Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng của công nghệ sinh học động vật, người và y sinh (tiếp)

Từ năm 1999, sự phát triển của Genomics và Proteomics dẫn đến Công nghệ microarray (Microarray technology) và đến năm 2002 sản phẩm đầu tiên có mặt trên thị trường. Xuất phát từ nhu cầu thực tế chẩn đoán, các hãng dược phẩm cũng như các trung tâm nghiên cứu lớn đã cho ra đời nhiều sản phẩm dùng cho phát hiện nhanh (như xác định SNP) có thể ở dạng chip (bọ điện tử), dạng bi (bead) có từ tính (hình 4.9) hay các microarray (hình 4.10) và có thể ở nhiều dạng khác hoặc là sự kết hợp của các dạng trên. Tựu chung, nhằm tạo thuận lợi nhất cho chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác các SNP đang quan tâm

pdf108 trang | Chia sẻ: nguyenlam99 | Lượt xem: 814 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng của công nghệ sinh học động vật, người và y sinh (tiếp), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
1 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Mơn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 1. Kỹ thuật nuơi cấy tế bào động vật 2. Cơng nghệ nhân bản động vật 3. Cơng nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Cơng nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dịng 6. Chẩn đốn phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng Nội dung Kü thuËt chuyĨn gen lµ kü thuËt ®-a mét hay nhiỊu gen l¹ ®· ®-ỵc thiÕt kÕ ë d¹ng ADN t¸i tỉ hỵp vµo tÕ bµo chđ cđa ®éng vËt lµm cho gen l¹ cã thĨ tån t¹i ë d¹ng plasmit t¸i tỉ hỵp hoỈc g¾n vµo bé gen tÕ bµo chđ. Trong tÕ bµo chđ, c¸c gen nµy ho¹t ®éng tỉng hỵp nªn c¸c protein ®Ỉc tr-ng dÉn tíi viƯc xuÊt hiƯn c¸c ®Ỉc tÝnh míi cđa c¬ thĨ chuyĨn gen. ®èi víi c¸c thĨ nh©n chuÈn, viƯc chuyĨn gen ®-ỵc xem lµ thµnh c«ng khi gen chuyĨn vµo ®-ỵc tỉ hỵp vµo genom cđa tÕ bµo chđ, ®Ỉc tÝnh cđa gen chuyĨn n¹p ®-ỵc duy tr× ỉn ®inh qua c¸c thÕ hƯ con ch¸u Ph-¬ng ph¸p chuyĨn gen trùc tiÕp : -ChuyĨn gen nhê phèt ph¸t canxi -ChuyĨn gen nhê xung ®iƯn -ChuyĨn gen nhê vi tiªm -ChuyĨn gen nhê liposom Ph-¬ng ph¸p chuyĨn gen gi¸n tiÕp: nhê virus Nguyên lý:  c¸c DNA ngo¹i lai ®-ỵc trén víi CaCl2 sau ®ã ®-ỵc chuyĨn vµo mét dung dÞch chøa ion phosphat. Mét phøc hỵp ®ång ng-ng kÕt (coprecipitate) gi÷a canxi phosphat vµ DNA sÏ ®-ỵc h×nh thµnh, phøc hỵp nµy sÏ ®-ỵc c¸c tÕ bµo ®éng vËt cã vĩ tiÕp nhËn khi nu«i cÊy, kÕt qu¶ lµ cã sù thĨ hiƯn gen ngo¹i lai trong tÕ bµo. Kü thuËt nµy cã thĨ sư dơng ®Ĩ ®-a bÊt k× DNA vµo tÕ bµo ®éng vËt cã vĩ víi mơc ®Ých c¸c test thĨ hiƯn chuyĨn n¹p hay biÕn n¹p l©u dµi. C¸c DNA chuyĨn n¹p mang mét gen chØ thÞ chän läc (nh- gen aminoglycoside phosphatransferase) ®Ĩ giĩp cho viƯc thanh läc c¸c tÕ bµo kh«ng tiÕp nhËn DNA.  Khi cã mét nång ®é tÕ bµo cao vµ t¹o ra mét ®iƯn thÕ cao trong mét thêi gian rÊt ng¾n, lĩc ®ã trªn mµng tÕ bµo xuÊt hiƯn c¸c lç nhá, DNA cã thĨ ®i s©u vµo trong tÕ bµo vµ ë mét sè tÕ bµo chĩng cã thĨ t-¬ng t¸c víi genome cđa tÕ bµo.  M¸y electroporation th-êng ®-ỵc l¾p ®Ỉt mét c«ng suÊt ỉn ®Þnh (vµ c¶ thêi gian g©y xung ỉn ®Þnh) víi c¸c ®iƯn thÕ biÕn ®ỉi tõ 500-1500 v/cm. §èi víi hÇu hÕt tÕ bµo, sù thiÕt lËp nh- vËy ®¶m b¶o 20-50% sè tÕ bµo cßn sèng sau khi thùc nghiƯm chuyĨn DNA.  Qu¸ tr×nh chuyĨn gen nhê electroporation ®-ỵc thùc hiƯn ë nhiƯt ®é phßng cßn c¸c tÕ bµo ®-ỵc gi÷ liªn tơc trong ®¸ ®Ĩ kÐo dµi thêi gian më lç c¸c tÕ bµo.  Tiªm trùc tiÕp ADN ngo¹i lai vµo nh©n tÕ bµo ®éng vËt nhê dơng cơ vi tiªm víi kim tiªm rÊt m¶nh.  ViƯc chuyĨn gen vµo tÕ bµo ®éng vËt tèt nhÊt lµ chuyĨn vµo mét trong nh÷ng nh©n con cđa trøng ®· thơ tinh tr-íc khi c¸c nh©n con kÕt hỵp víi nhau ®Ĩ t¹o ra hỵp tư l-ìng béi.  NÕu tiÕn hµnh chuyĨn gen ë c¸c giai ®o¹n muén cã thĨ t¹o ra ph«i kh¶m: chØ cã mét sè tÕ bµo cã gen chuyĨn vµo.  B»ng c¸ch chuyĨn gen vµo giai ®o¹n tiỊn nh©n, gen chuyĨn vµo sÏ ®-ỵc truyỊn cho c¸c thÕ hƯ ph«i tiÕp theo vµ cã thĨ di truyỊn cho con ch¸u. ThiÕt bÞ chuyĨn gen b»ng vi tiªm Ph-¬ng ph¸p nµy cho kÕt qu¶ rÊt cao nh-ng sè l-ỵng tÕ bµo ®-ỵc xư lý nhá do ph¶i thao t¸c trªn tõng tÕ bµo. Ph-¬ng ph¸p nµy th-êng dïng ®Ĩ ®-a ADN vµo hỵp tư hoỈc c¸c tÕ bµo ph«i sím. Gene injected into the male pronuclei Nguyªn lý thiÕt kÕ vect¬ chuyĨn gen liposom  Ph-¬ng ph¸p dùa trªn sù t-¬ng t¸c ion cđa DNA vµ thĨ liposome t¹o ra mét thĨ phøc hỵp, phøc hỵp nµy cã thĨ phãng thÝch c¸c DNA chøc n¨ng vµo tÕ bµo nu«i cÊy  Liposom cÊu t¹o tõ c¸c líp mµng lipid t¹o d¹ng tĩi, bªn trong chøa n-íc, kÝch th-íc kho¶ng 10 nm ®Õn 1000 nm. Liposom th-êng cã mét líp lipid mang ®iƯn tÝch d-¬ng (lipofectamin) vµ c¸c ph©n tư lipid trung tÝnh - nªn nã cã ®iƯn tÝch d-¬ng (+). Liposom cã thĨ kÕt hỵp víi c¸c ph©n tư, hoỈc c¸c chÊt mang ®iƯn tÝch ©m (-) t¹o thµnh phøc hỵp ỉn ®Þnh.  ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt lµ t¹o c¸c phøc hỵp liposom - DNA. Ph©n tư DNA cã ®iƯn tÝch ©m (-) cã thĨ kÕt hỵp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hỵp ỉn ®Þnh, ®-ỵc sư dơng lµm vect¬ chuyĨn gen. S¬ ®å cÊu trĩc vµ ho¹t ®éng cđa vect¬ liposom ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt lµ t¹o c¸c phøc hỵp liposom - DNA. Ph©n tư DNA cã ®iƯn tÝch ©m (-) cã thĨ kÕt hỵp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hỵp ỉn ®Þnh, ®-ỵc sư dơng lµm vect¬ chuyĨn gen. C¬ chÕ ho¹t ®éng cđa vect¬ liposom  Vect¬ liposom cã kh¶ n¨ng tiÕp xĩc víi mµng tÕ bµo cđa c¸c tÕ bµo ®Ých vµ chui qua mµng tÕ bµo, khi ®ã líp c¸c ph©n tư lipid bÞ ph©n hủ lµm cho c¸c gen mơc tiªu ®-ỵc ®-a vµo trong tÕ bµo.  Gen mơc tiªu cã thĨ ®-ỵc ®-a vµo trong nh©n, tån t¹i trong nh©n nh- nh÷ng ®¬n vÞ gen ®éc lËp. Trong nh©n c¸c gen mơc tiªu cã thĨ cã qu¸ tr×nh t¸i tỉ hỵp lµm cho gen nµy ®-ỵc g¾n vµo bé gen cđa tÕ bµo chđ. Khi x©m nhiƠm vµo tÕ bµo, virus cã kh¶ n¨ng chuyĨn bé gen cđa nã vµo tÕ bµo chđ. Mét sè nhãm virus cã thĨ g¾n bé gen hoỈc mét sè gen cđa chĩng vµo bé gen tÕ bµo chđ, t¹o thµnh mét thĨ thèng nhÊt. C¸c gen virus g¾n víi bé gen cđa tÕ bµo chđ cã thĨ tån t¹i l©u dµi cïng víi qu¸ tr×nh ph©n chia cđa tÕ bµo chđ, t¹o nªn c¸c provirus. Sơ đồ chuyển gen nhờ virus vector S¬ ®å chuyĨn gen nhê virus  Tạo giống -Nhiều sinh vật với các đặc điểm ưư việt  Chất lượng thực phẩm -Các thực phẩm khỏe mạnh hơn được sản xuất nhanh hơn  Kháng bệnh -Kháng lại sự lây nhiễm của vi khuẩn  Tạo các sản phẩm mới -Dê sản xuất tơ nhện  Các test kiểm tra tính an tồn hĩa học -Sinh vật sản xuất các enzyme mới www.carleton.c a  Cấy ghép phủ tạng (Xenotransplantation) Bổ sung dinh dưỡng (Nutrition supplements) Trị liệu gen ở người (Human Gene Therapy)  Mơ hình nghiên cưứ mới -Chuột chuyển gen  Thúc đẩy tiến hĩa -Sinh vật mới với nhiều đặc điểm mong muốn www.meddean.luc.ed u Một số ví dụ về động vật chuyển gen  N¨m 1988 Ward vµ céng sù ®· chuyĨn 2 gen m· ho¸ cho 2 enzym cđa vi khuÈn vµo cõu ®Ĩ biÕn ®ỉi Serine thµnh Cystein nh»m t¨ng s¶n l-ỵng len do Serine k×m h·m qu¸ tr×nh tỉng hỵp len.  ViƯn nghiªn cøu n«ng nghiƯp quèc gia Ph¸p (INRA) ®· t¹o ra gièng bß tiÕt s÷a chua (yaourt) do chuyĨn gen lªn men s÷a chua tõ vi khuÈn vµo bé m¸y di truyỊn cđa bß s÷a. Con bß nµy tªn lµ BuBu do Danny Lactaire t¹o thµnh c«ng.  ChuyĨn gen kh¸ng virut nh- interferon, gen kh¸ng influenza vµo lỵn, gà vµ cõu.  ChuyĨn gen kh¸ng ®«ng l¹nh vèn m· ho¸ cho mét ph©n tư protein gi÷ cho m¸u khái bÞ ®«ng l¹nh. Protein nµy (AFPs) ®-ỵc De Vries ph¸t hiƯn tõ 1969 ë c¸ sèng ë vïng ®«ng l¹nh  (- 20 0C). Ng-êi ta ®ang nghiªn cøu thiÕt kÕ gen nµy ®Ĩ chuyĨn vµo c¸, mét sè ®éng vËt vµ kĨ c¶ c©y trång. Gia súc chuyển gen Bị sữa mang các thêm các bản copy của hai loại gen sinh casein cĩ khả năng sản xuất tăng 13% protein sữa EnviroPig TM Lơn biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt Phytic acid trong thức ăn của lợn được phân giải, giải phĩng P P được hấp thu bởi lơn Thường thì phức hợp phytic acid/P đi qua lơn và thải ra ngồi ở dạng phân Phân lơn là chất gây ơ nhiễm mơi trường , thúc đẩy sự phát triẻn rêu ở ao hồ gây chết cá Figure 1. Phytase produced in the salivary glands and secreted in the saliva increases the digestion of phosphorus contained in feed grains. Cá chuyển gen Tilapia Salmon/trout Catfish Tốc độ sinh trưởng tăng lần do chuyển gen sinh hocmon sinh trưởng Cá chuyển gen antifreeze protein As water temperature drops the GH gene is turned on The fish continue to grow when normally they would not Antifreeze promoter from pout 1997, Tracy the sheep, the first transgenic animal to produce a recombinant protein drug in her milk alpha-1-antitrypsin (AAT) treatment for emphysema & cystic fibrosis Created by PPL Therapeutics & The Roslin Institute Animal Bioreactor “Pharming”  B»ng c¸ch chuyĨn gen vµo ®éng vËt lÊy s÷a cã thĨ thu ®-ỵc s÷a cã mang c¸c protein là s¶n phÈm của gen chuyĨn n¹p:  Gen t¹o Lysostaphin: kh¸ng khuÈn g©y bƯnh viªm vĩ ë tr©u bß.  Gen s¶n xuÊt Factor IX (ng-êi): yÕu tè ®«ng m¸u  ChuyĨn gen 1-PI cđa ng-êi víi promotor  lactoglobulin vµo cõu vµ cho kÕt qu¶ rÊt kh¶ quan, hµm l-ỵng 1- PI ®¹t ®-ỵc 35g/lÝt s÷a, chiÕm 50% tỉng l-ỵng s÷a.  ChuyĨn gen cho dª Alpine ®Ĩ s¶n xuÊt s÷a chøa protein ®Ỉc hiƯu ®iỊu trÞ ung th- cã tªn lµ BR96.  ChuyĨn gen t¹o albumin cđa m¸u ng-êi vµo cõu ®Ĩ s¶n xuÊt albumin- thµnh phÇn chÝnh cÊu t¹o nªn m¸u tõ s÷a cõu. ViƯc s¶n xuÊt ®¹i trµ albumin ng-êi trong s÷a cõu sÏ ®-ỵc ph¸t triĨn m¹nh khi ph-¬ng ph¸p nh©n b¶n ®éng vËt ®· ®-ỵc hoµn thiƯn. ë Mü ®ang kÕt hỵp kü thuËt nh©n b¶n ®éng vËt víi kü thuËt gen ®Ĩ t¹o ra c¸c bß s¶n xuÊt albumin cao trong s÷a (80 kg albumin/bß/n¨m). S¬ ®å chuyĨn gen ®Ĩ s¶n xuÊt Factor VIII trong s÷a lỵn  Tr-êng ®¹i häc Cambridge ®· t¹o ra lỵn chuyĨn gen kh¸ng thĨ cđa ng-êi, cã tim ®-ỵc bao bäc bëi protein ng-êi nªn cã thĨ ghÐp cho ng-êi mµ kh«ng g©y ph¶n øng ®µo th¶i.  Ca ghÐp tim lỵn cho ng-êi ®Çu tiªn thùc hiƯn cho thÊy sau 1 n¨m ghÐp qu¶ tim lỵn trong c¬ thĨ ng-êi vÉn lµm viƯc b×nh th-êng.  HiƯn t¹i c¸c nhµ khoa häc Mü ®· cã 500 con lỵn cã thĨ cung cÊp phđ t¹ng ghÐp.  Mét thµnh c«ng rÊt ®¸ng chĩ ý lµ chuyĨn gen vµo muçi ®Ĩ chèng l¹i bƯnh sèt rÐt víi 2 h-íng: ◦ T¹o muçi cã kh¶ n¨ng ®Ị kh¸ng víi ký sinh trïng sèt rÐt, ký sinh trïng kh«ng thĨ sèng l©u trong c¬ thĨ muçi, chĩng sÏ bÞ diƯt tr-íc khi truyỊn bƯnh cho ng-êi. ◦ T¹o muçi mÉn c¶m víi ký sinh trïng sèt rÐt, muçi sÏ bÞ diƯt bëi chÝnh ký sinh trïng nµy tr-íc khi truyỊn bƯnh cho ng-êi. Webster and Peter Transgenic male kids carrying silk gene Transgene -> Gene coding for a growth hormone ANDi, the first transgenic primate born in January, 2000 224 unfertilized rhesus eggs were infected with a GFP virus ~Half of the fertilized eggs grew and divided 40 were implanted into twenty surrogate mothers five males were born,two were stillborn ANDi was the only live monkey carrying the GFP gene Alba, the EGFP (enhanced GFP) bunny Created in 2000 as a transgenic artwork Transgenic Pigs Pass on the Transgene GloFish, originally developed in Singapore as a way to monitor water pollution The normally black-and-silver zebrafish was turned green or red by inserting various versions of the GFP gene Glofish are on sale throughout the US except in California Glofish retail for about $5 per fish. Normal zebrafish cost around one tenth of the price p27 knockout mouse is bigger than the control This is not due to obesity, but the skeletal structure is increased in size (everything about the mouse is larger) p27 knockout mouse GDF8 (Myostatin) knockout mouse Over twice the muscle mass of a wildtype mouse normal knockout Naturally Occurring GDF8 Mutants FGF5 knockout mouse has long, angora-like hair 1. Kỹ thuật nuơi cấy tế bào động vật 2. Cơng nghệ nhân bản động vật 3. Cơng nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Cơng nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dịng 6. Chẩn đốn phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng Nội dung  Vacxin sèng nh-ỵc ®éc: lµ c¸c dßng virut kh«ng ®éc cã trong tù nhiªn hoỈc c¸c dßng g©y bƯnh yÕu ®-ỵc t¹o ra do nu«i cÊy nh©n t¹o liªn tơc nhiỊu thÕ hƯ.  Vacxin bÊt ho¹t: lµ c¸c dßng virut bÞ chÕt do xư lý c¸c t¸c nh©n ho¸, lý kh¸c nhau.  Vacxin t¸i tỉ hỵp: T¸c nh©n kh¸ng nguyªn ë ®©y chÝnh lµ c¸c protein/glicoprotein ®Ỉc hiƯu cđa virut ®-ỵc s¶n xuÊt th«ng qua c«ng nghƯ AND t¸i tỉ hỵp  T¸c nh©n kh¸ng nguyªn cđa c¸c virus g©y bƯnh lµ protein/glycoprotein cđa vá virut nªn cã thĨ sư dơng chĩng lµm vacxin  §Ĩ tỉng hỵp c¸c ph©n tư protein/glycoprotein nµy, cÇn t¸ch vµ nh©n dßng c¸c gen m· hãa chĩng tõ genom cđa virus vµ gµi vµo c¸c vect¬ thÝch hỵp.  C¸c vect¬ t¸i tỉ hỵp mang gen cđa virus sÏ ®-ỵc ®-a vµo c¸c tÕ bµo (vi khuÈn, nÊm men) ®Ĩ s¶n xuÊt ra c¸c protein/glycoprotein kh¸ng nguyªn lµm vacxin. §©y lµ vacxin t¸i tỉ hỵp. RNA Reverse Transcription DNA PCR DNA encoding gene of interest Cloning Expression plasmid Plasmid growth in bacteria Purification of plasmid ExtractionTransfection CHO, yeast, or insect cells In vitro antigen production In vivo antigen production Vaccine vector  S¶n xuÊt vacxin t¸i tỉ hỵp kh¸ng bƯnh lë måm long mãng. Virut FMDV (Foot ADN Mouth Disease Virut) g©y bƯnh gåm mét ph©n tư ARN ®-ỵc bäc bëi vá protein. Vá protein chøa 4 tiĨu phÇn VP1, VP2, VP3 vµ VP4 trong ®ã VP1 ®ãng vai trß kÝch thÝch t¹o kh¸ng thĨ.  C¸c nhµ khoa häc cđa h·ng Gentech ®· t¸ch ®-ỵc gen m· ho¸ VP1, ®-a nã vµo E.coli th«ng qua plasmit pBR322 vµ buéc nã s¶n xuÊt VP1 trong tÕ bµo E.coli. Kh¸ng nguyªn lµ protein VP1 t¸i tỉ hỵp rÊt ỉn ®Þnh vµ cßn gi÷ ®-ỵc hiƯu qu¶ t¸c dơng ë 100 0C.  Vacxin t¸i tỉ hỵp chèng bƯnh lë måm long mãng  Vacxin t¸i tỉ hỵp chèng bƯnh xanh l-ìi cõu (bß)  Vacxin t¸i tỉ hỵp chèng bƯnh b¹ch cÇu bß  Vacxin t¸i tỉ hỵp chèng bƯnh Newcastle  Vacxin t¸i tỉ hỵp chèng bƯnh cĩm gia cÇm  Vacxin t¸i tỉ hỵp chèng bƯnh Marek   Cã thĨ sư dơng vect¬ virus ®Ĩ nh©n dßng c¸c kh¸ng nguyªn vacxin  Tiªu chuÈn cđa vect¬ virus: Kh«ng g©y bƯnh cho ®éng vËt ®-ỵc xư lý G©y ®-ỵc miƠn dÞch Kh«ng truyỊn ngang cho ng-êi Cã kh¶ n¨ng nhËn ®o¹n AND ngo¹i lai lín Nh©n nhanh dƠ dµng trong tÕ bµo chđ Trong thùc tÕ kh«ng cã lo¹i virus nµo tháa m·n c¸c ®iỊu kiƯn trªn. HiƯn nay dïng lµm vect¬ 1 sè virus: baculovirus, virus ®Ëu, virus pox, virus Herper  Kh¸ng thĨ: lµ c¸c protein ®-ỵc c¬ thĨ ng-êi hoỈc ®éng vËt cã x-¬ng sèng s¶n sinh ra ®Ĩ chèng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn t-¬ng øng. C¸c kh¸ng thĨ nµy lµ c¸c kh¸ng thĨ ®a dßng v× khi x©m nhiªm vµo c¬ thĨ, c¸c ph©n tư kh¸ng nguyªn kÝch thÝch tÕ bµo s¶n xuÊt rÊt nhiỊu ph©n tư kh¸ng thĨ kh¸c nhau.  Kh¸ng thĨ ®¬n dßng: lµ tËp hỵp cđa c¸c ph©n tư kh¸ng thĨ ®ång nhÊt vỊ cÊu trĩc vµ tÝnh chÊt. Chĩng ®-ỵc t¹o ra bëi dßng tÕ bµo lai gi÷a tÕ bµo ung th- myeloma vµ tÕ bµo lympho cđa hƯ miƠn dÞch cđa ®éng vËt hoỈc cđa ng-êi. Kháng thể và kháng nguyên bị các tế bào bạch cầu bao vây  §Ĩ s¶n xuÊt kh¸ng thĨ ®¬n dßng tr-íc hÕt ng-êi ta ph¶i t¸ch ®-ỵc c¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng t¹o kh¸ng thĨ, sau ®ã cho lai c¸c tÕ bµo nµy víi tÕ bµo ung th- b»ng ph-¬ng ph¸p dung hỵp.  Sư dơng m«i tr-êng nu«i cÊy chän läc ®Ĩ t¸ch ra c¸c tÕ bµo lai. TÕ bµo lai cã 2 ®Ỉc ®iĨm: ph©n chia liªn tơc do mang ®Ỉc tÝnh cđa tÕ bµo ung th- ®ång thêi l¹i cã ®Ỉc tÝnh s¶n sinh kh¸ng thĨ.  Sư dơng ph-¬ng ph¸p pha lo·ng ®Ĩ thu ®-ỵc tõng tÕ bµo lai riªng rÏ. Nu«i cÊy riªng c¸c tÕ bµo nµy cho ph¸t triĨn thµnh dßng vµ s¶n xuÊt kh¸ng thĨ ®Ỉc tr-ng.  KÕt qu¶ ta sÏ thu ®-ỵc c¸c kh¸ng thĨ ®¬n dßng s¶n sinh ra tõ c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau.  T¹o c¸c tÕ bµo sinh kh¸ng thĨ: tiªm kh¸ng nguyªn vµo chuét ®Ĩ g©y ph¶n øng miƠn dÞch trong c¬ thĨ chuét. C¸c kh¸ng nguyªn nµy sÏ kÝch thÝch tÕ bµo tuþ chuét s¶n xuÊt kh¸ng thĨ.  T¹o c¸c tÕ bµo lai: t¸ch tÕ bµo tuþ chuét cã kh¶ n¨ng sinh kh¸ng thĨ vµ cã ®Ỉc tÝnh kh¸ng ®-ỵc hçn hỵp HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine). Trén chĩng víi c¸c tÕ bµo u tủ (myeloma) tÕ bµo nµy kh«ng kh¸ng ®-ỵc HAT. Bỉ sung PEG (Polyethylene Glycol) vµo dÞch huyỊn phï chøa hçn hỵp hai lo¹i tÕ bµo trªn ®Ĩ dung hỵp tÕ bµo, t¹o tÕ bµo lai.  Nu«i cÊy vµ chän läc c¸c tÕ bµo lai: nu«i cÊy hçn hỵp tÕ bµo trªn m«i tr-êng chøa HAT. TÕ bµo tuþ chuét ph¸t triĨn b×nh th-êng sau 1-2 tuÇn nu«i cÊy råi chÕt. TÕ bµo myeloma kh«ng kh¸ng ®-ỵc HAT kh«ng sinh tr-ëng ®-ỵc vµ chÕt ngay sau khi nu«i cÊy. ChØ cã c¸c tÕ bµo lai ph¸t triĨn b×nh th-êng v× chĩng cã hai ®Ỉc ®iĨm: ph©n chia v« h¹n vµ kh¸ng ®-ỵc HAT.  T¸ch dßng tÕ bµo lai: nu«i cÊy riªng tõng tÕ bµo lai, chän läc tÕ bµo cã kh¶ n¨ng sinh kh¸ng thĨ ®Ỉc hiƯu víi kh¸ng nguyªn ®· ®-a vµo chuét vµ nh©n dßng tÕ bµo nµy ®Ĩ s¶n xuÊt kh¸ng thĨ ®¬n dßng.  Ph-¬ng ph¸p s¶n xuÊt mang tÝnh c«ng nghiƯp, lµ kh¸ng thĨ tinh khiÕt vµ cã tÝnh ®Ỉc hiƯu cao.  X¸c ®Þnh sù hiƯn diƯn chÝnh x¸c cđa virut, vi khuÈn g©y bƯnh.  Cã thĨ ph¸t hiƯn ®-ỵc nhiỊu kh¸ng nguyªn ch-a biÕt trªn bỊ mỈt tÕ bµo.  Dïng kh¸ng thĨ ®¬n dßng ®Ỉc hiƯu cã thĨ chèng l¹i kh¸ng nguyªn ®Ỉc hiƯu cđa tÕ bµo lympho T qua ®ã øc chÕ ph¶n øng th¶i lo¹i khi ghÐp c¬ quan  Cã thĨ chÈn ®o¸n ®-ỵc khèi u qua viƯc x¸c ®Þnh hµm l-ỵng hocmon vµ ®¸nh gi¸ ho¹t ®éng cđa tuyÕn néi tiÕt hoỈc c¸c protein ®Ỉc hiƯu cho sù h×nh thµnh khèi u. ThÝ dơ nh-: hµm l-ỵng phetoprotein cã nhiỊu ë bƯnh nh©n ung th- gan vµ ung th- tiỊn liƯt tuyÕn hoỈc protein HCG (human chorionic Gonadotropin) cã mỈt ë nhiỊu bƯnh nh©n ung th- kh¸c.  §Þnh h-íng thuèc: cã thĨ g¾n kh¸ng thĨ ®¬n dßng víi thuèc nh»m ®Þnh h-íng cho thuèc chøa bƯnh tíi trùc tiÕp n¬i cÇn ch÷a trÞ (n¬i cã protein ®Ỉc hiƯu víi kh¸ng thĨ ®¬n dßng). S¶n xuÊt kh¸ng thĨ ®¬n dßng ë chuét 1. Kỹ thuật nuơi cấy tế bào động vật 2. Cơng nghệ nhân bản động vật 3. Cơng nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Cơng nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dịng 6. Chẩn đốn phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng Nội dung 69 70  Mỗi sinh vật hưa một số trình tự DNA duy nhất, đặc trưng cho lồi  Chẩn đốn phân tử giúp cho việc phát hiện được các trình tự DNA đặc hiệu cho lồi này. Mark er Tên đầy đủ RFLP ALP AFLP RAPD DAF SSR AP-PCR SSCP MRDH- DNA SNP Restriction fragment length polymorphism (Sự đa hình các đoạn do cắt bởi RE) Amplicon length polymorphism (Sự đa hình đoạn khuếch đại) Amplified fragment length polymorphism (Sự đa hình các đoạn khuếch đại) Random amplified polymorphic DNA (Sự đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên) DNA amplification fingerprinting (In dấu di truyền khuếch đại DNA) Simple sequence repeat (microsatellite) (Lặp đoạn đơn) Arbitrary primer-PCR (PCR mồi tùy chọn) Single strand conformation polymorphism (Sự đa dạng cấu hình mạch đơn) Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite) (DNA lặp lại trung bình, phân tán và biến dị cao) Single nucleotide polymorphism (Sự đa hình đơn nucleotide)  – Lai phân tử nucleic acid : Nhằm xác định sự hiện diện của trình tự nucleotide đặc hiệu của một đoạn gen hay DNA.  – PCR : Dùng primer (mồi) đặc hiệu để khuếch đại số lượng 1 đoạn gen.  – RFLP (Restriction fragment length polymorphism) : Dựa vào vệt trên bản điện di do các đoạn DNA di chuyển tạo ra. Chẩn đoán phân tử gồm các kĩ thuật chủ yếu : Ứng dụng PCR trong chẩn đốn bệnh (HIV) Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong chẩn đốn bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong chẩn đốn bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong gi¸m ®Þnh h×nh sù Một số ví dụ Một số ví dụ 1. Kỹ thuật nuơi cấy tế bào động vật 2. Cơng nghệ nhân bản động vật 3. Cơng nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Cơng nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dịng 6. Chẩn đốn phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng Nội dung  Khởi động năm 1988, nhận tài trợ 3 tỷ $ năm 1990 từ US Department of Energy.  Mục tiêu chính là giải trình tự tồn bộ hệ gen của người trong 15 năm, kết thúc vào 2005  Năm 2003: hồn tất việc giải mã.  Cĩ thơng tin đầy đủ cho mỗi NST  Danh sách đầy đủ các gen trên mỗi NST a) Xây dựng bản đồ hệ gen người cĩ độ phân giải cao b) Xây dựng bản đồ vật lý của tất cả các nhiễm sắc thể của người và một số sinh vật model điẻn hình khác c) Phát triển năng lực thu thập, dự trữ, phân phát và phân tích các dữ liệu thu dược d) Sáng tạo các cơng nghệ phù hợp để đạt được các mục tiêu trên e) Vạch ra những vấn đề đạo đức, luật pháp và xã hội (the ethical, legal, and social issues - ELSI) có thể nảy sinh từ dự án.  Public ◦ Human Genome Project ◦ Academic Laboratories (from around the world) ◦ Most contributions from 6 laboratories (US, UK, Japan) • Commerial/private • Celera Genomics • Rockville, MD • J Craig Venter Nature Vol 409, 15 February 2001 Science Vol 291, 16 February 2001  Nhóm nghiên cứu chủ yếu là ở NIH (Hoa Kỳ) phối hợp với các nước Anh, Pháp, Đức, Trung Quốc và Nhật Bản gọi là nhóm Consortium (Liên hiệp các phòng thí nghiệm) và sau này F.Collins chủ trì. Tất cả có 18 cơ quan khoa học lớn trên toàn thế giới trực tiếp tham gia dự án.  James Watson, người phát minh mô hình chuỗi xoắn kép DNA Watson- Crick năm 1953, là người chủ trì đầu tiên của chương trình ở các Viện sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ NIH (National Institutes of Health) đến năm 1992 từ chức. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Mơn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 84  Nhóm thứ hai Celera Genomics do Craig Venter chủ trì, ra đời chậm hơn nhưng đạt kết quả nhanh với chi phí thấp. Năm 1967, Craig Venter làm y tá quân y ở Việt Nam, trở về Hoa Kỳ ông thấy cần sống gấp. Năm 1998, nhờ công ty Applied Biosystems và số vốn 300 triệu đô-la (USD) ông lập công ty tư Celera Genomics (Celera nghĩa là tăng tốc).  – Ngày 26/6/2000 : Công bố bản thảo hành động (working draft) của nguyên bộ gen người (> 90% với số base phân tích gấp 3 – 4 lần bộ gen).  – Tháng 2/2001 : Các phân tích của bản thảo hành động được công bố.  – Ngày 14/4/2003 : Dự án bộ gen người hoàn thành và tuyên bố kết thúc sớm 2 năm ở Hội nghị khoa học của NIH kỉ niệm 50 năm chuỗi xoắn kép DNA.  Việc lập bản đồ (mapping) cuối cùng cẩn trọng hơn gấp 300 lần so với công bố năm 2000, các lỗ trống (400 gaps) được lấp kín và các nhà khoa học Mĩ chỉ tiêu tốn 2,7 tỉ USD. Đây là sự kiện trọng đại như ý kiến của các nhà khoa học : “Đây là ngày chúng ta hoàn tất lần xuất bản đầu tiên “Cuốn sách của sự sống (the Book of Life).” hay “Trong nhiều thế kỉ tới, ngày hôm nay sẽ được nhớ đến như một cột mốc lịch sử”.  Các đột phá kĩ thuật góp phần hoàn thành dự án có giá trị to lớn trong tất cả các lĩnh vực sinh học.  Năm 2000, Chương trình bộ gen người đã đạt những kết quả ngoạn mục, Tổng thống Hoa Kỳ Bill Clinton đã trực tiếp giàn xếp để đại diện nhóm “Consortium” là Francis Collins và Craig Venter hợp tác nhau công bố kết quả.  Ngày 26/6/2000, dưới sự chủ trì của Tổng thống Hoa Kỳ Bill Clinton và Thủ tướng Anh Tony Blair, Fr. Collins và C.Venter lần đầu tiên công bố về giải trình tự bộ gen người gần xong (99%). Thành tựu này là một kì công vĩ đại của loài người. Do những kết quả công bố đầu tiên này còn hàng trăm lỗ trống (gaps) và nhiều sai sót nên nó được gọi là bản phát thảo (the Draft), nhưng nó sẽ giúp định hướng khai thác nên còn gọi là bản phát thảo hành động (the Working Draft). Tháng 2/2001 hai nhóm công bố những kết quả phân tích chi tiết hơn các số liệu :  – Nhóm Venter xác định chắc chắn 26.588 gen mã hóa protein và 12.000 gen khác.  – Nhóm Consortium cho rằng số gen khoảng 30.000 đến 40.000.  – Venter cho rằng có 300 gen của người không tìm thấy tương tự ở chuột.  – Nhóm Consortium xác định được 113 gen của vi khuẩn gắn vào bộ gen người, không phải do thừa kế trong tiến hóa.  Điều đáng kinh ngạc là số gen người khoảng 35.000, ít hơn rất nhiều so với dự kiến trước đây là 50.000 ĐẾN 140.000 gen, và nó chỉ khoảng gấp 2 lần nhiều hơn số gen của tuyến trùng Caenorhabditis elegans (19.099 gen).  Tuy số lượng gen cần chỉnh lý lại, từ phát hiện khiêm tốn và gợi tò mò này, các nhà khoa học cho rằng chìa khóa di truyền cho sự phức tạp của con người không do số lượng gen, mà ở chỗ các phần của gen được sử dụng như thế nào để tạo nên các sản phẩm khác nhau trong ghép nối các phần của gen theo lựa chọn (Alternative Splicing). Sự phức tạp được gia tăng từ nhiều nguồn khác là hàng nghìn biến đổi hóa học sau dịch mã (Post- translational chemical modification) tác động đến các protein và chương trình của các cơ chế điều hòa kiểm soát các quá trình đó.  Để xây dựng bản phát thảo hành động, 16 Trung tâm giải ký tự chuỗi đã phân tích hơn 22,1 tỷ base của trình tự khởi đầu, gồm các đoạn trùng lắp tổng cộng 3,9 tỷ base và cung cấp 7 lần phủ kín bộ gen người (có thể hiểu là giải ký tự chuỗi gấp 7 lần bộ gen người). Hơn 30% đạt chất lượng cao, là những trình tự cho kết quả cuối cùng, với độ phủ kín 8 đến 10 lần, độ cẩn trọng 99,99% và một số chỗ trống. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Mơn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 96 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Mơn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 97 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Mơn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 98 Thời đại sau bộ gen (PostGenomics Era) đã bắt đầu với các dấu hiệu : – Sử dụng các công cụ và công nghệ để khai thác bộ gen người. – Sinh học phát triển ở mức cao hơn như Sinh học các hệ thống (the Systems Biology). – Sự phát triển hàng loạt các công nghệ then chốt (key tehnologies) mới như Tinsinh học (Bioinformatics), Biochip và microarrays, Công nghệ sinh học nano (Nanobiotechnology),  – Cellomics : nghiên cứu chức năng tế bào và tác động của thuốc ở cấp độ tế bào nhờ sự gắn kết với công nghệ thông tin (IT). Sử dụng các thuật toán (algorithm) để phân tích tự động hóa hình thái học của các tế bào sẽ cung cấp các kết quả định lượng giúp cho tầm soát dung lượng cao (high content screening).  Metabolomis : công nghệ gen điều khiển trao đổi chất. .  Ionomics : các gen chi phối sự điều hòa tất cả các ion trong tế bào.  Từ năm 1999, sự phát triển của Genomics và Proteomics dẫn đến Công nghệ microarray (Microarray technology) và đến năm 2002 sản phẩm đầu tiên có mặt trên thị trường. Xuất phát từ nhu cầu thực tế chẩn đoán, các hãng dược phẩm cũng như các trung tâm nghiên cứu lớn đã cho ra đời nhiều sản phẩm dùng cho phát hiện nhanh (như xác định SNP) có thể ở dạng chip (bọ điện tử), dạng bi (bead) có từ tính (hình 4.9) hay các microarray (hình 4.10) và có thể ở nhiều dạng khác hoặc là sự kết hợp của các dạng trên. Tựu chung, nhằm tạo thuận lợi nhất cho chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác các SNP đang quan tâm. Hình 4.9. Các viên bi có gắn mẫu dò lai với RNA/DNA mục tiêu Hình 4.10. Microarray với các dãy chấm, phía trên là chùm tia sáng của đầu dò (detector) khuếch đại các đốm sáng để đọc kết quả

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfnguyenthiphuongthaocnsh_trong_dv_nguoi_y_sinh_ii_6836.pdf
Tài liệu liên quan