Bài giảng Vệ sinh an toàn thực phẩm - Chương 4: Phân tích vi sinh vật - Văn Hồng Thiện
Nấm men và nấm mốc
• Nhiệt độ thích hợp 20 – 28oC
• pH thích hợp 2 – 9, pH tối ưu 4 – 6,5
• Thuộc nhóm hiều khí bắt buộc, một số ít
thuộc nhóm vi hiếu khí
• Khi phát triển trong thực phẩm làm đổi
màu, tạo mùi lạ, làm hư hỏng, thay đổi
cấu trúc thực phẩm, một số loài còn sinh
độc tố
82 trang |
Chia sẻ: linhmy2pp | Ngày: 21/03/2022 | Lượt xem: 309 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Vệ sinh an toàn thực phẩm - Chương 4: Phân tích vi sinh vật - Văn Hồng Thiện, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
PHÂN TÍCH VSV
CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH
ÑÒNH LÖÔÏNG VI SINH VAÄT
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
TRỰC TIẾP
- Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào có
kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc
- Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng
vi sinh vật
-Không phân biệt được tế bào sống và chết
-Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt
vật thể
-Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp
Buồng đếm vi sinh vật
Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
TRỰC TIẾP
Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu trên kính hiển vi
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
TRỰC TIẾP
Đếm trực tiếp bằng
buồng đếmhồng cầu
Pha loãng mẫu cần
đếm sao cho trong mỗi ô
nhỏ của buồng đếm có
khoảng 5 - 10 tế bào
Cách đếm tế bào trong buồng
đếm
1. Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu
Quy trình:
- Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ)
- Nạp mẫu vào buồng đếm
- Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ô lớn
Tính mật độ:
Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml
a: trung bình cộng số lượng tế bào trong 5 ô lớn
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
TRỰC TIẾP
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC
- Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu
- Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp
- Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di
động
Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu
Không sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để
pha loãng mẫu thực phẩm
Các dung dịch pha loãng mẫu
• Buffered peptone water (BPW)
Saline peptone water (SPW)
NaCl 8,5g
Peptone 1,0g
Nước cất vừa đủ 1 lít
NaCl 5g
Peptone 10g
Nước cất vừa đủ 1 lít
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân
Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng:
10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 101
Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng mẫu lỏng Film
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠCQuy trình:
- Pha loãng
mẫu (25-250
khuẩn lạc/đĩa)
- Tạo hộp đổ
- Nuôi ủ, đếm
số lượng
Cấy mẫu vào môi trường
-Phương pháp cấy bềmặt
- Phương pháp đổ đĩa
Phương pháp đổ đĩa
• Chuẩn bị đĩa petri vô trùng
• Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng
và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều
nhiệt
• Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ
thích hợp)
• Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường,
lắc đều
• Để nguội môi trường
Phương pháp đổ đĩa
Ưu điểm
Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)
Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc
từ nhiều phía
Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng
150-300 khuẩn lạc
Nhược điểm
Không định lượng được những VSV quá nhạy
nhiệt
Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất
định
Khó làm thuần một dòng VSV
Phương pháp cấy bề mặt
• Môi trường phải được chuẩn bị trên
đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt
• Phương pháp
- Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi trường
- Trải đều trên mặt bằng que trang
tam giác
- Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho
khô mặt Film
Phương pháp cấy bề mặt
Ưu điểm
- Định lượng được các VSV nhạy nhiệt
- Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn
lạc đặc trưng
- Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục
tiêu
Nhược điểm
- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ
Bút đếm khuẩn lạc
Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc
Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc
Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc
tự động
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
KHUẨN LẠC
Tính kết quả:
Vôùi :
N: soá teá baøo (ñôn vò hình thaønh khuaån laïc) vi khuaån trong 1g
hay 1ml maãu.
ΣC: Toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc treân caùc hoäp petri ñaõ choïn
ni : Soá hoäp petri caáy taïi ñoä pha loaõng thöù i
di: heä soá pha loaõng töông öùng.
v: theå tích dòch maãu (ml) caáy vaøo trong moãi ñóa
)...()//( 11 iivdnvdn
C
mlghayCFUCFUN
++
=
∑
Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí
10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter
Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây
Dung dịch 10 -1
Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,..
Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên
tiếp – 2 petri/độ pha lõang
Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều
Tổng VSV hiếu khí/g (TPC)
N
TPC =
n1V1F1 + .+ niViFi
N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ
V: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõang
Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí
Để đông đặc
Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6h
Khuẩn lạc
Chọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc đếm
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
- Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp
- Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc hoặc theo phương
pháp MPN
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
- Kích thước lỗ lọc: 0,45 µm hoặc 0,2 µm
- Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự
mọc lan của khuẩn lạc
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
Bộ lọc và
màng lọc vô trùng
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
Phương pháp màng lọc
• Kích thước lỗ lọc 0,47µm hay 0,22µm
• Đường kính và hình dạng màng lọc phụ
thực vào đường kính phễu lọc
• Đường kính màng thường là 45mm
Thiết bị lọc nhiều phễu
VSV
Phương pháp lọc VSV
• Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được
vô trùng sau mỗi lần lọc
• Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp:
<150 khuẩn lạc/màng
• Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -
100ml
• Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải
pha loãng bằng dd pha loãng hay
nước cất vô trùng
Phương pháp màng lọc
•Ưu điểm
–Xác định được mật độ VSV cụ
thể trong một thể tích mẫu lớn:
10ml, 100ml
• Nhược điểm
–Không thích hợp cho việc phân tích
các mẫu thực phẩm rắn
Khuẩn lạc vsv mọc trên màng
1A 1B
1C 1D
.
2A 2B
2C 2C
E. coli trên môi trường ID Coli agar Coliforms trên môi trường ID Coli agar
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌCQuy trình:
- Khử trùng dụng cụ lọc
- Lọc chân không
- Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng
- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri
Tính mật độ:
MPN = N x ln(N/N - x)
Với: N: Tổng số các ô vuông
x: số ô có khuẩn lạc mọc
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
MÀNG LỌC
Vi khuẩn phát triển trên màng lọc
IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
PETRIFILM- Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform,
coliform phân, nấm mốc, nấm men
- Kỹ thuật dễ thao tác
- Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu
- Không cần hấp khử trùng môi trường
IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG
PETRIFILM
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)
- Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác
suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu
- Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một
loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau
- Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hoá đục của môi trường
nuôi cấy → dương tính
- Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ
pha loãng (3 hoặc 5 lần)
- Phương pháp dùng định lượng mọi nhóm vi sinh vật nuôi trên
môi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến.
Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất
thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác
nhau của mẫu.
Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 –
10 lần)
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần
lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm
tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng
thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
(Most Probable Number)
• Hai hệ thống MPN
- Hệ thống 9 ống
- Hệ thống 15 ống
• Đặc điểm
- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng
trên môi trường nuôi cấy như
Sự tạo hơi: Coliforms
Sự đổi màu: S. aureus
- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể
tích mẫu lớn
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
Hệ thống MPN/g(ml)
Hệ thống 9
ống
10ml mỗi trường
Hệ thống 15 ống
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
1 - Chuẩn bị các ống
nghiệm có chứa môi
trường thích hợp cho
sự tăng trưởng của
đối tượng VSV cần
định lượng
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10-1
1ml
10-2
1ml
10-3
1ml
2 - Cấy một thể
tích chính xác
dung dịch mẫu
ở 3 nồng độ pha
loãng bậc 10
liên tiếp
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
3 – Đem ống nghiệm
ủ ở điều kiện thích
hợp
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
4 – Quan sát các
biểu hiện chứng
minh sự phát triển
của vsv cần kiểm
định
Sự
đổi
màu
của
môi
trường
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
5 – Ghi nhận số
lượng các ống
nghiệm dương tính ở
từng độ pha loãng
5
2
1
+ + + + +
+
+
+
5 – Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV
5
2
1
Tra bảng Số vsv: 70 MPN/g
Kết quả
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10-1
10-2
10-3
1ml
1ml
1ml
5
2
1
Tra Bảng
Số vsv: 70 MPN/ml
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)
Phương
pháp
MPN
(loạt 5
ống)
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)Bảng tra MPN
(loạt 3 ống)
-333
1100233
460133
240033
9300
6200
3100
-000
0,1110
Số ml mẫu sử dụng
Số
MPN/100
ml
Số lượng ống
dương tính
PHÁP MPN
(MOST
PROBABLE
NUMBER)
Bảng tra MPN (loạt 5 ống)
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)Quy trình:
- Pha loãng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp
- Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa môi trường chọn lọc
một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn
- Nuôi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhóm
- Tra bảng Mac Crady→trị số MPN (a)
Tính mật độ:
Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d
Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady
V2: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1)
V1: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml)
d: độ pha loãng ở loạt ống đầu tiên
1
2
V
V
Key xác định E.coliNhuộm
Gram
Gram + Gram -
Hình
dạng
Hình queHình cầu
Test
oxydase
Lên men
lactose
Key xác định E.coli
Lên men
lactose
Sinh trưởng
trên citrate
Sinh
indol
Nhận biết E. coli và Coliforms
Choïn khuaån laïc deït, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính
khoaûng 1mm ñeå caáy sang TSA hay BHI
Laáy 10g (10ml) maãu ñoàng nhaát vaøo 90ml nöôùc muoái sinh lyù, ñöôïc 10-1
Choïn oáng (+), caáy sang canh EC, uû 44.0 ± 0.5oC trong 24-48 giôø
Choïn caùc oáng sinh hôi caáy sang Endo Maãu
khoâng sinh hôi ñöôïc coi laø aâm tính E. coli
UÛ ôû 37.0 ± 0.5oC trong 24 giôø
Pha loaõng maãu 10-2, 10-3, 10-4
Chuyeån 1ml dung dòch 10-2, 10-3, 10-4 vaøo 10ml canh BGBL, moãi noàng ñoä 3 oáng laëp laïi, uû 37oC, 36h
XÑ soá oáng (+) ôû moãi ñoä pha loaõng
Coliform
Quy trình phaân tích
coliform vaø E. coli
UÛ ôû 37.0 ± 0.5oC qua ñeâm
Keát luaän: Phaùt hieän (khoâng phaùt hieän)
E.coli/g
Caáy chuyeån vaøo caùc moâi tröôøng thöû nghieäm sinh
hoaù: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon
Citrate (1) ñeå thöû nghieäm phaùp IMViC
E. coli coù bieåu hieän sinh hoaù: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-). Moät
trong soá caùc phaûn öùng treân sai laø khoâng phaûi E.coli
Môi trường Brillant Green Lactose Bile Broth
Nhận biết E coli và Coliforms
+
Môi trường E.coli broth (EC) – dương tính
Nhận biết E. coli và Coliforms
+
Nhận biết E. coli và Coliforms
Môi trường Eosin Metyl Bile (EMB) – dương tính
Coliform phân hay E.coli giả định
Nhận biết E. coli và Coliforms
Môi trường Eosin
Metyl Bile (EMB) –
dương tính
Coliform phân
hay E.coli giả định
Nhận biết E. coli
Phản ứng IMViC
Phản ứng Indol
dương tính E.coli
Đối
chứng
− +
Nhận biết E. coli
Phản ứng IMViC
Phản ứng methyl red (MR) dương tính E.coli
++ −
Đối
chứng
Methyl red
Nhận biết E. coli
Phản ứng IMViC
Phản ứng Voges-Proskauer (VP) âm tính E.coli
Thuốc thử VP
−
Đối
chứng
+
−
Đối
chứng
Đối
chứng
Đỏ tươiĐỏ đồng
+
−
Nhận biết E. coli
Phản ứng IMViC
Môi trường Simmons
Citrate âm tính E.coli
−
Đối
chứng + +
Nấm men và nấm mốc
• Thuộc nhóm vsv dị dưỡng, có nhân thật,
rất đa dạng
Nấm Men
•Tế bào đơn tính
•Sinh sản theo kiểu nảy chồi
Nấm Mốc
•Tế bào dạng sợi
•Sinh sản bằng bào tử
hay khuẩn ty
Nấm men và nấm mốc
• Nhiệt độ thích hợp 20 – 28oC
• pH thích hợp 2 – 9, pH tối ưu 4 – 6,5
• Thuộc nhóm hiều khí bắt buộc, một số ít
thuộc nhóm vi hiếu khí
• Khi phát triển trong thực phẩm làm đổi
màu, tạo mùi lạ, làm hư hỏng, thay đổi
cấu trúc thực phẩm, một số loài còn sinh
độc tố.
Quy trình phân tích định tính
Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 30oC, 1
– 7 ngày
Cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDA (Sabouraud Dextrose
Agar) , MEA (Malt Extract Agar) hay PDA (Potato Dextrose Agar) , ủ ở
30oC trong 7 ngày.
Kết luận: có/không có nấm mốc
Phân tích tổng nấm men và nấm
mốc
Đồng nhất và pha loãng thành các nồng độ
pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa
DRBC hoặc DG18, ủ ngửa
đĩa ở 25oC, 5-7 ngày
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa MEA
hoặc PDA, ủ ngửa đĩa ở
30oC, 7 ngày
Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính
mật độ (CFU/g)
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- bai_giang_ve_sinh_an_toan_thuc_pham_chuong_4_phan_tich_vi_si.pdf