Bài giảng Thực hành vi sinh vật học

ng sinh - Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập - Trực khuẩn Gram âm - Có tính di động - Lactose (-), Saccharose (-) - Dextrose hoặc Glucose (+) - Dihydrosunfua (+) - Urease (-) - Indol (-) - Manitol (+) - VP (-) 4. Những điểm cần lưu ý - Salmonella là nhóm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm. - Các môi trường tăng sinh chọn lọc, môi trường phân lập Salmonella có các thành phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao, do đó, không được hấp tiệt trùng khi pha chế. 5. Báo cáo thực tập - Trình bày quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm? - Tại sao khi phân tích Salmonella trong thực phẩm, chỉ cần phân tích định tính? - Giải thích cơ chế của các phản ứng sinh hóa xác định Salmonella? - Nêu kết quả và kết luận về sự hiện diện của Salmonella trong mẫu thực phẩm ban đầu? Quy trình phân tích định tính Salmonella Đồng nhất 25g mẫu với 225g BPW Chuyển 0,1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml Selenite Cystine Broth hoặc RV Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 16 – 24 giờ Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Cấy phân lập sang môi trường XLD và HE Chọn khuẩn lạc đặc trưng: trong suốt, có hay không có tâm đen, cấy sang TSA hay BHI Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 24 giờ Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Cấy chuyền vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: KIA, Mannitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine Decarboxylase Broth Canh Trypton, MRVP Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 24 giờ Biểu hiện của Salmonella Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (+),Gas (+) Urea (-); indol (-); mannitol (+); LDC (+), VP(-) Ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá Phát hiện (không phát hiện) Salmonella/25 g BÀI 21 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS TRONG THỰC PHẨM 1. Nguyên tắc Bacillus cereus được phát hiện lần đầu tiên bởi Hauge năm 1949 khi phân tích mẫu xốt vani gây tiêu chảy tại bệnh viện ở Oslo, Na uy.Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố phổ biến trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. Ngoài các độc tố gây ngộ độc thực phẩm là diarrhoed và emetic, Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt. Quá trình phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm có thể được thực hiện theo phương pháp MPN hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc của Bacillus cereus trên môi trường phân lập MYP được xác định bằng các phản ứng sinh hóa đặc trưng. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15 3 Bình tam giác 250ml Cái 1 4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Nồi hấp cao áp Cái 1 2 Tủ cấy vô trùng Cái 1 3 Tủ sấy Cái 1 4 Máy dập mẫu Cái 1 5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 2.2. Môi trường và hoá chất - Dung dịch TSP - Môi trường MYP - Môi trường nitrate broth - Môi trường phenol red dextrose broth - Nước muối sinh lý 0,9% - Nước cất vô trùng. - Thuốc nhuộm tím kết tinh - Dung dịch lugol - Thuốc nhuộm Fuschin - Cồn 96o - Lysozyme - Môi trường thạch tyrosin - Môi trường MR-VP - Môi trường TSA * Dung dịch đệm phosphat : được sử dụng để pha loãng - Dung dịch mẹ + KH2PO4 :34g + Nước cất :500ml Chỉnh pH = 7,2. Cho nước cất vào đủ 1000ml. Hấp 121oC, 15 phút. - Pha loãng để sử dụng + Dung dịch mẹ :1,25ml + Nước cất :98,75ml Phân phối 90ml vào các erlen và 9ml vào các ống nghiệm. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. * Môi trường Manitol - Egg - Yolk polymyxin (MYP) - Cao thịt :1g - Peptone :10g - Mannitol :10g - NaCl :10g - Phenol red :2,5ml - Thạch :15g - Nước cất đủ :900ml pH = 7,2±0,2. Hấp 121oC, 15 phút. Để nguội đến 500C. - Dung dịch Polymixin B 0,1% Hòa 500.000 đơn vị polymixin B sulfat trong 50ml nước cất vô trùng. Bảo quản 4oC. - Egg yolk emulsion 50%: sản phẩm thương mại. Môi trường hoàn chỉnh: bổ sung 2,5ml dung dịch polymixin B và 1,25ml egg yolk emulsion vào 225ml môi trường thạch cơ bản đã khử trùng và làm nguội 50oC. Trộn đều và đổ 10 - 15ml vào các đĩa petri. * Môi trường Phenol Red - Dextrose Broth Được sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men glucose của vi sinh vật. - Proteose peptone No.3 :10g - Cao thịt :1g - Dextrose :5g - NaCl :5g - Phenol red :0,018g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng 121oC, 10 phút. pH cuối = 7,4±0,2. * Môi trường Nitrat Broth : Được sử dụng trong khẳng định sinh hóa - Cao thịt :3g - Peptone :5g - KNO3 :1g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút, pH cuối = 7,0±0,2. * Môi trường MR - VP: Được sử dụng trong khẳng định sinh hóa - Peptone :5g - Glucose :5g - Phosphate buffer :5g - Nước cất :1000ml Phân phối môi trường vào các ống nghiệm và hấp khử trùng 121oC, 15 phút, pH cuối= 7,5±0,2. * Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) : Được sử dụng để bảo quản, phục hồi vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm - Trypticase peptone :15g - Phytone peptone :5g - NaCl :5g - Nước cất đủ :1000ml Đun nóng, phân phối môi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút, 121oC. Đặt ống nghiệm nghiêng. pH cuối = 7,3±0,2. * Môi trường thạch Tyrosine: Dùng để thử nghiệm khả năng phân hủy Tyrosine của Bacillus cereus - Nutrient agar - Cao thịt :3g - Peptone :5g - Agar :15g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 6,8±0,2. - Dung dịch Tyrosine 5% Tyrosine :5g Nước cất :100ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. Môi trường hoàn chỉnh: trộn 90ml môi trường Nutrient agar đun chảy làm nguội 45oC với 10ml dung dịch Tyrosine 5%, phân phối 10ml vào các đĩa petri. * Môi trường Nutrient Broth với lysozyme Nutrient Broth - Cao thịt :3g - Peptone :5g - Nước cất đủ :1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 6,8±0,2. Lysozyme 0,1% - Lysozyme hydrochloride :0,1g - Nước cất :100ml Lọc bằng màng lọc vô trùng. Môi trường hoàn chỉnh: hòa 1ml lysozyme 0,1% với 99ml môi trường Nutrient Broth, phân phối vào các ống nghiệm. * Thuốc thử Voges - Proskauer - a-Naphtol :5g - Etanol 96% :100ml Bảo quản ở 0 - 5oC trong lọ tối. * Dung dịch Kali hydroxit 40% (KOH) - Kali hydroxit (KOH) :40g - Nước cất đủ :100ml * Thuốc thử nitrit Thuốc thử A - Acid sulfanilic :8g - CH3COOH 5N :1000ml Thuốc thử B - a-Napthol : 2,5g - CH3COOH 5N :1000ml Thuốc thử hoàn chỉnh - Dung dịch A 0,25ml - Dung dịch B 0,25ml 2.3. Nguyên liệu khác - Mẫu thịt heo tươi - Túi nilon dập mẫu - Dịch vi khuẩn Bacillus cereus kiểm chứng 3. Tiến hành thí nghiệm 3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích tại phòng thí nghiệm - Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng trong điều kiện vô trùng. - Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch đệm phosphat bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1. - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch đệm phosphat để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn. 3.2. Cấy mẫu lên môi trường MYP - Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, hút 0,1ml dịch pha loãng vào mỗi đĩa MYP (mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng que gạt trải cẩn thận chất nuôi càng nhanh càng tốt. Ủ 30oC, trong thời gian 24 - 48 giờ. - Chọn và đếm các đĩa có từ 15 - 150 khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus aureus (dẹt, đường kính 2 - 3mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục). Chuyển 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường phục hồi TSA , ủ ở 30oC qua đêm trước khi tiến hành các thử nghiệm sinh hoá. Hình. Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường Mossel Hình. Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP 3.3. Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hóa - Thử nghiệm khả năng lên men glucose: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường thạch glucose, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính làm đổi màu môi trường từ đỏ sang vàng. - Thử nghiệm khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường nitrat, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus có phản ứng dương tính nên sau khi nhỏ thuốc thử vào canh khuẩn chuyển sang màu đỏ cam trong 10 phút. - Thử nghiệm Voges - proskauer: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường canh MR - VP, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng khi cho thuốc thử a-Naphthol vào (trước khi nhỏ a-Naphthol vào phải làm kiềm hóa môi trường nuôi cấy bằng KOH 40%). - Thử nghiệm Tyrosin: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang ống thạch nghiêng Tyrosin, ủ 35oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc Bacillus phân hủy tyrosin tạo khoảng trong xung quanh khuẩn lạc. - Thử nghiệm Lysozyme: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang ống nghiệm chứa môi trường Nutrient Broth với 0,001% lysozyme, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus phát triển làm môi trường đục đều. 3.4. Tính toán kết quả: Số Bacillus cereus trên 1g mẫu = Trong đó : N: tổng số khuẩn lạc đếm được n: số lượng đĩa đếm f: độ pha loãng tương ứng V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ. 4. Những điểm cần lưu ý - Bacillus cereus là nhóm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm. - Các môi trường phân lập Bacillus cereus có các thành phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao, do đó, không được hấp tiệt trùng khi pha chế. 5. Báo cáo thực tập - Trình bày quy trình phân tích Bacillus cereus trong thực phẩm? - Tại sao khi phân tích Bacillus cereus trong thực phẩm, chỉ cần phân tích định tính? - Giải thích cơ chế của các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus cereus? - Nêu kết quả và kết luận về sự hiện diện của Bacillus cereus trong mẫu thực phẩm ban đầu? Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng coù maøu hoàng eosin, lecithinase döông tính trên đĩa petri Choïn 5 khuaån laïc đặc trưng caáy sang TSA hay BHI, uû 30oC, 24h Laáy 25g maãu ñoàng nhaát vaøo 225ml pepton ñeäm, ñöôïc 10-1 Pha loaõng maãu 10-2, 10-3, 10-4 Chuyeån 0,1ml dung dòch 10-2, 10-3, 10-4 cấy trải vaøo đĩa petri môi trường MYP, uû 30oC, 30h Caáy thöû sinh hoaù: phenol red glucose broth, gram, nitrate broth, VP, Tyrosine agar, Lysozyme broth Keát luaän Bacillus cereus BÀI 22 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM 1. Nguyên tắc Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) được Robert Koch phát hiện vào năm 1878 thông qua phân lập từ mủ của các ung nhọt. Staphylococcus aureus thuộc họ Micrococcaceae (cầu khuẩn). Tụ cầu khuẩn hiện nay được phát hiện có 20 loại , được chia làm 2 nhóm: nhóm coagulase (+) và coagulase (-). Staphylococcus aureus thuộc loại coagulase (+). Hiện diện ở nhiều nơi trong môi trường và trên cơ thể người. Gây nhiều bệnh nguy hiểm trên da, trong cơ thể bằng cách tiết các độc tố như hyaluronidase, hemolysine, leukocidine, exfoliatine, 5 độc tố ruột enterotocxine A, B, C, D, E và độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc. Nguyên tắc phát hiện sự hiện diện và định lượng số lượng của Staphylococcus aureus trong thực phẩm dựa vào sự xuất hiện của khuẩn lạc điển hình (chỉ định bởi sự khử của Kali tellurite và lòng đỏ trứng) trên môi trường phân lập Baird-Parker và phản ứng dương tính coagulase trong dịch huyết tương thỏ. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15 3 Bình tam giác 250ml Cái 1 4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Nồi hấp cao áp Cái 1 2 Tủ cấy vô trùng Cái 1 3 Tủ sấy Cái 1 4 Máy dập mẫu Cái 1 5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 2.2. Môi trường và hoá chất - Môi trường BPA bổ sung kali tellurite và lòng đỏ trứng - Huyết tương thỏ đông khô - Nước muối sinh lý 0,9% - Thuốc nhuộm tím kết tinh - Dung dịch lugol - Thuốc nhuộm Fuschin - Cồn 96o * Dung dịch Saline Peptone Water (SPW) Được sử dụng để pha loãng vi sinh vật, thành phần như sau: - Pepton :1g - NaCl :8,5g - Nước cất đủ :1000ml Phân phối 9ml vào các ống nghiệm và 90ml vào các erlen. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0. * Môi trường Baird-Parker - Tryptone 10g - Cao thịt 5g - Cao nấm men 1g - Sodium pyruvate 10g - Glycine 12g - Lithium chloride.6H2O 5g - Agar 20g - Nước cất đủ 1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0± 0,2. Môi trường hoàn chỉnh: thêm 5ml Bacto EY tellurite enrichment được làm ấm 45oC vào 95ml môi trường cơ bản được đun chảy và làm nguội ở 45oC, trộn đều và đổ 10 - 15ml vào các đĩa pettri vô trùng. * Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA): Được sử dụng để bảo quản, phục hồi vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm - Trypticase peptone 15g - Phytone peptone 5g - NaCl 5g - Nước cất đủ 1000ml Đun nóng, phân phối môi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút, 121oC. Đặt ống nghiệm nghiêng. pH cuối = 7,3±0,2. 2.3. Nguyên liệu khác - Mẫu thịt heo tươi - Túi nilon dập mẫu - Dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus kiểm chứng 3. Tiến hành thí nghiệm 3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích - Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch SPW bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1. - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch SPW để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn. 3.2. Cấy và ủ mẫu - Chọn nồng độ pha loãng thích hợp, cấy 0,1ml dịch pha loãng vào đĩa môi trường Baird Parker, dùng que cấy tam giác trải đều mẫu cho đến khi khô. Thực hiện tương tự với 2 đĩa môi trường Baird Parker khác. Ủ 37oC trong 24 - 48 giờ. Hình. Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường BPA 3.3. Đọc kết quả - Đếm riêng số khuẩn lạc đặc trưng Nt (tròn, đen, bóng, có quầng sáng, quầng trong xung quanh khuẩn lạc) và không đặc trưng Na của Staphylococcus aureus. - Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng sang ống thạch nghiêng TSA. Ủ 30oC trong 24 giờ. 3.4. Phép thử khẳng định * Thử nghiệm catalase - Mục đích: chẩn đoán phân biệt khóm vi khuẩn Staphylococci với khóm vi khuẩn Streptococci và Pneumococci. Staphylococci có emzyme catalase sẽ phóng thích O2 từ H2O2 tạo hiện tượng sủi bọt. - Thử nghiệm được thực hiện bằng cách hoà một ít sinh khối vi sinh vật lấy trực tiếp từ khuẩn lạc trên môi trường BPA vào giọt H2O2 trên lame kính. Kết quả: + Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn có catalase (+) → cocci này là Staphylococci. + Không có hiện tượng sủi bọt: catalase (-) → nhóm cocci này là Streptococci * Thử nghiệm coagulase - Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA sang các ống nghiệm chứa huyết tương thỏ, ủ 37oC. - Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Staphylococcus aureus cho phản ứng huyết tương dương tính (có khối đông huyết tương hình thành). 3.5. Tính toán kết quả Mật độ Staphylococcus aureus trong 1g mẫu (CFU/g): Trong đó: - f: hệ số pha loãng, V: thể tích mẫu cấy - n: số đĩa thoả điều kiện - Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng - Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng - Rt: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng - Ra: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng 4. Những điểm cần lưu ý - Staphylococcus aureus là nhóm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm. - Thử nghiệm coagulase có thể thực hiện trên dịch huyết tương thỏ đông khô hoặc dịch huyết tương thỏ tươi. - Dung dịch H2O2 dùng làm thử nghiệm coagulase phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp để tránh làm mất hoạt tính khi sử dụng. 5. Báo cáo thực tập - Trình bày đặc tính và độc tính của vi khuẩn Staphylococcus aureus? - Trình bày quy trình phân tích định lượng Staphylococcus aureus? - Ý nghĩa của việc xác định chỉ số Ht và Ha? - Xác định kết quả phân tích định lượng Staphylococcus aureus trong mẫu thịt ban đầu? Hình. Kết quả thử nghiệm coagulase trên dịch huyết tương thỏ (âm tính: I, dương tính: II, III, IV, V) Quy trình phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm: Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt môi trường Baird Parker agar, trang đều bằng que tam giác Ủ ngược đĩa ở 37 ± 0,5oC trong 48 giờ Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (Nt) và số khuẩn lạc không đặc trưng (Na) Chuyển 5 kl đặc trưng và 5 kl không đặc trưng sang mt TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tương Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có kết quả dương tính sẽ ủ đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra(KL không đặc trưng) Kết quả: số S. areus (CFU/g) BÀI 23 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM (Tiêu chuẩn: TCN 200:2004) 1. Nguyên tắc Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae là phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng di động nhanh, phản ứng oxidase dương tính, phát triển được ở nhiệt độ 420C, lên men đường sacarose, khử lysin; phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat. Vibrio cholerae là nhóm vi khuẩn nguy hiểm (tác nhân gây bệnh tả), thường xâm nhiễm vào các loại thủy hải sản. Có khả năng phát dịch nhanh. Trong tất cả các loại thực phẩm, chỉ tiêu đối với đối tượng này bằng 0 (không được phát hiện trong 25g thực phẩm). Phát hiện Vibrio cholerae bằng cách tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc và cấy chuyển phân lập trên môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15 3 Bình tam giác 250ml Cái 1 4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Nồi hấp cao áp Cái 1 2 Tủ cấy vô trùng Cái 1 3 Tủ sấy Cái 1 4 Máy dập mẫu Cái 1 5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 2.2. Môi trường và hoá chất * Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW) - Pepton : 10,00 g - Natri clorua : 10,00 g - Nước cất : đủ 1000ml - pH 8,5±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi. * Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacarose (TCBS thạch) - Pepton : 10,00 g - Cao nấm men : 5,00 g - Natri xitrat : 10,00 g - Na2S2O3 : 10,00 g - Mật bò : 5,00 g - Sacarose : 20,00 g - Natri clorua (NaCl) : 10,00 g - Sắt (III) citrat (FeC6H5O7) : 1,00 g - Natri cholate : 3,00 g - Xanh bromthymol : 0,04 g - Xanh thymol : 0,04 g - Thạch : 15,00 g. - Nước cất vô trùng đủ 1000ml - pH 8,6± 0,2 (ở nhiệt độ 250C). Ðun sôi để hoà tan hoàn toàn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng 500C. Rót 15 - 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Trước khi sử dụng phải làm khô đĩa môi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ trong phòng hoặc đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 370C - 450C. Không hấp khử trùng môi trường Môi trường, thuốc thử sinh hoá * Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar -TSI - Pepton : 15,00 g - Proteose pepton : 5,00 g - Cao thịt bò : 3,00 g - Cao nấm men : 3,00 g - NaCl : 5,00 g - Lactose : 10,00 g - Sacarose : 10,00 g - Glucose : 1,00 g - FeSO4 : 0,20 g - Na2S2O3 : 0,30 g - Ðỏ phenol : 0,024 g - Thạch : 12,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,4±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm. * Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA - Polypepton pepton : 20,00 g - NaCl : 5,00 g - Lactose : 20,00 g - Dextrose : 1,00 g - Sắt ammoni xitrat : 0,50 g - Na2S2O3 : 0,50 g - Phenon đỏ : 0,025 g - Thạch : 15,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,4±0.2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm * Hugh - Leifson Glucose - Pepton : 2,00 g - Cao nấm men : 0,50 g - NaCl : 30,00 g - Dextrose : 10,00 g - Tím bromcresol : 0,015 g - Thạch : 3,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,4±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun nóng để hoà tan hoàn toàn các thành phần trên rồi chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. * O/F Glucose - Trypton : 2,00 g - Natri clorua (NaCl) : 5,00 g - K2HPO4 : 0,30 g - Xanh bromthymol : 0,03 g - Thạch : 2,00 g - Glucose : 10,00 g - Nước cất đủ: 1000ml - pH = 6,8±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun sôi để hoà tan các thành phần rồi rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút . * Canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và T1N10) Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl như trên. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 250C). Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối. * Môi trường thử decarboxylase (Môi trường cơ bản) - Pepton : 5,00 g - Cao nấm men : 3,00 g - Glucose : 1,00 g - Tím bromcresol : 0,02 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 6,5±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g một trong các loại axitamin: L-lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy. * Canh thang urê - urê : 20,00 g - Na2HPO4 : 9,50 g - K2HPO4 : 9,10 g - Cao nấm men : 0,10 g - Ðỏ phenol : 0,01 g - Nước cất đủ : 1000ml - pH = 6,8±0,1 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan các thành phần. Không được hấp khử trùng, lọc vô trùng bằng màng lọc có đường kính lỗ là 0,45 ml. Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vô trùng. * Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản) - Pepton : 10,00 g - NaCl : 5,00 g - Cao thịt bò : 3,00 g - Tím bromcresol : 0,04 g - Nước cất đủ : 1,00 lít - pH = 7,0±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho môi trường sau khi pha đạt yêu cầu như trên rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacarose, lactose, D-cellobiose, arabinose, D-manniton và D-mannose) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278±0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%. * Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl - Trypton : 10,00 g - NaCl : 20,00 g - Thạch : 20,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,2±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun sôi để hoà tan các thành phần trên. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 500C rồi rót ra đĩa hoặc ống nghiệm. * Thuốc thử Oxidasse Hoà tan 1,0 g N-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng. Ðựng dung dịch trong lọ sẫm màu hoặc bọc lọ trong giấy bạc. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C, sử dụng trong vòng 7 ngày. * Dầu khoáng vô trùng Rót khoảng 20 - 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 0C trong 30 phút. * Thuốc thử ONPG - Dung dịch đệm: Natri dihydro phosphat ngậm 1 phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90 g Nước cất : 45,00 ml Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml Hoà tan NaH2PO4.H2O trong nước cất. Thêm dung dịch NaOH 30% và chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C. - Dung dịch ONPG: ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg Nước cất ở 370C : 15,00 ml Dung dịch đệm : 5,00 ml Hoà tan ONPG trong nước cất ở nhiệt độ 370C. Thêm dung dịch đệm vào rồi lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C. Trước khi sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 370C. * Các đĩa 10 mg và 150 mg O/129 Vibriostat Cắt giấy lọc thành các mảnh tròn đường kính khoảng 5 - 6 mm rồi đặt vào các đĩa petri, hấp khử trùng. Chuẩn bị đĩa 150 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridin photphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa. Chuẩn bị đĩa 10 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridine phosphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa. Sấy khô các đĩa, bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng. 2.3. Nguyên liệu khác - Mẫu thủy sản tươi (nghêu, sò, mực...) - Túi nilon dập mẫu - Dịch vi khuẩn Vibrio cholerar kiểm chứng - Cồn 96o 3. Tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu thực phẩm Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW vào túi, nghiền bằng máy nghiền đồng nhất trong 2 phút. Mẫu kiểm tra thường ví dụ: mẫu nghêu Lấy phần thịt của 10 - 12 con nghêu (kể cả nước) rồi cắt nhỏ, trộn đều. Sau đó, nghiền bằng máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu trong 450 ml nước pepton kiềm APW trong 2 phút. Chia dung dịch mẫu này vào 2 bình vô trùng, mỗi bình chứa 250 ml rồi pha loãng thành hai dãy bằng cách trộn đều 10 ml dung dịch mẫu trong 90 ml nước pepton kiềm APW. Ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 37,00C±1,00C và 42,00C±0,20C. 3.2 Tăng sinh a. Ðối với mẫu thông thường Ủ các bình chứa mẫu đã chuẩn bị (kể cả mẫu chứng dương và mẫu chứng âm) ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 6 - 8 giờ. Sau đó, phân lập, phần còn lại ủ tiếp 16 - 24 giờ rồi phân lập lại. b. Ðối với mẫu nghêu Ủ 1 dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 6 - 8 giờ và 16 - 24 giờ. Ủ 1 dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 42,00C±0,20C trong 6 - 8 giờ. 3.3. Phân lập và đọc kết quả trên đĩa Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trê, không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch. Ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 18 - 24 giờ. Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V. cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacarose), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh. Hình. Khuẩn lạc đặc trưng của Vbrio cholerae trên môi trường TCBS 3.4 Thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh a. Thử nghiệm sinh hoá sơ bộ Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl. Ủ ở nhiệt độ 37,00C±1,0oC trong 18 - 24 giờ. Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hoá. * Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 18 - 24 giờ. Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. * Thử nghiệm với các canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0±1,0 0C trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường. * Thử nghiệm lên men - oxy hoá Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucose hoặc O/F glucose. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống. ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0±1,00C trong 1 - 2 ngày. V. cholerae lên men glucose làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng. * Thử nghiệm oxidase Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidase. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidase. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây . Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này. * Nhuộm gram V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy. b. Thử nghiệm sinh hoá khẳng định * Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ 42,00C±0,20C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 420C làm môi trường bị đục. * Thử nghiệm cacbonhydrat Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacarose, lactose, D-cellobiose, arabinose, D-manniton, D-mannose. Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,00C±1,00C. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ. V. cholerae cho phản ứng sacarose, manniton, mannose dương tính và lactose, cellobiose, arabinose âm tính. * Thử nghiệm decacboxylase/dehydrolase Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 37,00C±1,0 0C trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng). V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính. * Thử nghiệm urê Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng. * Thử nghiệm ONPG Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactose vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG. ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37,00C±1,00C. Kiểm tra ống định kỳ trong 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng. Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên. * Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37,0±1,00C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129. * Thử nghiệm kháng huyết thanh Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện. Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 1 và Bảng 2. Bảng . Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 Kháng nguyên Kháng huyết thanh đa giá O1 Dung dịch muối sinh lý Kết luận Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae + - V.cholerae O1 Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae - - V.cholerae non- O1 Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae + + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1 Bảng. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.cholerae O1 Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba Kháng huyết thanh Ogawa Dung dịch muối sinh lý Kết luận V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima V. cholerae O1 - - - Chủng không đặc hiệu 3.5. Ðọc kết quả Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu. 4. Những điểm cần lưu ý - Môi trường tăng phân lập Vibrio là TCBS có một số thành phần biến tính ở nhiệt độ cao, không được hấp tiệt trùng. - Chủng Vibrio cholerae (gây bệnh tả) là loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trong quá trình thực hành. Mang khẩu trang và găng tay để tránh bị xâm nhiễm. Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ và môi trường nuôi cấy cần được hấp tiệt trùng cẩn thận sau khi thí nghiệm. - Dịch pepton kiềm (APW) tăng sinh chọn lọc Vibrio, sau 24 giờ sẽ có mùi khó chịu, khi hấp tiệt trùng để loại bỏ, cần bọc kỹ bằng túi nilon. - Để kết quả phân tích chính xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất cả các bước thử nghiệm. 5. Báo cáo thực tập - Trình bày đặc tính sinh lý và gây bệnh của Vibrio cholerae? - Trình bày quy trình phân tích Vibrio cholerae trong thủy sản? - Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh sử dụng trong quá trình phân tích xác định Vibrio cholerae? BÀI 24 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 1. Nguyên tắc Vi khuẩn Clostridium perfringens thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương. Đa số sống kị khí, ưa nhiệt và có khả năng sinh bào tử chịu nhiệt. Clostridium perfringens thủy giải mạnh protein và chuyển hóa acid amin tạo mùi khó chịu. Clostridium perfringens sinh độc tố trong thực phẩm và gây bệnh hoại tử vết thương. Clostridium perfringens được phân tích bằng cách sử dụng môi trường có chứa sắt và sulphite. Khuẩn lạc mọc trên môi trường có màu đen do phản ứng giữa S2- và Fe2+. 2. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15 3 Bình tam giác 250ml Cái 1 4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 1 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Nồi hấp cao áp Cái 1 2 Tủ cấy vô trùng Cái 1 3 Tủ sấy Cái 1 4 Máy dập mẫu Cái 1 5 Bình ủ kỵ khí Cái 1 6 Bếp đun cách thủy Cái 1 7 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 2.2. Môi trường và hoá chất * Môi trường Sulphite polymyxin sulphadiazin (SPS agar) Được sử dụng để định lượng Clostridium perfringens - Peptone :15g - Yeast extract :10g - Ferric citrate :0,5g - Sodium sulphite :0,5g - Polymycin B sulphate :0,01g - Sodium sulfadiazine :0,12g - Agar :13,9g - Nước cất đủ :1000ml Phân phối vào ống nghiệm. Hấp 15 phút ở 121oC. pH cuối = 7,0±0,2. * Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Được sử dụng để pha loãng vi sinh vật - Peptone :10g - NaCl :5g - Na2HPO4.9H2O :9g - KH2PO4 :1,5g - Nước cất đủ :1000ml Phân phối 9ml vào các ống nghiệm và 90ml vào các erlen. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0±0,2. * Môi trường Wilson Blair cải tiến (Sulfite Iron Wilson Blair agar) Được sử dụng để định lượng Clostridium perfringens - Glucose :20 g - Peptone :10g - NaCl :5g - Cao thịt :5g - Agar :20g - Nước cất đủ :1000ml Đun sôi, phân phối vào ống nghiệm hoặc hộp petri. Hấp ở 121oC. pH cuối = 7,0±0,2. Để tủ lạnh. Không được dùng trước 24 giờ và sau 5 ngày. * Dung dịch phèn sắt 5% (pha trước khi dùng) * Dung dịch Na2SO3 5% (pha trước khi dùng) 2.3. Nguyên liệu khác - Mẫu thủy sản tươi (nghêu, sò, mực...) - Túi nilon dập mẫu - Dịch vi khuẩn Clostridium perfringens kiểm chứng - Cồn 96o - Túi kỵ khí Gaspak 3. Tiến hành thí nghiệm * Phương pháp SPS 3.1. Cách ủ mẫu - Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 225ml dung dịch BPW bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1. - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn. 3.2. Cấy và ủ mẫu - Lấy 1ml mẫu đã pha loãng, đồng nhất cho vào đĩa petri - Cho 15 - 20 ml thạch SPS vào mỗi đĩa, đảo đĩa, trộn đều. Để đông lại - Lật úp đĩa, để trong bình kỵ khí. Ủ 35 - 370C trong 24h. 3.3. Đọc kết quả - Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường kính 3mm). 3.5. Tính toán kết quả Số khuẩn lạc trong 1g mẫu bằng trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có trong 2 ống nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10. * Phương pháp Wison Blair cải tiến 3.6. Chuẩn bị mẫu phân tích tại phòng thí nghiệm - Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 225ml dung dịch BPW bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1. - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn. 3.7. Cấy và ủ mẫu - Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp. Cho 10ml dung dịch pha loãng (mỗi nồng độ 2 ống) vào ống nghiệm có chứa môi trường Wilson Blair cải tiến làm nguội ở 45oC. Cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 và 5 giọt phèn sắt 5%. Tiếp tục làm như sau: - Lắc đều - Đun cách thủy 75oC, 15 phút - Làm đông nhanh - Ủ 37oC trong bình kỵ khí trong thời gian 18 - 24 giờ 3.8. Đọc kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường kính 3mm). 3.9. Tính toán kết quả Số khuẩn lạc trong 1g mẫu bằng trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có trong 2 ống nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10. 4. Những điểm cần lưu ý - Phèn sắt và Na thiosulfat cần pha riêng rẽ và bổ sung sau khi hấp tiệt trùng. - Chủng Clostridium perfringens là loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trong quá trình thực hành. Mang khẩu trang và găng tay để tránh bị xâm nhiễm. Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ và môi trường nuôi cấy cần được hấp tiệt trùng cẩn thận sau khi thí nghiệm. - Để kết quả phân tích chính xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất cả các bước thử nghiệm. 5. Báo cáo thực tập - Trình bày đặc tính sinh lý và gây bệnh của Clostridium perfringens? - Trình bày quy trình phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm? - Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa sử dụng trong quá trình phân tích xác định Clostridium perfringens? Quy trình phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm: Đồng nhất mẫu, xử lý mẫu 80oC Cấy trên đĩa với môi trường SPS ở 45oC, lắc đều Bổ sung thêm môi trường SPS Ủ 37oC trong bình kỵ khí, trong 24 – 48 giờ Đếm khuẩn lạc màu đen đường kính khoảng 3mm BÀI 25 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 1. Nguyên tắc Các phương pháp truyền thống phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bao gồm các bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và hàng loạt các thử nghiệm hoá sinh để khẳng định sự hiện diện của một loài gây bệnh nhất định, và thường kéo dài vài ngày đến vài tuần. Trong những năm vừa qua, các phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt hơn nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISAđã được thiết lập. PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh và đặc hiệu mầm bệnh. Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới đang tập trung vào khẳng định khả năng sử dụng PCR như phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm. PCR là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Sự phân tích sản phẩm PCR bằng điện di sẽ cho phép phát hiện vi sinh vật mục tiêu dự trên sự so sánh với các trình tự DNA đặc trưng của vi sinh vật chuẩn. Xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR thường có kết quả độ chính xác rất cao, tính đặc hiệu lớn. Tuy nhiên kết quả cũng còn tùy thuộc trình độ của kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc và việc quản lý chất lượng. 2. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 15 3 Bình tam giác 250ml Cái 1 4 Cốc 100ml Cái 1 5 Bình tia Cái 1 6 Pipette 1ml Cái 5 7 Pipette 10ml Cái 1 8 Micropipette 100-1000μl Cái 1 9 Đầu týp 1000μl Cái 10 10 Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR Cái 5 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Nồi hấp cao áp Cái 1 2 Tủ cấy vô trùng Cái 1 3 Tủ sấy Cái 1 4 Máy dập mẫu Cái 1 5 Bình ủ kỵ khí Cái 1 6 Bếp đun cách thủy Cái 1 7 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1 8 Máy PCR Cái 1 9 Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml Cái 1 10 Máy vortex Cái 1 11 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đế 150 volt Cái 1 12 Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm Cái 1 13 Bộ chụp ảnh trên đèn UV Cái 1 2.2. Môi trường, hóa chất a. Hóa chất * Mồi: Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau : invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Ðệm TE có thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA. * Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x - Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) - Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM - Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM - Tween 20: 0,01% (v/v) - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại) - Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM - Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ - 20oC trong 1 năm. Không nên rã đông và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần. * Thang ADN Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này. * Agarose Sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn 1000 bp. * Ðệm điện di TAE 1x - Tris: 4,84 g - Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: 2 ml - Axit axetic băng: 1,14 ml - Nước cất cho đủ: 1000 ml Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với nước thành dung dịch 1x. * Ðệm tải mẫu 6x - Glyxerol: 30 % - Xanh bromphenon: 0,25 % - Tris: 200 mM - Na2EDTA: 20 mM Các thành phần trên được pha trong nước cất, bảo quản ở nhiệt độ 4oC. * Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml b. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Dung dịch đệm pepton - Pepton (C5H10O5): 10,0g - Natri clorua (NaCl): 5,0g - Ðinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4): 3,6 g - Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4): 1,5g - Nước cất: 1000 ml Hoà tan các thành phần trong nước cất, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phú. pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2 ở 25oC. 2.3. Nguyên liệu khác Mẫu thức ăn đường phố, thịt gà tươi sống, hải sản, trứng và sản phẩm của trứng, rau xà lách, thức ăn gia súc nhiễm vi sinh vật tự nhiên. 3. Tiến hành thí nghiệm 3.1. Lấy mẫu Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng. 3.2. Tăng sinh Nhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm. Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0oC 1,0oC trong khoảng 18 giờ 2 giờ. 3.3. Xử lý mẫu giải phóng ADN Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau: - Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước. - Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại. 3.4. Khuếch đại Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ. - Chuẩn bị ống khuếch đại Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml. Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết. Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước cất vô trùng. - Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau: duy trì nhiệt độ 95oC trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC cho đến khi điện di. 3.5. Ðiện di sản phẩm khuếch đại - Chuẩn bị gel điện di agarose 1% Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE. - Chuẩn bị dịch điện di Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều. - Ðiện di Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vôn. 3.6. Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại - Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di. - Nhuộm gel Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư. - Quan sát, chụp hình Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả. 3.7. Ðọc và giải thích kết quả Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này. Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp. 4. Những điểm cần lưu ý - Mang khẩu trang và găng tay cao su sạch để tránh làm tạp nhiễm sản phẩm PCR - Không điều chỉnh ngoài khoảng thể tích cho phép được hút khi sử dụng các micropipette. - Tuân thủ đúng các bước thao tác khi chuẩn bị phản ứng PCR và khi vận hành máy luân nhiệt PCR. - Phải dùng kính bảo vệ mắt khi quan sát sản phẩm điện di trên gel agarose dưới đèn UV. 5. Báo cáo thực tập - Trình bày nguyên tắc phương pháp PCR trong xác định vi sinh vật của thực phẩm? - Trình bày vai trò của mồi xuôi, ngược trong phản ứng PCR? - Giải thích tại sao phản ứng PCR chỉ nên tiến hành khoảng 35 chu kỳ? - Trình bày nguyên tắc và phương pháp đọc bản điện di sản phẩm PCR? - Trình bày kết quả xác định Salmonella spp. trong mẫu thực phẩm ban đầu bằng phương pháp PCR? TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng. 2010. Thực tập vi sinh cơ sở. NXB Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 2. Trần Văn Minh, Dương Nhật Linh. 2008. Thực tập vi sinh cơ sở. Tài liệu lưu hành nội bộ. Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh. 3. Lê Xuân Phương. 2004. Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại học Đà Nẵng. 4. Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phạm Thị Phượng Trang, Phạm Thi Hồng Tươi. 2001. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh. 5. Trần Linh Thước.2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục. 6. Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual, eighth edition. The McGraw-Hill companies. 7. Harley Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, fifth edition. The McGraw-Hill companies. 8. N.F. Lightfoot, E.A. Maier. 2003. Microbiological Analysis of Food and Water: Guidelines for Quality Assurance. Elsevier Science.