Bài giảng Vệ sinh an toàn thực phẩm - Chương 3: Ngộ độc thực phẩm do tác nhân sinh học - Lưu Huyền Trang

ao đổi chất, môi trường cho phản ứng sinh hóa.. • Nước sử dụng pha môi trường là nước cất hoặc khử ion có pH 7 • pH 6,5 3.1.2. Agar (thạch) • Thạch (agar) là tác nhân gây đông đặc để tạo môi trường rắn nuôi cấy vi sinh vật. • Ưu điểm cơ bản của thạch là rất nhiều loài vi sinh vật không sử dụng thạch làm cơ chất dinh dưỡng. 1.2.1. Agar • Nồng độ thích hợp để làm rắn môi trường thường là 1 – 2%. • Thạch nóng chảy ở 850C và đông đặc ở 32-400C. 3.1.3. Peptone • Peptone là sản phẩm phân giải trung gian của protein, dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng. • Peptone trypticase là sản phẩm phân giải casein bằng pancreatin • Phytone (hay peptone papainic từ bột đậu nành) • Peptone thịt: sản phẩm phân giải thịt bằng pepsin. 3.1.4. Cao thịt (Meat extract) • Được chế từ thịt loại bỏ gân, mỡ và xử lý sơ bộ bằng các enzym trước khi ly trích và cô đặc. Đây là thành phần dinh dưỡng cực tốt. 3.1.5. Cao nấm men (Yeast extract) • Cao nấm men được điều chế bằng cách đông khô dung dịch ly trích từ nấm men đã qua quá trình tự phân. • Cao nấm men rất giàu các loại vitamin, tạo điều kiện phát triển tốt cho nhiều loại vi sinh vật (thường bổ sung với lượng 3g/l). 3.1.6. Một số tác nhân tạo môi trường kỵ khí 3.1.6.1. Bột gan (liver extract powder/ broth) • Được chế bằng cách làm khô và nghiền nhỏ gan bò tươi. • Do chất lượng dinh dưỡng cao và đặc biệt là hệ thống oxy hóa khử tự nhiên vốn có trong gan được duy trì tốt trong quá trình chế biến, dung dịch dinh dưỡng từ bột gan rất thích hợp để nuôi các vi sinh vật kỵ khí. 3.1.6.2. Các tác nhân tạo môi trường kị khí khác • Sodium thioglycolate, sodium formaldehyde sulfoxylate, cystein: chứa lưu huỳnh (nguyên tố có khả nĕng nhận điện tử thay thế oxy, tạo nên điều kiện kỵ khí trong môi trường). 3.1.6.2. Các tác nhân tạo môi trường kị khí khác • Môi trường kỵ khí dạng đông khô: ▫ Bổ sung chất có khả năng gắn kết với oxy như hemin - muối cloride của heme (ion protoporphyrin có trong thành phần của nhiều enzym oxy hóa khử như cytochrome hoặc hemoglobine), những chất đồng thời có khả năng kích thích sự phát triển của vi sinh vật kỵ khí. 3.1.7. Các chế phẩm từ mật bò • Các chế phẩm từ mật bò thường được dùng làm môi trường chọn lọc hoặc phân lập do khả nĕng kích thích sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột và ức chế các vi khuẩn gram dương. • Tính nĕng cơ bản của mật bò là làm giảm sức cĕng bề mặt tại vùng tiếp xúc giữa màng và môi trường, kích thích men autolysin nội bào dẫn đến sự phân giải màng tế bào. Mật bò • Mật bò (ox bile): được chế tạo từ mật bò tươi qua làm sạch và đông khô. Một gam mật bò khô tương đương với 10-12 gam mật tươi. Nồng độ mật bò thường dùng trong môi trường là 10 – 20 g/l. Mật bò • Hỗn hợp muối mật (Bile salts): là hỗn hợp muối Na của các acid có trong mật bò (cholic, taurocholic, desoxycholic) tác dụng giống như mật bò nhưng hoạt tính cao hơn và được dùng với nồng độ thấp hơn. Trong đó desoxycholate và taurocholate là 2 hợp chất có khả nĕng phân giải màng mạnh nhất. Mật bò • Sodium desoxycholate: là chế phẩm muối mật được dùng nhiều trong môi trường chọn lọc hoặc phân lập vi khuẩn đường ruột, gram âm. • Một số chất khác có tác dụng giảm sức cĕng bề mặt gây phân giải màng tế bào nhưng kém đặc hiệu hơn như Sodium Lauryl Sulphate, Sodium Dodecyl sulfate. 3.1.8. Các chất ức chế chọn lọc • Azide và sulfite ức chế các trực khuẩn gram âm trong môi trường chọn lọc Streptococcii. • Lauryl sulphate ức chế phần lớn vi khuẩn tạp nhiễm trong môi trường canh lauryl sulfate dùng tĕng sinh chọn lọc và chẩn đoán sơ bộ Coliforms. 3.1.9. Các cơ chất để thử phản ứng sinh hóa • Các vi sinh vật sẽ tạo ra enzym phân giải hoặc biến đổi những chất trong môi trường thành chất mới, các chất mới được nhận diện bằng thuốc thử hoặc những chất chỉ thị màu thích hợp. • Những cơ chất thường dùng là các loại đường hoặc rượu như lactose, glucose, saccharose, fructose, maltose, arabinose, xylose, galactose, raffinose, melibiose, glycerine, mannitol, sorbitol, adonitol, với nồng độ khoảng 0,5 – 1%. 3.1.9. Các cơ chất để thử phản ứng sinh hóa 3.1.10. Các chất chỉ thị màu • Những chất chỉ thị pH thường dùng như Bromothymol blue, Bromocresol, Neutral red và đặc biệt là phenol red. • Phenol red sẽ đổi màu từ đỏ sang vàng khi vi sinh vật có khả nĕng phân giải đường sinh acid làm pH giảm. 3.1.10. Các chất chỉ thị màu • Sự thay đổi oxi trong môi trường được đánh giá bằng chất chỉ thị rH • Khi thế oxy hóa của môi trường tăng (lượng oxi trong môi trường nhiều hơn) thì ▫ sodium resazurin chuyển từ vàng sang đỏ, ▫ methylen blue chuyển từ không màu sang màu xanh lam. 3.2. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật • Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm, môi trường cần cho sự tĕng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật. 3.2.1. Phân loại môi trường theo thành phần • Môi trường tự nhiên • Môi trường tổng hợp • Môi trường bán tổng hợp Môi trường rắn: có chứa agar hoặc gelatin Môi trường lỏng Môi trường bán rắn/xóp 3.2.2. Phân loại theo trạng thái vật lý 3.2.3.Phân loại môi trường theo công dụng ▫ Môi trường tiền tĕng sinh ▫ Môi trường tĕng sinh ▫ Môi trường chọn lọc ▫ Môi trường phân biệt ▫ Môi trường chọn lọc – phân biệt ▫ Môi trường thử nghiệm sinh hóa Vi khuẩn gram dương trên môi trường chọn lọc CAN (Colistan Nalidixic Acid Agar ) S. epidermidis và S. aureus trên môi trường chọn lọc – phân biệt Mannitol Salt Agar (MSA) Môi trường kiểm tra khả nĕng sinh Indol Môi trường kiểm tra khả nĕng lên men Dextrose (Glucose) PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG • Môi trường tự pha chế ▫ Cân, đong thành phần ▫ Hòa tan, bổ sung agar (môi trường rắn) ▫ Lọc ▫ Điều chỉnh pH ▫ Phân phối vào dụng cụ đựng ▫ Hấp khử trùng • Môi trường đông khô: được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh ▫ Cân lượng môi trường ▫ Bổ sung nước, hòa tan ▫ Phân phối vào bình chứa ▫ Hấp khử trùng Thông thường môi trường được pha chế có giá trị pH thích hợp, không cần phải hiệu chỉnh pH sau khi được pha chế. Bảo quản môi trường đông khô • Môi trường đông khô cần được bảo quản nơi khô, tối, nhiệt độ trung bình 15 – 250C, nắp phải được đậy kín để tránh hơi nước xâm nhập. Hơi nước xâm nhập sẽ làm môi trường vón cục và làm thay đổi pH. 3.3.3. Bảo quản môi trường đã pha chế • Môi trường đã pha xong có thể bảo quản chúng vài tháng trong những điều kiện thích hợp. • Môi trường đã pha xong cần được giữ trong điều kiện lạnh 1 – 60C. • Một số môi trường như môi trường có chứa mật bò nên bảo quản 10 – 150C. • Môi trường thạch không được giữ dưới 00C vì cấu trúc gel bị phá hủy. 3.3.4. Khử trùng vật liệu sau khi nuôi cấy • Môi trường sau khi nuôi cấy vi sinh vật và các vật liệu bị nhiễm cần được khử trùng loại bỏ. Đối với các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần, có thể khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Phương pháp định lượng vi sinh vật Phương pháp định lượng vi sinh vật là gì ? • Là các phương pháp để xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu. • Trả lời cho câu hỏi: “Hàm lượng vi sinh vật trong mẫu là bao nhiêu ?” • Đơn vị tính: tế bào/ml tế bào/g CFU/ml CFU/g MPN/ml MPN/g Các phương pháp định lượng vi sinh vật 1.Phương pháp đếm trực tiếp 2.Phương pháp đếm khuẩn lạc 3.Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc 4.Phương pháp đo độ đục 5.Phương pháp MPN (most probable number) 6.Phương pháp đo ATP 4.1. Phương pháp đếm trực tiếp • Mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo có thể được xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 3-4 tế bào Cách đếm tế bào trong buồng đếm Ưu điểm và nhược điểm Ưu điểm: nhanh cho biết được số lượng vi sinh vật Nhược điểm: dễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp Khắc phục nhược điểm của pp đếm trực tiếp ???? 4.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc Ưu điểm: Cho phép xác định số tế bào sống Định lượng chọn lọc vi sinh vật 4.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp: - Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu - Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu - Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu - Đếm số khuẩn lạc hình thành Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu Các dung dịch pha loãng mẫu • Buffered peptone water (BPW)  Saline peptone water (SPW) NaCl 5g Peptone 1g Nước cất vừa đủ 1 lít NaCl 5g Peptone 10g Disodium phosphate 3.5g Potassium dihydrogen phosphate 1.5g Nước cất vừa đủ 1 lít Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng: 10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 10-1 Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng mẫu lỏng Cấy mẫu vào môi trường -Phương pháp cấy bề mặt/cáy trải - Phương pháp đổ đĩa Phương pháp đổ đĩa • Chuẩn bị đĩa petri vô trùng • Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt • Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp) • Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều • Để nguội môi trường • Đem ủ Phương pháp đổ đĩa Ưu điểm Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml) Xác định được các vi sinh vật cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía Cho phép đếm được mật độ vi sinh vật cao, khoảng 25-250 khuẩn lạc ▫ Nhược điểm ▫ Không định lượng được những vi sinh vật quá nhạy nhiệt ▫ Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định ▫ Khó làm thuần một dòng vi sinh vật Phương pháp đổ đĩa Phương pháp trải đĩa • Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1- 2 ngày để khô mặt • Phương pháp - Cấy 0,1 ml vào đĩa môi trường - Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác - Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt Ưu điểm - Định lượng được các vi sinh vật nhạy nhiệt - Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng - Dễ dàng làm thuần chủng vi sinh vật mục tiêu Nhược điểm - Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ - Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp Phương pháp trải đĩa Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự động Đếm khuẩn lạc • Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường • Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25-250 • Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm • Tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu) Phương pháp màng lọc • Kích thước lỗ lọc 0,47µm hay 0,22µm • Đường kính và hình dạng màng lọc phụ thuô ̣c vào đường kính phễu lọc • Đường kính màng thường là 45mm Thiết bị lọc nhiều phễu Các bộ phận của thiết bị lọc vi sinh vật Phương pháp lọc vi sinh vật • Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc • Mật độ vi sinh vật trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn lạc/màng • Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100ml • Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dung dịch pha loãng hay nước cất vô trùng Phương pháp màng lọc • Ưu điểm ▫ Xác định được mật độ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml • Nhược điểm ▫ Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn hoa ̣c có độ nhớt cao Khuẩn lạc vi sinh vật mọc trên màng 1A 1B 1C 1D . 2A 2B 2C 2C E. coli trên môi trường Coli ID agar Coliforms trên môi trường Coli ID agar PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRI-FILM • Ưu điểm: ▫ Cải biên từ phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa ▫ Thích hợp cho việc phân tích mẫu tại hiện trường ▫ Không phải bảo quản hay vận chuyển mẫu • Nhược điểm ▫ Chỉ áp dụng hạn chế ở một số chỉ tiêu dễ nuôi cấy ▫ Chỉ cấy được thể tích mẫu nhỏ PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRI FILM Ñaët maãu leân maøng Petrifilm Daøn ñeàu maãu treân maøng UÛ Petrifilm, ñeám tröïc tieáp hoaëc phaân laäp Phương pha ́p đo độ đu ̣c Phương pha ́p đo độ đu ̣c Phương pha ́p đo độ đu ̣c • Ñoä ñuïc cuûa huyeàn phuø tyû leä thuaän vôùi soá löôïng teá baøo vi sinh vaät coù trong moâi tröôøng. Trong moät giôùi haïn nhaát ñònh, moái quan heä giöõa soá löôïng vi sinh vaät trong moâi tröôøng tyû leä tuyeán tính vôùi ñoä ñuïc cuûa moâi tröôøng.  Do ñoù coù theå ñònh löôïng vi sinh vaät trong moâi tröôøng baèng maùy ño ñoä ñuïc hay maùy so maøu ôû böôùc soùng 550 – 610nm. • Trong phöông phaùp naøy caàn xaây döïng bieåu ñoà töông quan tuyeán tính giöõa ñoä ñuïc vaø soá löôïng vi sinh vaät coù trong moâi tröôøng baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc tröïc tieáp, hoặc quy ra khối lươṇg sinh khối vsv (g/L, d.b.) Phöông phaùp tieán haønh: • - Pha loaõng huyeàn phuø chöùa vi sinh vaät caàn kieåm nghieäm sao cho caùc dung dòch thu ñöôïc khi ño treân maùy so maøu ôû böôùc soùng 610nm ñöôïc caùc trò soá OD gaàn 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. • - Duøng phöông phaùp ñeám tröïc tieáp xaùc ñònh löôïng teá baøo vi sinh vaät coù trong 1ml kyù hieäu N/ml. - Tính giaù trò log (N/ml) cho töøng möùc noàng ñoä pha loaõng. Veõ ñoà thò bieåu dieãn log (N/ml) theo caùc giaù trò OD. Xaùc ñònh khoaûng tuyeán tính giöõa log (N/ml) vôùi OD. • * Tính maät ñoä: - Töø trò soá OD ño ñöôïc ñoái chieáu treân ñoà thò töông quan giöõa maät ñoä teá baøo vaø OD ñeå xaùc ñònh löôïng teá baøo coù trong maãu nghieân cöùu. • Phương pha ́p đo độ đu ̣c  Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần (3 – 10 lần) ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN (Most Probable Number) ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN • Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính. • Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu. • Hai hệ thống MPN - Hệ thống 9 ống - Hệ thống 15 ống • Đặc điểm - Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như Sự tạo hơi: Coliforms Sự đổi màu: S. aureus - Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN Hệ thống MPN Hệ thống 9 ống 10ml môi trường Hệ thống 15 ống ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 1 - Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tĕng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-1 1ml 10-2 1ml 10-3 1ml 2 - Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3 – Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4 – Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vi sinh vật cần kiểm định Sự đổi màu của môi trường 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 5 – Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng 5 2 1 + + + + + + + + 5 – Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ vi sinh vật 5 2 1 Tra bảng Số vi sinh vật: 70 MPN/g Kết quả ĐỊNH LƯỢNG vi sinh vật BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml 5 2 1 Tra Bảng Số vi sinh vật: 70 MPN/ml ? PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP NỘI BÀO PP pha ́t quang ATP  Lượng ATP trong tế bào ở vi sinh vật khoảng 0,3 fg/tế bào (1 femtogram = 10-15 g). Như vậy về mặt nguyên tắc có thể định lượng vi sinh vật thông qua đo ATP.  ATP chủ yếu hiện diện ở tế bào VSV sống  Định lượng VSV thông qua số lượng ATP của VSV trong mẫu  Số lượng ATP phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng trạng thái tế bào PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP NỘI BÀO PP pha ́t quang ATP  Một trong những phương pháp đơn giản nhất để đo ATP là sử dụng hệ thống luciferin – luciferase như ở đom đóm.  Khi có ATP, luciferase sẽ oxy hóa luciferin thành oxyluciferin đòng thời tạo năng lượng điê ̣n từ  phát quang  ánh sáng phát ra sẽ được đo bằng quang kế hoặc bằng quang phố kế nhấp nháy lỏng.  Lượng ánh sáng phát ra sẽ tỷ lệ thuận với lượng ATP có trong mẫu.  Máy đo ATP được dùng để đánh giá vệ sinh bề mặt đã được sản xuất và bán dưới dạng thương phẩm. PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP NỘI BÀO PP pha ́t quang ATP • Nguyên tắc:  E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + PPi (1)  E – LH2 AMP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (2) Phản ứng trên có thể viết lại như sau: E + LH2 + ATP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +Ppi E: luciferase LH2: luciferin Anh sáng phát ra có bước sóng 562nm, có màu vàng. Mg2+ PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP NỘI BÀO PP pha ́t quang ATP • Ưu điểm • Cho phép định lượng được tổng số vsv trong mẫu • Cho kết quả định lượng nhanh • Thích hợp cho việc giám sát vệ sinh trên dây chuyền sản xuất PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP NỘI BÀO PP pha ́t quang ATP • Nhược điểm • Không phân biệt được ATP của VSV và của mẫu • Không phân biệt được các dòng, loài hay nhóm VSV khác nhau • Cần thiết bị tinh vi, có độ nhạy và độ chính xác cao • Các hoá chất khó bảo quản, nhạy cảm với ánh sáng PP pha ́t quang ATP Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng • Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh vi sinh vật. • Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình và các phản ứng sinh hóa. • Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh vi sinh vật: ▫ Cách truyền thống ▫ Sử dụng các bộ KIT ▫ Sử dụng các thiết bị tự động Thử nghiệm khả năng lên men • Mục đích: thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbohydrates của các vi sinh vật • Nguyên tắc: vi sinh vật sử dụng glucide  tạo acid  giảm pH môi trường • Các loại carbohydrates ▫ Monosaccharides: glucose, xylose, rhamnose ▫ Disaccharidês: sucrosê, lactosê ▫ Polysaccharides: tinh bột, cellulose ▫ Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO ▫ Các loại rượu: chứa chức -OH Phenol Red Carbohydrate Broth Peptone 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 0,018g Carbohydrate* 1 g Hấp ở 115oC trong 15 phút Thử nghiệm khả năng lên mên • Môi trường: Phenol red broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm • Vi sinh vật sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenol red • Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng • Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ Thử nghiệm khả năng lên mên Thử nghiệm Citrate • Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất. • Cơ sở sinh hóa: ▫ vi sinh vật sử dụng muối amonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT Môi trường Simmons citrate agar Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 13g Thử nghiệm Citrate • Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ (vì sao?) - Có đối chứng trắng đi kèm Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính Thử nghiệm Citrate Thử nghiệm Urease • Mục đích: phát hiện vi sinh vật có mang enzyme urease • Cơ sở sinh hoá: (NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2  tăng pH môi trường  phenol red (vàng – đỏ) • Môi trường sử dụng: ▫ Urea Broth (Rustigian – Stuart) ▫ Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) Môi trường Urea Broth Urea 20g Cao nấm men 0,1g Na2HPO4 9,5g K2HPO4 9,1g Phenol red 0,01g Nước cất 1 lít Thử nghiệm Urease • Thực hiện ▫ Chuẩn bị môi trường ▫ Cấy vi sinh vật vào 5ml môi trường ▫ ủ 37oC/24 giờ ▫ Quan sát Thử nghiệm Urease Thử nghiệm khả nĕng sinh H2S • Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S từ sự phân giải các a.a chứa S • Cơ sở sinh hóa: Acid amin chứa S H2S Thiosulfate H2S  H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đên (FeS, PbS) • Cơ chất: peptone, cystein, methionine, thiosulfate • Chỉ thi ̣: fêrric ammonium citratê, lêad acêtatê, desulfohydrase thiosulfate reductase • Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus • Môi trường sử dụng: ▫ KIA (Kligler Iron Agar , TSI (triple sugar iron agar) (thạch nghiêng) ▫ SIM (sulfide indole motility), PIA (peptone iron agar) (thạch sâu) ▫ BSA (Bismuth sulfide agar) (thạch đĩa) Cấy vi sinh vật lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h) Thử nghiệm khả nĕng sinh H2S • Đọc kết quả: Xuất hiện màu đên trong môi trường Không xuất hiện màu đên trong môi trường (+) (-) (+) ĐC Thử nghiệm khả nĕng sinh H2S (+) (+) (-) Pancreatic digest of casein (casitone) 20.0 g Peptic digest of animal tissue (beef extract) 6.1 g Ferrous ammonium sulfate 0.2 g Sodium thiosulfate 0.2 g Agar 3.5 g Thử nghiệm khả nĕng sinh H2S Thử nghiệm khả năng sinh Indole • Mục đích Phát hiện các vi sinh vật có khả nĕng sinh indol  các vi sinh vật có hệ emzyme tryptophanase Chủng vsv MT canh tryptone Thuốc thử Kovacs’ (p- dimethylaminobenzaldehyde) Pứ dương tính Pứ âm tính 37oC / 24h • Là phản ứng giúp phân biệt ▫ E. coli (+) với Klebsiella (-) ▫ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) ▫ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) • Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens • Môi trường: Peptone broth, tryptone broth • Thuóc thử: Kovacs’, Ehrlich’s Thử nghiệm khả năng sinh Indole • Chủ yếu dùng nha ̣n biết các thành viên của nhóm Enterobacteriaceae (enterics): catalase (+), gram (-), tát cả đều lên men glucose tạo acid • 3 dạng lên men trên KIA: ▫ Chỉ lên men glucose ▫ Lên men glucose và lactose ▫ Không thê ̉ lên men cả glucose và lactose • Đọc kết quả sau 18-24h nuôi cáy Thử nghiệm KIA/TSI Thử nghiệm KIA/TSI • Mục đích: phát hiện khả năng ▫ sử dụng các nguồn carbohydrates ▫ sinh H2S ▫ Sinh hơi (CO2/ H2) Ủ 37oC/18-24 giờ Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / H2S Phản ứng KIA TSI Alk/A (đỏ/vàng) Chỉ lm glucose sd peptone Chỉ lên men glucose Sử dụng peptone A/A (vàng/vàng) Lên men glucose Lên men lactose Lên men glucose Lên men lactose va ̀/hoa ̣c sucrose Alk/Alk (đỏ/đỏ) Ko lên men cả glucose va ̀ lactose, sd. peptone Ko lên men cả 3 loại đường, Sử dụng peptone • KIA: Kliglêr’s iron agar Peptone 20g Lactose 10g Glucose 1g NaCl 5g Ferric ammonium citrate 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2 Thử nghiệm KIA/TSI • TSI: Triple sugar iron agar Peptone 20g Lactose 10g Sucrose 10g Glucose 1g NaCl 5g Ferric ammonium sulphate 0,2g Sodium thiosulphate 0,2g Agar 13g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2 Thử nghiệm KIA/TSI • Chỉ thị: phenol red ▫ Kiềm: đỏ ▫ Acid: vàng ▫ Mt chưa cáy: cam đỏ • Đổ môi trường vào óng dạng nghiêng sâu • Cáy bàng que cáy thảng (đâm sâu) • Ủ 35-370 C, 18-24h, không sớm hay muo ̣n hơn Thử nghiệm KIA/TSI Thử nghiệm KIA/TSI 1 2 3 4 5 6 7 8 10 9 11 ĐC Thử nghiệm MR (Methyl red) • Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền từ quá trình lên men glucose. • Cơ sở sinh hóa: ▫ Chất chỉ thị pH: methyl red ▫ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid ▫ MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính  Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC, không sớm hơn 24h. dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0 • Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth/Clark-Lubs) ▫ Glucose 5g/L ▫ Peptone 7g/L ▫ K2 HPO4 5g/L ▫ Nước cát đủ 1L Chủng vsv ủ 2 – 5 ngày 37oC Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC MR-VP broth Thử nghiệm MR (Methyl red) Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Mục đích: Phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm cuói trung tính (acetoin) từ quá trình lên men glucose • Cơ sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. 2 pyruvate acetoin + 2 CO2 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Môi trường sử dụng: MR-VP • Thuóc thử: ▫ 5% a-naphthol in abs. ethyl acohol ▫ 40% KOH • Phương pháp tiến hành: ▫ Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP ▫ Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC ▫ Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ ▫ Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng (+) : Enterobacter cloacea (-) : E. coli • Đọc kết quả: (+): màu đỏ trên môi trường (-): môi trường không đổi màu (+) (-) Thử nghiệm Bile Esculin • Mục đích: Xác định khả năng thủy giải glycoside esculine thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. • Cơ sở sinh hoá: ▫ Esculin là hợp chất nhân tạo ▫ Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đên Môi trường Bile Esculine Agar Beef extract 3g Peptone 5g Esculin 1g Mật bò (Oxgall) 40g Ferric citrate 0,5g Agar 15g Nước cất 1 lít Glucose Esculetine Phân tử Esculine Thử nghiệm Bile Esculin Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả Bile esculin (+) Thử nghiệm Malonate • Mục đích Phát hiện các vi sinh vật có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất • Cơ sở sinh hoá Malonate là chất cạnh tranh với succinate Khi vi sinh vật phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường • Môi trường sử dụng: • Malonate broth • Thuóc thử: bromothymol blue ▫ Dương tính: MT chuyển màu xanh da trời ▫ Âm tính: MT không đổi màu và không tạo sinh khối (+) (-) ĐC pH 7,6 Thử nghiệm Malonate Thử nghiệm catalase • Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase. • Cơ sở sinh hoá: ▫ Catalase hiện diện ở các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý ▫ H2O2 H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide) catalase • Thực hiện ▫ Vi sinh vật lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn) ▫ Đặt vi sinh vật lên lam kính sạch ▫ Nhỏ H2O2 30% ▫ Quan sát sau 1-2 giây  Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện  Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện Thử nghiệm catalase Thử nghiệm catalase Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30% Thử nghiệm catalase Thử nghiệm decarboxylase • Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin Cấu trúc của phân tử Amino acid • 3 thử nghiệm quan trọng ▫ Lysine decarboxylase (LDC) ▫ Ornithine decarboxylase (ODC) ▫ Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH) Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng Thử nghiệm decarboxylase • Cơ sở sinh hoá ▫ Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi màu chất chỉ thị • Môi trường sử dụng: ▫ Decarboxylase Basal Medium ▫ Chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8) pH 6,8 Thử nghiệm decarboxylase Bromocresol purple • Biểu hiện sinh hoá Dương tính: pH môi trường tĕng Âm tính: pH giảm MT trước khi cấy Pứ dương tính Pứ âm tính Thử nghiệm decarboxylase • Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương nhờ enzyme coagulase • Chuyên dùng để phân biê ̣t các loài trong gióng Staphylococcus • Chủng đối chứng (+): S. aureus (-): S. epidermidis • Thử nghiệm tiến hành với huyết tương và fibrinogen. Thử nghiệm Coagulase Thử nghiệm bằng 2 cách: Thử trên phiến kính Đọc kết quả Giọt nước Sinh khối vsv Huyết tương người + + Thử nghiệm trong ống nghiệm: 0,5ml huyết tương 0,5ml huyết dịch sinh khối Ủ và đọc kết quả mỗi 30 phút Thử nghiệm Coagulase Kết quả thử nghiệm Coagulase (+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương (-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất Thử nghiệm Coagulase • Mục đích: thử nghiệm khả nĕng phân giải gelatine bởi gelatinase. • Cơ sở sinh hóa: Gelatine polypeptide + acid amin Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc Vi sinh vật phân hủy gelatine môi trường lỏng gelatinase Thử nghiệm gelatinase Thử nghiệm gelatinase • Đối chứng: ▫ (+): Aeromonas hydrophila ▫ (-): E. coli • Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine • Dạng ống nghiệm thạch sâu • Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng. • Đọc kết quả (+) môi trường tan chảy (-) môi trường không tan chảy Thử nghiệm gelatinase TN KHẢ NĔNG LÊN MEN – ÔXI HÓA • Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau • Cơ sở sinh hóa: ▫ Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao ▫ Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí • Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media) • Chỉ thị pH: bromocresol purple pH 6,8 TN KHẢ NĔNG LÊN MEN – ÔXI HÓA Trực khuẩn gram âm O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa F (fermentation) Serratia marcescens Cầu khuẩn gram dương O (oxidation) Micrococcus luteus F (fermentation) Staphylococcus aureus TN KHẢ NĔNG LÊN MEN – ÔXI HÓA • Đọc kết quả: A: đối chứng B: phản ứng OXH C: phản ứng lên men TN KHẢ NĔNG LÊN MEN – ÔXI HÓA Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) • Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate • Cơ sở sinh hóa: 3 2 3 2 2, , , ,  nitrataseNO NO NH N NH OH NO NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồng NO3 + bụi kẽm  màu hồng • Phương pháp tiến hành: ▫ Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứa nitrate ▫ Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của nitrite ▫ Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate Thử nghiệm nitratasê (khử nitratê) Thử nghiệm nitratasê (khử nitratê) Thử nghiệm oxydase • Mục tiêu: phát hiện vi sinh vật có hệ enzym oxydase (hệ cytochrome C) • Cơ sở sinh hoá Cytochrome C khử + H+ + O2 Cytochrome C OXH+ H2O Cytochrome C OXH+ TMPD khử  TMPD OXH(màu xanh) • Thuốc thử ▫ TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p- phenylenediamine ▫ Bảo quản lạnh trong tối ▫ Thời hạn bảo quản: 2 tuần • Đối chứng (+): Serratia marcescens (-) : Proteus rettgeri Thử nghiệm oxydase • Thực hiện: ▫ Lấy vi sinh vật từ Nutrient Agar đặt lên giấy thấm ▫ Nhỏ thuốc thử TMPD ▫ Quan sát sau 30 giây Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng Thử nghiệm oxydase Thử nghiệm oxydase Thử nghiệm ONPG • Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß- galactosidase – enzyme cảm ứng. • Cơ sở sinh hóa: ONPG o-nitrophenol Màu vàng Không màu Lactose agar Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (-) ủ qua đêm 37oC Màu vàng Thử nghiệm ONPG Thử nghiệm khả năng làm tan huyết • Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu ▫ Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ • Cơ sở sinh hoá: ▫ Các haemolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật ▫ Vi sinh vật khác nhau  heamolysine khác nhau  cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau • Phân loại: 3 kiểu tan huyết ▫ Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ ▫ Tan huyết không hoàn toàn (α): xung quanh và dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác ▫ Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết Thử nghiệm khả năng làm tan huyết Thử nghiệm CAMP • Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các vi sinh vật, nhờ viê ̣c tạo thành yếu tô ́ CAMP • Cơ sở sinh hóa: ▫ S. aureus tiết β-lysin gây tan hồng cầu ▫ Streptococcus nhóm B tiết CAMP gây tan huyết ▫ β-lysin + CAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn toàn • Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-) Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes (+) (-) Thử nghiệm tính di động • Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. • Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao • Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar). ▫ Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. ▫ Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục. (+) (+) (-) Thử nghiệm tính di động Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh vi sinh vật • Mỗi loài vi sinh vật có những đặc tính sinh hóa khác nhau • Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó. • Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E (bioMerieux, Inc) QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT GV: Ths Lưu Huyền Trang Tổng số vi khuẩn hiếu khí  Định nghĩa: Vi khuẩn hiếu khí: Vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có ôxi phân tử. Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm là tổng số khuẩn lạc mọc được trên đĩa petri chứa môi trường thạch chuẩn cho vi khuẩn như PCA, sau khi ủ ở thời gian và nhiệt độ xác định (tùy tiêu chuẩn, thường là ủ 72 giờ ở nhiệt độ 30oC).  Các tên gọi:  Tổng số vi khuẩn hiếu khí: theo TCVN Tổng số (khuẩn lạc) đếm được trên đĩa (TPC:Total Plate Count) Tổng số (khuẩn lạc) hiếu khí đếm được trên đĩa (APC: Aerobic Plate Count) Tổng số vi sinh vật sống (TVC: Total Viable Count)  Số đếm đĩa chuẩn (SPC: Standard Plate Count) Tổng số vi khuẩn hiếu khí Tổng số vi khuẩn hiếu khí Ý nghĩa: • Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm. • Thực phẩm có đạt số tổng vi khuẩn hiếu khí dưới 1 mức cụ thể theo tiêu chuẩn thì mới được sử dụng. Còn không thì là thực phẩm không hợp vệ sinh,cần loại bỏ hoặc tái xử lý. • Có thể nhiễm trong nguyên liệu, chế biến, bảo quản. • Đánh giá chất lượng thực phẩm (khả nĕng hư hỏng, thời gian bảo quản). Chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí trong một số sản phẩm sữa (CFU/ml) Tên sản phẩm Sữa bột cho trẻ êm dưới 12 tháng tuổi Sữa bột Sữa đặc có đường Sữa tươi tiệt trùng Chỉ tiêu 104 5.104 104 101 Qui định của Bộ Y tế - 2002 Tổng vi khuẩn hiếu khí  Nguyên tắc:  Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường dinh dưỡng từ 1 lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào.  Kết quả được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU: Colony Forming Unit) trong một đơn vị khối lượng (thể tích) thực phẩm (CFU/g hoặc CFU/ml). Tổng vi khuẩn hiếu khí Môi trường: Plate Count Agar (PCA) Dịch pha loãng: Saline peptone water (SPW):  8,5 gam NaCl và 1 gam pepton trong 1000ml nước. Có tác dụng pha loãng mẫu và ít ảnh hưởng tới sinh lý tế bào vi sinh vật. Tổng vi khuẩn hiếu khí  Phương pháp thực hiện Đồng nhất mẫu Pha loãng mẫu Chuyển mẫu vào môi trường nuôi cấy Ủ (30oC trong 72 giờ) Đếm khuẩn lạc Tổng vi khuẩn hiếu khí Đồng nhất mẫu Nếu là mẫu lỏng thì lắc trộn đều. Nếu là mẫu rắn thì cắt nhỏ bằng kéo, dao vô trùng trên khay vô trùng. 10g mẫu + 90ml Saline Peptone Water, đồng nhất mẫu bằng stomacher trong 30 giây, mục đích để trộn đều mẫu, phân bố vi sinh vật đều trong dịch mẫu  mẫu đã được pha loãng 10 lần (tới đậm độ 10-1) Máy đồng nhất mẫu Pha loãng mẫu Mẫu ban đầu, sau khi đồng nhất có nồng độ pha loãng 10-1 10-1 101 10-2 102 10-3 103 10-4 104 Pha loãng Độ pha loãng 10-5 105 Độ pha loãng cuối Đĩa petri vô trùng PCA 45oC Khoảng 15 ml Dung dịch mẫu đã pha loãng 1 ml Lắc đều đĩa petri Để nguội Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả Mẫu lỏng: 100 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml TNTC 456 178 10-4 1ml 19 1ml Đem ủ 100 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml Đọc kết quả 1ml Đem ủ Đếm kết quả chỉ tiêu  Đếm tất cả khuẩn lạc mọc trên môi trường  Khuẩn lạc mọc loang dưới 1/3 đĩa tính là 1 khuẩn lạc  Chọn đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250 để tính kết quả  N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa  ni: số đĩa tại mỗi nồng độ  V: thể tích cấy vào đĩa (=1 ml)  fi: độ pha loãng  Đơn vị là CFU/g hoặc CFU/ml iii fVnfVn NA  ...111 Đếm kết quả  Ví dụ: trong một trường hợp tính mẫu cụ thể Nồng độ pha loãng Kết quả 10 -3 10-4 Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 36 Đĩa 3 198 14 (CFU/g) ...111 iii fVnfVn NA  5102,3 0001,012001,013 3626198246235  A  Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250  ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/g.  Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25  ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/g. Coliforms VÀ E.coli  Định nghĩa o Coliform là nhóm trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ o Coliform chịu nhiệt = coliform + lên men lactose và sinh hơi trên mt canh EC ở 44oC trong 24 giờ. o Coliform phân = coliform chịu nhiệt + sinh indole trong canh Tryptone ở 44,5oC trong 24 giờ o E.coli = coliform phân + IMViC (++--) Một số chỉ tiêu Chỉ tiêu coliform và E.coli trong một số loại thực phẩm Tên sản phẩm Xúc xích Chả cá Trứng tươi Sữa tươi tiệt trùng Coliform (trong 1g) 50 10 102 0 E.Coli (trong 1g) 3 3 3 0 Qui định của Bộ Y tế - 4/1998 TSA ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1 1 ml Lắc để yên 1 – 2h VRB ở 45oC 10 ml Chờ môi trường đặc , lật ngược, đem ủ 37oC trong 24 – 48 giờ Phục hồi VSV Chọn lọc KL coliform Khuẩn lạc coliform đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính ≥0,5mm Đếm số khuẩn lạc đặc trưng Tính: N = tổng số kl đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy Chọn 5 KL đặc trưng cấy sang 5 ống BGBL Ủ 37oC/24 – 48h Kiểm tra khả nĕng lên men Lactose và sinh hơi Tỉ lệ xác nhận R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy) Tỉ lệ xác nhận R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã cấy) Tổng số coliform (cfu/g) R nVf NC  Tính số lượng coliform ĐỊNH LƯỢNG FEACAL COLIFORM (PP ĐẾM KHUẨN LẠC)  Qui trình định lượng F. coliform tương tự như qui trình định lượng coliform, chỉ khác nhau ở những điểm sau: o Ủ đĩa môi trường VRB ở 44,0 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ o Cấy khẳng định vào canh EC ủ 44,0 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. o Các khuẩn lạc sinh hơi trên EC được cấy qua môi trường canh Tryptone để thử nghiệm indole o Khuẩn lạc dương tính khi sinh hơi trên EC và có pư indole dương tính. Tỉ lệ xác nhận R = (Số KL indol (+)) / (Số KL đã cấy) RnVfNC  ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN 10-1 10-2 10-3 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10ml LSB 1ml 1ml 1ml ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.2 2.3 3.3 10ml EC 1.1 1.2 1.5 2.2 1.1 1.2 Endo/EMB Indol Kết quả 2,0,0  MPN =4.5 ĐỊNH TÍNH E.COLI Lấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBL Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sang Endo agar Mẫu không sinh hơi được xêm là âm tính với E.coli Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA hay BHI ĐỊNH TÍNH E.COLI Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh tryptone, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-) Một trong những pư trên sai thì không phải là E.coli Kết luân: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 1g (1ml) mẫu. khuẩn lạc E. coli dạng dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm Staphylococcus aureus STAPHYLOCOCCUS AUREUS Thuộc họ Staphylococcaceae Còn gọi là Tụ cầu vàng Sống hiếu khí tùy nghi Khóa phân loài của S. aureus (Biological classification) Giới (Kingdom): Bacteria Nghành (Phylum): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Staphylococcaceae Giống (Genus): Staphylococcus Loài (Species): S. aureus PƯ catalase, coagulase dương tính PƯ oxidase âm tính Hầu hết có khả năng gây tan huyết (95%) Lên men tạo acid từ mannitol Phát triển được trên môi trường chứa 15% NaCl Trên môi trường không chọn lọc tạo sắc tố vàng Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt Sự phân bố trong tự nhiên  Thường tìm thấy trên da, tóc hay các nơi ẩm thấp ở người và động vật máu nóng  Các vết trầy xước hay lở loét là nơi tập trung của S. aureus  Nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua việc chế biến và sản xuất không hợp vệ sinh  Nhiệt độ 10 – 45oC, pH 4,6 – 9,3, tối ưu 37oC và pH 7 Dấu hiệu nhiễm và các bệnh do S. aureus Khả nĕng gây ngộ độc thực phẩm Sinh 5 độc tố ruột: enterotoxin A, B, C, D, E bền nhiệt Viêm dạ dày ruột: ăn thức ăn bị nhiễm độc tố Viêm ruột non – đại tràng: ăn thức ăn bị nhiễm tụ cầu với số lượng lớn (>105 vi khẩn/1g thức ăn) Sinh độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc ĐỊNH LƯỢNG S. aureus Nguyên tắc  Sử dụng môi trường chọn lọc để bắt những khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus  Môi trường Baird Parker Agar (BPA) hoặc Chapman Agar  Khuẩn lạc đặc trưng: đường kính 0,5 – 1 mm, lồi, đen bóng có vòng trắng đục hẹp, vòng sáng rộng  Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định  S. aureus có phản ứng coagulase dương tính – làm đông huyết tương QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S. aureus Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt môi trường Baird Parker agar, trải đều bằng que tam giác Ủ ngược đĩa ở 37 ± 0,5oC trong 48 giờ Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (Nt) và số khuẩn lạc không đặc trưng (Na) Chuyển 5 kl đặc trưng và 5 kl không đặc trưng sang mt TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm KL đặc trưng của S. aureus trên mt BPA Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tương Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có kết quả dương tính sẽ ủ đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra(KL không đặc trưng) Kết quả: số S. areus (cfu/g) )(1 aatt RNRN nVfS  KL đặc trưng KL không đặc trưng Thử nghiệm coagulase Mức độ đông tụ huyết tương Âm tính Dương tính ĐỊNH TÍNH S. aureus Nguyên tắc  Tăng sinh trong môi trường chọn lọc • Môi trường MSB (Mannitol Salt Broth): salt 7.5% ức chế Staphylococcus có coagulase (-) • Ống (+) sẽ chuyển từ màu đỏ sang vàng (S.aureus lên men mannitol  phenol red (đỏ  vàng)  Mẫu có biểu hiện dương tính được phân lập trên môi trường chọn lọc • Môi trường BPA, TGA, Chapman agar • KL đên nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 0,5 – 1 mm, có vầng sáng xung quanh  Khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ • Phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết tương QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH S. aureus Cấy 1g (ml) vào ống nghiệm chứa 10ml MSB Chọn ống nghiệm dương tính (mt chuyển màu vàng) cấy chuyển sang Baird Parker agar hay Chapman agar Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 - 48 giờ Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 48 giờ Chọn kl đặc trưng cấy chuyển sang TSA MSB (+) (-) BPA TSA KL đặc trưng TSA 1 ống (+) Tất cả (-) Phát hiện Không Phát hiện Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Cấy vào ON chứa 0,3ml huyết tương Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có kết quả dương tính thi ̀ ủ đến 24 giờ. Kết quả: S. aureus (+) khi có ngưng kết huyết tương Kết luận: phát hiện/không phát hiện S. aureus 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10ml MSB 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml ĐỊNH LƯỢNG S. aureus BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 2.1 2.4 1.1 1.2 1.3 2.2 BPA 2.4 MSB Chọn những ống MSB chuyển màu vàng 1.1 1.2 1.3 2.2 1.1 1.2 BPA Huyết tương 2.4 2.4 Bắt khuẩn lạc đặc trưng trên BPA Thử nghiệm Coagulase Đọc kết quả thử nghiệm coagulase 10-1 10-2 10-3 1 1 0 4 MPN/g Kết quả MPN Faecal Streptococcus Định nghĩa Là các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân Hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương Không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy Hầu hết sống hiều khí tùy ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí Tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng Chuẩn bị dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Trải lên MT mEnterococcus agar (SLANETZ and BARTLEY agar) ủ 37oC, 48 giờ Đếm tất cả KL đặc trưng (đỏ, hòng) Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng vào TSA ủ ở 37oC, 24 giờ Khẳng định (+): Chịu muối 6,5%, chịu pH ở 9,6 (+) Catalase (-); Oxydase (-) Tỉ lệ khẳng định Mật độ Streptococcus phân (CFU/g hay CFU/ml) Khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đậm Phương pháp đếm KL (màng lọc) Dịch pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 canh Azide Glucose (9 ống) thạch Bilê Esculinê Thử nghiệm catalasê AG (+), BE (+), Catalase (-) Tra bảng MPN Mật độ Streptococcus phân (MPN/g hay MPN/ml) (+) (+) (-) (+): màu MT: tím → vàng có cặn (+) Không phân hủy H2O2 Phương pháp MPN Clostridium spp. Trực khuản Gram (+) Sinh bào tử, ky ̣ khi ́ Hàu hết thuo ̣ c nhóm ưa nhiê ̣t vừa va ̀ ưa nhiê ̣t, sô ́ ít ưa lạnh Khử sulfite thành sulfide tạo màu đên Mo ̣ t sô ́ gây bê ̣nh ở người, mo ̣ t sô ́ gây hư hỏng thực phảm. Quy trình phaân tích Clostridium  Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp. Cho 1ml dung dịch pha loãng (mỗi nồng độ 2 ống) vào ống nghiệm có chứa môi trường Wilson Blair cải tiến (Bismuth sulfite agar) làm nguội ở 45oC. Cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 và 5 giọt phèn sắt 5%. Tiếp tục làm như sau:  Lắc đều  Đun cách thủy 75oC, 15 phút  Làm đông nhanh  Bổ sung thêm vào ống nghiệm một lớp môi trường Wilson Blair cải tiến đã làm nguội ở 45oC. Làm đông nhanh.  Ủ 37oC, 18 – 24 giờ  Đọc kết quả: Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium (tròn, đen). Môi trường Sulfite polymyxin sulfadiazin (SPS) agar Nhận biết Clostridium perfringens Nhận biết Clostridium perfringens Môi trường Sulfite polymyxin sulfadiazin (SPS) agar Nhận biết Salmonella spp. Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hoá: KIA, Mannitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine Decarboxylase Broth, Tryptone Broth (37.0  0.50C/24h) Cân 25g mẫu + 225g BPW, đồng nhất (Ủ ở 37.0  0.5oC trong 16 - 24 giờ) Cấy phân lập sang XLD agar (37.0  0.50C/24h) Chọn KL hòng đỏ trong suót, có/không có tâm đên Cấy 0.1ml sang ON chứa 10ml Selenite Cystein Broth (37.0  0.50C/24 giờ) Cấy 0.1ml sang ON chứa 10ml RV Broth (41.5  0.50C/24h) Cấy phân lập sang SS agar (37.0  0.50C/24h) Chọn KL trong suót, có/không có tâm đên Phát hiện (không phát hiện) Salmonella / 25g Biểu hiện của Salmonêlla: trên KIA: đỏ/vàng / H2S (+) / gas (+); Urea (-); Mannitol (+); Indol (-); LDC (+); Mẫu có Salmonella khi:  Làm đục môi trường tăng sinh  Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập: khuẩn lạc tròn, hơi lồi trong, bờ đều có đường kính khoảng 2 – 4mm, đôi khi có tâm đên. Trực khuẩn Gram âm  Có tính di động: Trên môi trường MIU Salmonella mọc lan khỏi đường cấy thẳng  Lactose (-): giữ nguyên màu đỏ của phần nghiêng  Glucose (+): phần đáy đổi màu từ đỏ sang vàng  Dihydrosulfide (+): các khuẩn lạc Salmonella có màu đen  Urease (-): làm biến màu môi trường từ đỏ sang vàng  Indole (-): không làm đỏ thuốc thử Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD) Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Kligler Iron Agar (KIA) +  Đối chứng Salmonella Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Urea Broth âm tính  Salmonella  + Salmonella Đối chứng +  Nhận biết Salmonella spp. Môi trường Lysine Decarboxylase Broth + Salmonella Proteus Nhận biết Salmonella spp. Salmonella Phản ứng Indole âm tính  Salmonella Đối chứng +  Phản ứng Voges-Proskauer (VP) âm tính  Salmonella Thuốc thử VP +  Đối chứng Đối chứng Nhận biết Salmonella spp. Đỏ tươi Đỏ đồng +  Nhận biết Bacillus cereus Đặc điểm của Bacillus cereus  Trực khuản Gram (+)  Hiếu khí hay kị khí tùy nghi  Tạo no ̣ i bào tử  Đi đo ̣ng  Lên men glucose sinh hơi  Nitratase (+), VP (+)  Sinh trưởng trong khoảng 5-500 C, pH 4.5-9.3  Tiết 2 loại toxin chính: diarrhoeal toxin (gây tiêu chảy) và emetic toxin (gây nôn mửa)  Hiê ̣n diê ̣n trong đát, bụi, sữa, thịt, rau quả, gia vị, sp khô Quy trình phân tích B. cereus (MPN) Chọn khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase (+) cấy sang TSA hay BHI, ủ 30oC/24h Lấy 10g mẫu đồng nhất vào 90ml pêptonê đệm, được 10-1 Chọn ống (+), cấy PL sang MYP, ủ 37 0.5oC/24-48h Pha loãng mẫu 10-2, 10-3, 10-4 Cáy 1ml dd 10-2, 10-3, 10-4 vào 10ml TSP, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 30oC, 30h XĐ số ống (+) (đục) ở mỗi độ pha loãng Cấy thử sinh hoá: phenol red glucose broth, gram, nitrate broth, VP, Tyrosine agar, Lysozyme broth Kết luận B.cereus: glucose (+), nitratase (+), VP (+), tyrosine (+), lysozyme (+) Nhận biết Bacillus cereus Môi trường Mannitol – Egg – Yolk polymyxin (MYP) Nhận biết Bacillus cereus Lên men glucose : dương tính  Bacillus +  Đối chứng + + Phản ứng Voges-Proskauer (VP) dương tính  Bacillus Thuốc thử VP + Đối chứng +  Nhận biết Bacillus cereus Nhận biết Bacillus cereus Môi trường nitrate broth Vibrio spp. Hình que/dáu phảy, Gram (-) Di đo ̣ng, kỵ khí tùy nghi Catalase (+), oxydase (+) Lên men glucose nhưng ko sinh hơi, không sinh H2S Tát cả các loài đều càn muói để tăng trưởng (trừ V.cholerae) Nhận biết Vibrio 25g Mãu + 225 mL nước APW (alkaline peptone water) 10-1 , ủ 35 ± 20C, 18-24h Cáy phân la ̣p trên TCBS agar, ủ 35 ± 20C, 18-24h Chọn KL đa ̣c trưng: V.cholerae: vàng, hơi dệt, bóng, 2-3mm, tâm đục, rìa trong V. parahaemolyticus: tròn, xanh lá, đục, 2-3 mm V. alginolyticus: lớn, vàng, đục Cáy lên TSA, ủ 35C, 24h ròi mang thử phản ứng sinh hóa  khảng định Vibrio