Bài giảng Sinh học phân tử - Chương VI: Cơ chế phiên mã

Cơ chế phiên mã 1 Mối quan hệ giữa kiểu gen và kiểu hình 2 Lý thuyết trung tâm – Central dogma 3 ADN ARN Protein Tái bản Phiên mã ngược Điều hòa Dịch mã Phiên mã Số lượng gen  Genome người: là 25.947 gen  Gen có cấu trúc khảm, bao gồm những đoạn exon xen kẽ những đoạn intron 4 mRNA: tập hợp của nhiều đoạn exon được nối lại, những đoạn intron bị cắt bỏ trong quá trình thành thục nhờ bộ máy sinh học có tên là spliceosome 5 Đặc điểm + Xẩy ra khi có sự biểu hiện hoạt động và điều hòa hoạt động của gen. + Liên quan đến tính đa dạng, biến động trong sự biểu hiện các tính trạng di truyền + Biểu hiện và điều hoà của gen ở mức độ phiên mã, mọi giai đoạn của quá trình phiên mã đều có thể chịu sự biến đổi + Enzyme RNA polymerase, tự tạo được mồi, cần trình tự đặc thù trên DNA là promoter để bọc đặc thù mới tiến hành phiên mã tạo RNA Phiên mã 6 Prokaryote phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời 7 Transcription Phiên mã Eukaryote Phiên mã xảy ra trong nhân Dịch mã xảy ra ở tế bào chất K h á c n h a u 8 Phiên mã G iố n g n h a u + Dựa trên cơ sở ghép cặp bổ sung giữa các bazơ và do 2 enzyme DNA và RNA polymerase hoạt động + Thành phần: 4 NTP, tổng hợp từng nu một + Chiều tổng hợp: 5’ 3’, bắt đầu từ một điểm và kết thúc ở một điểm. + Địa điểm: xẩy ra trong nhân + Do enzyme trùng phân thực hiện. 9 Prokaryote Phiên mã Đặc điểm cấu tạo của enzyme RNA polymerase Protein MW (dalton) Gen Omega 11000 ? Alpha 36000 rpoA Sigma 70000 rpoB Beta’ 151000 rpoC Beta 155000 rpoB 10 Prokaryote Phiên mã Đặc điểm cấu tạo của enzyme RNA polymerase  polypeptide beta : chứa vị trí xúc tác trùng phân để tạo ra RNA, là nơi chất kháng sinh rifampicin bọc vào.  Protein sigma: có chức năng nhận biết promoter và khởi động quá trình tổng hợp RNA RNAP Transcription -10 region RNA polymerase gắn vào promoter thực hiện phiên mã để tổng hợp sợi RNA TTGACA16-19 bp... TATAAT “-35” spacer “-10” Tốc độ phiên mã tối đa của một đoạn DNA (gen) nhất định phụ thuộc vào trình tự các bazơ của promoter 13 Phiên mã Prokaryote 14 Chỉ 1 trong 2 mạch đơn của DNA được dùng làm khuôn để tổng hợp RNA Phiên mã Prokaryote  Dùng mạch nào làm khuôn là do enzyme RNA pol quyết định  Promoter nằm ở phía bên nào của gen sẽ quyết định sợi nào làm nguyên bản và kết quả tạo ra mRNA nào 5’ 5’ 3’ 3’ Template strand +1 Transcription Initiation Site Direction of transcription “Downstream” “Upstream” +2 +3 +4 +5 +6 -1 -2 -3 -4 -5 Hướng tổng hợp RNA: 5’-3’ tương ứng trên sợi đơn nguyên bản 3’-5’ làm khuôn Phiên mã 16 Prokaryote Phiên mã Quá trình phiên mã  Khởi động  Kéo dài  Kết thúc 17 Prokaryote Phiên mã Khởi động • Ở E.coli, RNA polymerase có khối lượng 465 kD, bao gồm 2 , 1 , 1 ', 1  (holoenzyme) •  : nhận biết chính xác trình tự promoter  ‘: bám vào DNA;  bám vào NTPs và kết hợp với yếu tố  • α : cần cho sự nắp ráp các nu và hoạt động của enzyme điều khiển tổng hợp protein 18 Prokaryote Phiên mã RNA polymerase 19 Prokaryote Phiên mã Trình tự 3 promoter của Lac, Trp và BioB operon Hộp pribnov (Hộp TATA) là một đoạn DNA nằm ở phía trước điểm bắt đầu phiên mã của gen cấu trúc sinh vật tiền nhân Tiểu đơn vị  của RNA polymerase bọc lấy, gồm 6 nu, thường có trình tự là 5’-TATAAT-3’ 20 Prokaryote Phiên mã • RNA polymerase có 2 vị trí bám cho NTPs • Giai đoạn khởi đầu: promoter bám vào ATP hoặc GTP (hầu hết các phân tử RNA đều bắt đầu bằng 1 nucleotide purine ở đầu 5') Giai đoạn khởi động 21 Prokaryote Phiên mã RNA polymerase gắn vào promoter theo 2 bước • Bước 1: nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự hộp -35 hình thành một phức hợp "đóng". •Bước 2: trình tự hộp -10 sẽ tháo xoắn dần, tạo ra sợi đơn DNA “mở" dưới dạng tự do, làm khuôn để sinh tổng hợp RNA Giai đoạn khởi động 22 Prokaryote Phiên mã Bước 1 Bước 2 K h ở i đ ộ n g K é o d à i 23 Prokaryote Phiên mã Giai đoạn kéo dài Khi RNA bắt đầu kéo dài từ điểm khởi đầu mạch khuôn được 8 nu thì tiểu cấu tử  của RNA polymerase tách khỏi phức hợp enzyme RNA polymerase tháo xoắn liên tục phân tử DNA khuôn trên theo một chiều dài khoảng 17 nu Sợi RNA mới sẽ tách dần khỏi mạch khuôn DNA trừ một đoạn khoảng 12 nu bắt đầu từ điểm tăng trưởng vẫn còn liên kết với DNA Phần DNA bị tháo xoắn sau sẽ được RNA pol xoắn trở lại 24 Prokaryote Phiên mã 25 Prokaryote Phiên mã Bước 1 Bước 2 K h ở i đ ộ n g K é o d à i 26 Prokaryote Phiên mã Giai đoạn kết thúc Yếu tố rho 1. rho là một ATP-phụ thuộc helicase 2. Rho độc lập Khi RNA polymerase trượt qua hết trình tự kết thúc thì quá trình sinh tổng hợp mRNA bị ngừng, enzyme RNA polymerase sẽ nhả sợi DNA khuôn ra 27 Prokaryote Phiên mã Rho-phụ thuộc trình tự kết thúc phiên mã (phụ thuộc vào 1 protein và 1 trình tự DNA ) G/C -rich site RNAP slows down Rho helicase catches up Elongating complex is disrupted 28 Prokaryote Phiên mã Giai đoạn kết thúc 2) Rho-độc lập - Vị trí kết thúc trên DNA - Vùng giàu G:C, nơi hình thành cấu trúc dạng vòng trên phân tử RNA phiên mã - 6-8 nu A trên DNA phiên mã thành U trên RNA 29 Prokaryote Phiên mã Rho-không phụ thuộc trình tự kết thúc phiên mã (phụ thuộc vào trình tự DNA) 30 Prokaryote Transcription • RNA pol dừng khi gặp trình tự kết thúc. • Hình thành cấu trúc hair-pin • Đoạn RNA giàu U có thể tách ra khỏi sợi khuôn • Phân tử RNA được hình thành và quá trình kéo dài chuỗi kết thúc 31 Prokaryote Phiên mã Quá trình phiên mã tạo mRNA và tổng hợp protein giữa Prokaryote và Eukaryote 32 Eukaryote Phiên mã Đặc điểm Prokaryote Eukaryote Số loại RNA pol tham gia Chỉ có một loại mã cho tất cả các gen Có 3 loại, loại I mã cho rRNA, II cho các mRNA và III cho các tRNA và các RNA nhỏ khác. Phiên mã và dịch mã Phiên và dịch mã đồng thời Phiên mã xong rồi mới tiến hành dịch mã Phiên mã tạo mRNA Tạo ra mRNA chín ngay Phiên mã tạo ra tiền mRNA xảy ra ở trong nhân, cắt các intron đi để tạo ra mRNA chín, gồm các đoạn exon ghép nối lại, rồi đi ra ngoài tế bào chất. Cấu tạo của mRNA Không có cấu tạo phần đầu và đuôi đặc thù Đầu 5’ có đính cap 7 methyl Gppp, đầu này được thêm vào trong quá trình phiên mã. Cap 7 N6 Gppp có thể đóng vai trò định hướng cho ribosome bắt đầu dịch mã ở đúng codon AUG. Đầu 3’ có gắn poly A được đính vào sau khi phiên mã. Riêng mRNA tạo protein histone thì không có đuôi poly A. 33 Eukaryote Phiên mã Tổng hợp protein (dịch mã) Phiên mã và dịch mã tiến hành tại tế bào chất Phiên mã xảy ra ở trong nhân, dịch mã xẩy ra ở tế bào chất, do vậy mRNA chín phải chui qua lỗ nhân để ra tế bào chất. Quá trình khởi động phiên mã Đáp ứng tức thì với những điều kiện môi trường biến đổi Không đáp ứng kịp thời với yêu cấu ngoại cảnh thay đổi vì cấu tạo cơ thể là đa bào và cấu trúc phức tạp giữa proten histone với DNA. Một mRNA Chứa thông tin di truyền của nhiều gen, mã hóa cho nhiều chuỗi polypeptide nên gọi là polycistron Một mRNA mã hóa cho 1 chuỗi polypeptide, mỗi gen phiên mã ra một mRNA. Như vậy 1 gen bao gồm 3 vùng: Vùng đầu 5’ mang các trình tự điều hòa biểu hiện của gen và hoạt hóa quá trình phiên mã, vùng 2 để phiên mã gồm các intron và exon và vùng 3 chưa xác định được chức năng. 34 Eukaryote Phiên mã Ba loại RNA polymerase RNA polymerase I (RNA-PI) tồn tại ở trong nhân, xúc tác cho việc tổng hợp rRNA RNA polymerase II (RNA-PII) đảm nhận tổng hợp các mRNA, có mặt ở trong nhân của tế bào sinh vật nhân thật. Enzyme này có thêm chức năng gắn đuôi poly A nhờ enzyme poly (A) polymerase. RNA polymerase III: xúc tác tổng hợp các RNA nhỏ khác nằm trong nhân và tế bào chất 35 Eukaryote Phiên mã RNA pol II 36 Eukaryote Phiên mã Giai đoạn khởi động TATA -25 -75 37 Eukaryote Cơ chế khởi động RNA polymerase nhờ các nhân tố phiên mã TF - Phức hợp TFIID ngắn vào hộp TATA qua tiểu đơn vị TBP - Sau đó TFIID gắn ổn định được là bởi phối hợp thêm với TFIIA -Tiếp đến TFIIB và TFIIH kết hợp để cùng tạo thành phức enzyme với RNA polymerase tại TATA - Cả phức hợp RNA polymerase II,TFIIE và TFIIF được định hình bởi TFIIB và đầu tụ tập carboxyl được bọc bởi TFIID (TFIID- bound CTD) - Quá trình phiên mã bắt đầu xảy ra 38 Eukaryote Transcription Giai đoạn kéo dài Quá trình này tiến hành từ nhân tố TFIIF : đính từng nu một vào đầu OH của C3’ của đường ribose và chuỗi mRNA sẽ kéo dài từ đầu 5’  3’ và giải phóng ra hợp chất cao năng NDP. 39 Eukaryote Phiên mã Giai đoạn kết thúc Model for Pol I termination. Reb1p RNA polymerase I U-rich If the Reb1p binding site in the DNA is replaced with the binding site for E. coli Lac repressor, Lac repressor protein will induce termination in an in vitro transcription reaction. Xảy ra tại trình tự kết thúc đặc thù (specific terminator sequence) ở trong phân tử DNA khuôn Protein Reb1p Trình tự kết thúc của RNA pol I: vị trí bám của Reb 1p 40 Eukaryote Phiên mã Trình tự kết thúc của RNA pol III liên quan đến vùng giàu G - C Ở hầu hết các sinh vật tiền nhân, tận cùng của mRNA đều có trình tự 5’UUUUUUA 3’, chứng tỏ trình tự 3’AAAAAAT 5’ của DNA sợi sense chắc chắn là trình tự điều khiển quá trình kết thúc phiên mã Quá trình phiên mã tiến đến trước điểm tạo đuôi poly(A) một đoạn khá xa thì xẩy ra cơ chế có liên quan đến việc hình thành cấu trúc dạng kẹp tóc (hairloop structure) tiếp ngay sau đó là vùng giàu CG 41 Eukaryote Phiên mã Quá trình trưởng thành của tiền mRNA sinh vật nhân thật (maturation) Cắt bỏ một số lượng lớn các đoạn intron của tiền mRNA tạo thành mRNA thường nhỏ hơn đoạn DNA gen, chỉ gồm các đoạn exon 42 Eukaryote Phiên mã Gắn nhóm 7 methyl guanosine (mRNA cap) vào đầu 5’ của phân tử mRNA Rat1: exonuclease 43 Eukaryote Phiên mã Gắn một trình tự dài khoảng 200 adenin nucleotide (poly A tail) vào đầu 3’ của phân tử mRNA, quá trình này được xúc tác bởi enzyme poly A polymerase 44 Eukaryote Phiên mã Quá trình cắt, ghép nối và tạo mRNA chín - Cắt bỏ trình tự leader (leader sequence) là đoạn không dịch mã của tiền mRNA tính từ nu bắt đầu phiên mã đầu 5’ đến codon đầu tiên (dịch mã). - Cắt bỏ những trình tự không mã hóa (noncoding sequence hoặc intervening sequence hay intron) chúng nằm ở giữa những đoạn mã hóa exon 45 Eukaryote Phiên mã Ở 2 đầu intron có chứa trình tự 2 nucleotit: Exon (GTintronAG) exon 46 Eukaryote Phiên mã Các kiểu cắt nối RNA Kiểu 1: những intron của tiền tRNA được cắt chính xác bởi enzyme endonuclease và nối lại bởi hoạt tính của những enzyme cắt và nối đặc thù Kiểu 2: Intron của tiền mRNA nhân và tiền rRNA của Tetrachymena thermophila tự động cắt bỏ bởi phản ứng tự hoạt của chính phân tử RNA đó chứ không không cần hoạt tính enzyme protein nào khác Kiểu 3: Những intron của tiền mRNA nhân được cắt bỏ qua 2 bước phản ứng tiến hành bởi những nhân tố phức hợp, Ribonucleo-protein gọi là spliceosome. 47 Eukaryote Phiên mã Cơ chế tự cắt bỏ intron của tiền rRNA và sự cuộn tròn sau khi cắt của intron nhờ cộng nhân tố guanosine và trình tự exon 48 Eukaryote Phiên mã Quá trình cắt ghép nối tiền mRNA Bước 1: cắt tại vị trí đầu 5’ của intron (GT intron) và hình thành nên cầu nối liên kết phosphodiester giữa cacbon 5’ của G vị trí cắt và cacbon số 2’ của nu A thuộc hộp PyPyPuAPy gần đầu 3’ của intron. Bước này xảy ra do một cơ quan tử có tên gọi là spliceosome tiến hành, quá trình này cần năng lượng thu được qua quá trình thủy phân ATP. 49 Eukaryote Phiên mã Sơ đồ cắt intron của tiền mRNA 50 Eukaryote Phiên mã Bước 2: hình thành một cấu trúc lariat (dây thòng lọng) đoạn intron được cắt bỏ, 2 đoạn exon được nối lại với nhau 51 Eukaryote Phiên mã Cấu trúc Spliceosome: U1, U2, U4, U5, U6 + protein