu (AUG hoặc GUG) và kết
thúc bằng một trong 3 mã kết thúc là UAA/UAG/UGA.
Mỗi bộ 3 Nu củâ khung đọc mở tương ứng với một codon mã
hóa cho một aa.
Đọc từ đầu 5’ -> 3’, đọc theo phân tử mRNA, đọc từng mã một,
đọc không chồng chéo và đọc cho đến tận mã kết thúc thì
dừng lại.
12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cấu trúc chung của một gen
12/22/2017 407 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 408 | buihongquan@gbd.edu.vn
So sánh Gen Prokaryote và Eukaryote
Prokaryote
- Promoter có TT đặc trưng
TTGACA (-35) và TATAT (-10)
- Trong gen ko có hoặc có ít intron
- Các gen nằm gần nhau và chịu sự
điều khiển chung củâ một
Promoter (operon)
- Phiên mã và dịch mã xảy ra đồng
thời.
- mARN sau phiên mã là mARN
trưởng thành.
- Không có tín hiệu nhận poly A và
mRNA không có đầu 5’ mang mũ
7 methyl
Eukaryote
- Promoter có TT đăc trưng - hộp
CAAT (- 75) và TATA (-25)
- Các đoạn exon xen lẫn intron.
- Các gen nằm xa nhau, giữâ các gen
có các đoạn không mã hoá. Mỗi
gen chịu sự đk củâ 1 Promoter
- Phiên mã và dịch mã không đồng
thời: Phiên mã trong nhân, dịch
mã ngoài tế bào chất .
- Chịu những biến đổi trước khi
dịch mã (cắt intron và nối exon,
các biến đổi tại đầu 5’ và đầu 3’)
- Các dấu hiệu gắn chuỗi poly A củâ
mRNA có trình tự 5’- AAUAAA-3’.
Vùng này nằm ở ngay trước đầu
3’nơi bắt đầu gắn polyA, dài từ 10
đến 30 nu, tiếp theo là vùng CA,
rồi đến vùng giầu GU
409 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cấu trúc gen của Eukaryote
12/22/2017 410 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cấu trúc gen của Eukaryote
12/22/2017 411 | buihongquan@gbd.edu.vn
412
Cấu trúc gen của Eukaryote
12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cấu trúc gen của Vi khuẩn – Operon Lac
12/22/2017 413 | buihongquan@gbd.edu.vn
414
Cấu trúc gen của Vi khuẩn – Operon Lac
12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
Chức năng của gen
Chức năng củâ gen thể hiện ở 3 quá trình:
Tái bản DNA.
Phiên mã tạo ra mRNA, hoặc rRNA hay tRNA.
Dịch mã hoặc sinh tổng hợp protein dựâ trên
khuôn mRNA xuyên qua ribosome để lắp ráp
các amino Acid nhờ các tRNA vận chuyển đến.
415 12/22/2017 | buihongquan@gbd.edu.vn
Taq polymerase
Các bước PCR
1 phản ứng PCR Nguyên tắc máy
PCR
Làm thế nào để
phân lập được
gen
12/22/2017 416 | buihongquan@gbd.edu.vn
Giới thiệu
Kary Mullis
1985 công triǹh nghiên
cứu vê ̀ PCR
1993 đoật gia ̉i Nobel hóa
học
12/22/2017 417 | buihongquan@gbd.edu.vn
Định nghĩa
PCR- polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi trùng
hợp
Là kỹ thuật nhân bẩn các đoạn DNA đích trong mo ̣ t mấy
luân nhiê ̣t (thêrmo-cyclêr) mầ không cần sự hiện diện
củâ tế bào
Phản ứng PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA
nằm giữâ 2 mồi chuyên biệt, nhờ sự hoật đo ̣ng của men
DNA polymerase va ̀ mo ̣ t vầi yếu tố khấc
12/22/2017 418 | buihongquan@gbd.edu.vn
Nguyên tắc
• Dựâ trên sự hoạt động củâ enzyme
• Sự hiện diện củâ mồi chuyên biệt
• Khả năng nối dài mồi củâ enzyme polymerase (tag
polymerase, Pfu polymerase)
• Các Nu tự do trong môi trường
12/22/2017 419 | buihongquan@gbd.edu.vn
Điều kiện của phản ứng PCR
DNA (0.01–0.1 µ g)
Primer 1 (20 pmol)
Primer 2 (20 pmol)
Tris-HCl (20 mM, pH 8.0)
MgCl2 (2 mM)
KCl (25 mM) or KCl (10 mM)
Deoxynucleotide triphosphates (50 µM cho mõi loậi
dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
DNA polymerase chịu nhiê ̣ t
Tỏng thê ̉ tích phẩn ứng lầ 50–100 µ L.
12/22/2017 420 | buihongquan@gbd.edu.vn
Máy PCR
12/22/2017 421 | buihongquan@gbd.edu.vn
Các bước của PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi
nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3
bước
Bước 1: Biến tính
(denaturation)
94-98oC
2-5 phút
Bước 2: Gắn mồi/Bất câ ̣p
(annealing)
30-65oC
20s-2’
Bước 3: kéo dài (extending)
68-72oC
20s-5’
12/22/2017 422 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 423 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 424 | buihongquan@gbd.edu.vn
Mồi (primers)
• Lầ cấc mậch oligonucleotide (dầi 18-30 Nu) bổ
sung với 2 vùng trên trình tự DNA
• Gòm:
• Mòi xuôi (forward primer/sense strand
primer): gấn với mậch antisense va ̀ khởi đo ̣ng
tỏng hợp DNA tậo mậch sense mới
• Mòi ngược (reverse primer/antisense strand
primer): gấn với mậch sense va ̀ khởi đo ̣ng tỏng
hợp DNA tậo mậch antisense mới
12/22/2017 425 | buihongquan@gbd.edu.vn
Thiết kế mồi (primer design)
Nguyên tắc
Trình tự củâ mồi được thiết kế sâo cho không có sự bắt
cặp giữâ mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc
(replication fork)
Nhiệt độ gắn mồi củâ mồi xuôi và mồi ngược không được
chênh lệch quá xâ (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp
nhâu thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30%<
G+C<70%))
Không nên nhiều bắt cặp sâi với DNA khuôn
Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần
khuếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA
Trình tự nằm giữâ mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn
(<3000 tốt nhất là dưới 1000)
12/22/2017 426 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cách thiết kế mồi:
Mòi xuo i: cùng trình tự với mậch mâng mẫ góc
(coding/sense strand)
Mòi ngược: cùng trình tự với mậch khuôn (template
DNA/antisense)
Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi)
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Thiết kế mồi (primer design)
12/22/2017 427 | buihongquan@gbd.edu.vn
Polymerase chịu nhiệt
Taq-polymerase : từ Thermus aquaticus
Nhiệt độ tối ưu : 72C
Có hoạt tính 5'->3' polymerase
Có hoạt tính têrminâl trânsfêrâsê : thêm 1 Adênosinê ở đầu 3’
củâ mạch DNA mới.
Không có hoật tińh 3’-5’ exonuclease ko có khả năng sửâ sâi
(2x10-5 , 0.25% sai sau 30 chu kỳ)
Sao chép ~ 2000b/min. Không sâo chép được trên 3kb
Pfu-polymerase : từ Pyrococcus furiosus
Nhiệt độ tối ưu : 72C
Có hoạt tính 5'->3' polymerase và 3’-> 5’ êxonuclêâsê
Tỷ lệ chép sâi thấp (1.5x10-6)
Sao chép ~ 500b/min
12/22/2017 428 | buihongquan@gbd.edu.vn
Cấc loậi DNA polymerase từ cấc loầi VSV khấc nhau
12/22/2017 429 | buihongquan@gbd.edu.vn
Buffers
Có nhiều loại buffer sử dụng riêng cho từng loại
enzyme.
Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt có thể
ảnh hưởng đến các phản ứng
Nhiều loại buffer đã có sẵn ion Mg2+
12/22/2017 430 | buihongquan@gbd.edu.vn
Mg2+ và dNTPs
• Mg2+ cần thiết để DNA polymerase hoật đo ̣ng.
Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA
polymerase, DNA mẫu và thành phần buffer
Nồng độ ion Mg2+ cao: tińh đâ ̣c hiê ̣u giẩm xuất hiện
thêm các sản phẩm không đặc hiệu.
Nồng độ ion Mg2+ thấp: không đu ̉ DNA polymerase hoật
hóa lượng sản phẩm PCR thấp.
dNTPs là loại hóa chất kém bền
Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc
tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR
so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác
12/22/2017 431 | buihongquan@gbd.edu.vn
Chất khác
Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử
dụng các chất biến tính như DMSO, formamide,
glycerol, and betaine trong thành phần PCR.
Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt
mồi xuống.
Dầu khoáng
12/22/2017 432 | buihongquan@gbd.edu.vn
Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến pứ PCR
1. DNA mẫu: (100ng-1g)
2. Enzyme
3. Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai)
4. dNTP: 20-200M/ mỗi lọâi nu
5. Nồng độ Mg++
6. Số lượng chu kỳ phản ứng
7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng
12/22/2017 433 | buihongquan@gbd.edu.vn
Điện di trên gel (gel eletrophoresis)
Lầ ky ̃ thuâ ̣ t được sử dụng để tấch cấc đoận DNA (hoâ ̣c
cấc đậi phân tử khấc như RNA va ̀ protein) dựa vầo kích
thước va ̀ điê ̣n tićh của chúng.
DNA được đưâ vầo cấc giếng tậi mo ̣ t đầu của khói gel, 1
dòng điê ̣n sễ được đưâ vầo khói gel để kếo cấc DNA di
chuyển. 1 giếng được giữ để lầm thang DNA.
DNA tích điê ̣n âm nên sễ di chuyển đến đầu mang điê ̣n
dương của khói gel. Cấc đoận DNA cầng ngấn di chuyển
cầng nhanh
Khi gel được nhuo ̣m bầng 1 chất nhuo ̣m liên kết với
DNA, cấc đoận DNA sễ được thể hiê ̣n dưới dậng cấc dẩi
(bands), mõi dẩi nầy đậi diê ̣n cho 1 nhóm cấc DNA có
cùng kích thước
12/22/2017 434 | buihongquan@gbd.edu.vn
12/22/2017 435 | buihongquan@gbd.edu.vn
Đọc kết quả điện di
Nhuo ̣m gel bầng chất nhuo ̣m
liên kết với DNA va ̀ đâ ̣ t gel
dưới đền UV DNA sễ phất
sấng, biểu hiê ̣n lầ từng dẩi
sấng phân bô ́ ở những vị trí
khấc nhau trên gel
Bầng cấch đói chiếu vị trí của
cấc dẩi với thang DNA, kích
thước tương đói của cấc đoận
DNA có thể được xấc định
12/22/2017 436 | buihongquan@gbd.edu.vn
Một số vấn đề thường gặp
Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp
Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác
Tăng thời gian kéo dài, số chu kỳ, nhiệt độ biến tính
Hạ nhiêt độ gắn mồi
Primer, buffer
12/22/2017 437 | buihongquan@gbd.edu.vn
Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm mong muốn
Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ
Tăng nhiệt độ gắn mồi
Thay đổi nồng độ Mg2+
Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có kt nhỏ
Một số vấn đề thường gặp
12/22/2017 438 | buihongquan@gbd.edu.vn
Một số vấn đề thường gặp
Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn
sản phẩm mong muốn
Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt
mồi
Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.
Giảm nồng độ DNA polymerase.
Tối ưu hóa nồng độ Mg2+.
Tinh sạch DNA template
Giảm nồng độ primer.
Thiết kế cặp primer mới.
12/22/2017 439 | buihongquan@gbd.edu.vn
Real-time PCR
12/22/2017 440 | buihongquan@gbd.edu.vn
PCR cô ̉ điển: khuếch đậi đoận DNA đích điê ̣n di
đọc kết quẩ
Realtime-PCR: kết quẩ khuếch đậi được hiển thi ̣ cùng
lúc với mõi chu ky ̀ nhiê ̣t phẩn ứng
12/22/2017 441 | buihongquan@gbd.edu.vn
Moät maùy luaân nhieät
Moät heä thoáng phaùt vaø ñoïc tín hieäu huyønh quang
Chöông trình vi tính ñeå theo doõi vaø phaân tích keát quaû
12/22/2017 442 | buihongquan@gbd.edu.vn
Quaù trình nhaân baûn sao ADN
trong moät phaûn öùng PCR
Theàm phaùt
hieän
Pha log
Pha bình nguyeân
Pha chaäm
S
o
á l
ö
ô
ïn
g
A
D
N
Trong pha Log : Qn = Q0 (E)
n
Qn = Soá baûn sao sau n chu kyø
Q0 = Soá baûn sao khôûi ñaàu
E = Hieäu suaát PCR
n = soá chu kyø
12/22/2017 443 | buihongquan@gbd.edu.vn
PCR coå ñieån : keát quaû chæ ñöôïc bieát sau khi taát
caû caùc voøng phaûn öùng ñaõ hoaøn thaønh .
A-6 = 10-6 ng
A-5 = 10-5ng
A-4 = 10-4ng
A-3 = 10-3ng
A-2 = 10-2ng
A-1 = 10-1ng
A1 = 1ng
A-6 A-5 A-4 A-3 A-2 A-1 A1
Real-Time PCR : quaù trình
nhaân baûn sao ADN ñöôïc
theo doõi tröïc tieáp theo töøng
chu kyø. Vôùi kyõ thuaät naøy,
ADN ban ñaàu ñöôïc ñònh
löôïng moät caùch chính xaùc.
12/22/2017 444 | buihongquan@gbd.edu.vn
Tín hieäu huyønh quang ñöôïc ño sau giai ñoaïn keùo
daøi cuûa moãi chu kyø PCR
Öu ñieåm : reû, ñôn giaûn
Nhöôïc ñieåm : khoâng ñaëc hieäu
Phöông phaùp taïo huyønh quang duøng SYBRGreen
SYBRGreen phaùt huyønh
quang khi cheøn giöõa 2 maïch
cuûa ADN
Kích thích
490nm
Phaùt quang
530nm
12/22/2017 445 | buihongquan@gbd.edu.vn
Ứng dụng của PCR
Tạo dòng DNA
Tìm hiểu mức biểu hiện củâ gen (Reverse
Transcription PCR)
Chẩn đoán bệnh (củâ người, súc vật, cây cối)
Phát hiện đột biến
Kiểm trâ chất lượng (thực phẩm, GMO, ô nhiễm
nước)
Phát hiện khác biệt giữâ các bộ gên (Đâ dạng
gen):
Áp dụng trong nông nghiệp để chọn lọc cây, con
Dấu ấn gên (Tìm châ mẹ, thủ phạm vụ án, giải
đáp những bí mật lịch sử)
12/22/2017 446 | buihongquan@gbd.edu.vn
Xác định VSV bằng pp PCR
Mẫu ly trích DNA khuếch đậi DNA (PCR) KQ
Ly trićh DNA:
Pha ́ vỡ TB va ̀ giẩi phóng thầnh phần bên trong
(lysozyme, SDS)
Lầm sậch DNA (loậi bỏ protêin, lipid - kết tủa phân
đoận, DNA nầm trong pha nước)
Tủa DNA (còn, isopropanol) thu hòi DNA
12/22/2017 447 | buihongquan@gbd.edu.vn
TÓM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN MỘT
PHẢN ỨNG PCR
1. Thiết kế mồi
2. Chuẩn bị mẫu DNA
3. Phâ mix với các thành phần thêo thứ tự sâu:
H2O tiệt trùng
Buffer
dNTP tổng số
mồi xuôi
mồi ngược
taq polymerase
DNA mẫu
4. Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp
5. Kiểm trâ sản phẩm PCR trên gêl âgârosê với sự có mặt củâ
thâng chuẩn
6. Phân tích kết quả
12/22/2017 448 | buihongquan@gbd.edu.vn
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- bai_giang_vi_sinh_thuc_pham_chuong_1_gioi_thieu_ve_vi_sinh_t.pdf