Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật: Kĩ thuật và ứng dụng - Bài 5: Bảo quản đông lạnh tế bào (Phần 2) - Vũ Bích Ngọc

12/2/17 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 1 Dịch vụ làm đông lạnh cơ thể người chết để chờ hồi sinh •  Gần 1000 người trên thế giới đã chọn cách bảo quản lạnh cơ thể sau khi chết để chờ cơ hội tái sinh trong tương lai. Khi "khách hàng" đã chết về mặt pháp y, nhân viên Alcor chuyển họ lên giường lạnh và dùng thiết bị hồi sức tim phổi làm cho máu lưu thông khắp cơ thể một lần nữa. Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay thế. Cuối cùng, các nhân viên tiến hành làm lạnh thi thể 0,5 độ C mỗi giờ cho đến khi đạt tới nhiệt độ của nitơ lỏng -160 độ C sau 2 tuần. Tiếp đó, họ cho các thi thể vào tủ đông lạnh hình trụ trong tư thế đầu lộn xuống. Bọ cánh cứng Alaskan •  Sản xuất chất chống đông sugary carbohydrate có tên xylomannan (polymer đường của xylose và mannose sugars). •  chịu được nhiệt -100 0C 1949 Polge, Parks và Smith Sperm Human red blood cells 1950 Smith GLYCEROL Dimethyl sulfoxide- DMSO 1959 Lovelock and Bishop TĂNG CƯỜNG TÍNH THẤM •  là quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn của các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi. •  Quá trình ổn định vật liệu sinh học ở nhiệt đô cực thấp được gọi là bảo quản đông lạnh. Hoạt động biến dưỡng tế bào ngưng lại là một điều kiện tiên quyết trong quy trình bảo quản tế bào Tất cả nước trong hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biến dưỡng ngưng Nguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào là làm cho tế bào mất đi một lượng nước nhất định nhằm hạn chế tình trạng đóng băng trong quá trình làm lạnh. Sử dụng chất bảo quản đông lạnh •  Áp lực chọn lọc khiến dòng tế bào bất ổn về đặc tính •  Sự giới hạn về khả năng tăng sinh của tế bào •  Sự bất ổn trong kiểu gen và kiểu hình •  Sự nhiễm chéo, nhiễm khuẩn trong nuôi cấy •  Sự tương đồng trong thí nghiệm •  Tiết kiệm thời gian và vật liệu YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỐNG- CHẾT CỦA TẾ BÀO Chất bảo quản Nhiệt độ Tốc độ làm lạnh Quy trình đông lạnh- rã đông Môi trường đông lạnh-chất bảo quản ! Môi trường cơ bản: DMEM, IMDM, RPMI, . ! Huyết thanh ! Kháng sinh ! Chất bảo quản (CPA): glycerol, DMSO VD: DMEM/F12; 20-40%FBS, 5-10% DMSO, 1% Antibiotic-antimycotic Chất bảo quản đông lạnh (CPA) •  là chất được dùng để bảo vệ mô/tế bào khỏi các tổn thương do đông lạnh (tổn thương do tạo đá ). •  Các chất có thể thâm nhập dễ dàng vào tế bào và thường không độc hại cho tế bào. –  glycerol và DMSO được sử dụng rộng rãi –  giảm nồng độ các chất điện giải trong suốt quá trình đóng băng –  giảm mức độ co tế bào do thẩm thấu ở nhiệt độ thấp •  Các chất tan không thấm qua màng: đường và các hợp chất có phân tử lượng cao như polyvinylpyrrolidone, hydroxyethyl starch, polyethylen glycol và dextrans. •  chất bảo quản không thấm có thể góp phần tăng cường sự thuỷ tinh hoá dung dịch, ổn định protein và màng, ngăn chặn sự tiến triển trong hình thành tinh thể đá 4oC ——> 2 giờ -40oC ——> Một vài ngày -80oC ——> Một vài tháng Nhiệt độ thấp có khả năng "làm chậm thời gian" hoặc thậm chí dừng lại thời gian” sinh học. -196oC " một vài thế kỷ •  -50C, cả tế bào và môi trường quanh nó chưa bị đóng băng. •  -50C đến -150C, đá ngoại bào hình thành. Tế bào ở trạng thái “siêu lạnh” (supercool) •  Ở thấp hơn -1200C, phản ứng hoá học không thể xảy ra đối với cơ thể sống. •  Ở -1960C, phản ứng liên quan đến nhiệt không thể xảy ra vì năng lượng nhiệt không đủ, do đó, tế báo có thể được lưu trữ ở nhiệt độ này trong nhiều thế kỷ. Tốc độ làm lạnh Chuẩn hoá thời gian hạ nhiệt Bảo quản đông lạnh Đông lạnh Bổ sung CPA Kiểm soát tốc độ Vận chuyển của nước Kiểm soát 2 tiêu chí Kết quả đông lạnh tốt nhất Cách tiếp cận hiệu quả để tối ưu hoá bảo quản đông lanh 2 tiêu chí: (1) sự tạo tinh thể đá và (2)thay đổi thể tích tế bào Optimal You hurt me. Quy trình đông lạnh quá chậm Tế bào sẽ mất nhiều nước Thể tích tế bào trở nên quá nhỏ Tế bào sẽ bị tổn thương nghiêm trọng Why it’s me? Optimal Nếu đông lạnh quá nhanh, tế bào mất rất ít nước nước được giữ trong tế bào trở thành tinh thể đá, thể tích tế bào có thể không đổi, thậm chí lớn hơn Tế bào chịu tổn thương nghiêm trọng do sự tạo đá nội bào I am Lucky. Optimal Thời gian đông lạnh phù hợp, tế bào giữ được điều kiện tốt nhất cho sự sống sót Tốc độ làm lạnh có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành đá nội bào Nuôi cấy/chuẩn bị tế bào Bổ sung chất bảo quản Làm lạnh Lưu trữ Rã đông phục hồi tế bào Nuôi tăng sinh •  Kính hiển vi đảo ngược •  Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II •  Máy ly tâm •  Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2) •  Tủ mát 2-80C •  Tủ âm 00C đến -200C •  Bình chứa nitơ lỏng •  Tế bào được nuôi cấy trong Flask hoặc dụng cụ nuôi phù hợp •  Trypsin/EDTA 0,25% •  PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-) •  Môi trường đông lạnh tế bào: bao gồm môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM) bổ sung 40-50% huyết thanh thai bò (FBS), 5-10% dimethylsulphoxide (DMSO) •  ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml •  Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng Kiểm tra dòng tế bào về sự ổn định và nhiễm. Tế bào được nuôi lại để đảm bảo ở pha log của tăng trưởng. Dán nhãn cryotubes với tên dòng tế bào, số lượng tế bào/ lọ, ngày Xác định tỉ lệ tế bào sống chết Chuẩn bị tế bào trước đông lạnh Đông lạnh tế bào Thu tế bào đơn Bổ sung từ từ (nhỏ giọt) môi trường đông lạnh chứa chất bảo quản đông lạnh (DMSO nồng độ 5-10%) vào ống chứa tế bào sao cho mật độ tế bào từ 106 đến 107 tế bào/vial Làm lạnh tế bào theo quy trình phù hợp Lưu giữ tế bào ở nhiệt độ -80 đến -1960C Thu nhận và chọn lọc nguồn Thêm chất bảo quản đông lạnh (CPAs) Đông lạnh mẫu, thường từ -80 hoặc -120oC Chất bảo quản đông lạnh (CPA) --là chất được dùng để bảo quản mô/tế bào khỏi các tổn thương do đông lạnh (tổn thương do tạo đá ). VD: glycerol, DMSO liquid nitrogen (-196oC), và bảo quản trong thời gian dài Các bước cơ bản cho bảo quản đông lạnh mô/tế bào LÀM LẠNH CỰC NHANH Chuyển nhanh tế bào vào ni tơ lỏng LÀM LẠNH CHẬM (3 BƯỚC) chuyển tế bào vào tủ mát 4-80C trong 30 phút chuyển vào tủ đông -200C trong 120 phút Chuyển sang -800C, để qua đêm Chuyển vào bình ni tơ lỏng LÀM LẠNH THEO CHƯƠNG TRÌNH Đặt tế bào vào hệ thống làm lạnh theo chương trình cài đặt hệ thống làm lạnh với thông số nhiệt độ và thời gian làm lạnh tương ứng chuyển vào bình ni tơ lỏng •  Ở tốc độ làm lạnh cực nhanh và độ nhớt cao, tế bào không hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào. •  việc kiểm soát độ nhớt mong muốn cần phải được khảo sát và chuẩn hoá. •  phương pháp đã thành công cho tế bào tinh trùng, trứng, phôi và tế bào gốc phôi. •  Nhiệt độ khởi động: 40C hoặc RT •  Tốc độ hạ nhiệt: làm lạnh -10C mỗi phút và hạ nhiệt đến •  nhiệt độ đạt dưới -1000C, có thể đặt trực tiếp vào ni tơ lỏng •  cọng rạ hoặc các lọ chứa được làm lạnh bằng nitrogen •  Các loại tế bào khác nhau có thể đòi hỏi tốc độ làm mát khác nhau Các tế bào cần được làm tan nhanh chóng và sau đó pha loãng từ từ vào môi trường tăng trưởng. Chuyển một ống tế bào 1ml vào ống ly tâm 15 ml. Thêm từ từ (nhỏ giọt) 10ml môi trương ấm. DMSO có thể gây độc cho tế bào " nên thay môi trường nhanh. Có thể thay DMSO bằng glycerol Rã đông tế bào Lấy mẫu đông lạnh khỏi bình chứa nito lỏng Làm ấm tế bào đông lạnh trong bể ổn nhiệt Loại bỏ CPA khỏi mẫu đông lạnh Ứng dụng lâm sàng 37oC Water Bath Các bước cần thiết để rã đông mô/tế bào và chuẩn bị cho sử dụng lâm sàng •  làm tan nhanh tinh thể đá có thể cứu được nhiều tế bào vì có thể ngăn chặn được sự tăng trưởng của tinh thể đá nhỏ thành tinh thể đá lơn hơn (tái kết tinh) trong tế bào (-5 đến -15 độ). •  1 số nghiên cứu cho thấy làm ấm chậm có hiệu quả tối ưu cho các mẫu đông lạnh lậm •  tế bào nhạy cảm với việc phình ra hơn so với việc co nên việc loại bỏ chất bảo quản có thể gây hư hại tế bào nhiều hơn so với việc bổ sung (ASTT) •  trong quá trình rã đông, môi trường chứa chất bảo quản thường được pha loãng trước khi loại bỏ hoàn toàn khỏi tế bào •  tế bào bám dính, việc thao tác rã đông đơn giản hơn với việc loại bỏ môi trường đông lạnh khỏi lớp đơn tế bào và bổ sung môi trường nuôi tế bào mới. •  huyền phù tế bào, ly tâm để tách tế bào khỏi môi trường có chất bảo quản đông lạnh •  Bể ổn nhiệt •  Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II •  Máy ly tâm •  Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2) •  Ống chứa tế bào đông lạnh •  Môi trường rã đông: bao gồm môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM) bổ sung 20-30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm •  Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng •  Flask nuôi tế bào •  Tế bào từ các bình bảo quản đông lạnh (ở nhiệt thập cực thấp) nên được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt (370C) để tránh tối đa sự tái kết tinh tinh thể đá •  Các thao tác trên tế bào nên được thực hiện nhẹ nhàng để tránh gây tổn thương cho tế bào. •  Sau khi rã đông 1 ngày, tỷ lệ tế bào chết chiếm một số lượng đáng kể, nên thay môi trường mới để loai bỏ tế bào chết. Ủ ấm môi trường nuôi tế bào ở 370C và chuyển vào tủ thao tác vô trùng Lấy ống tế bào từ bình ni tơ lỏng, chuyển ngay vào bể ổ nhiệt ở 370C, ủ đến khi dung dịch tan băng trên 70% (tránh cho nước dính vào nắp cryovial, có thể gây nhiễm khuẩn) Nhẹ nhàng hút chuyển tế bào sang ống ly tâm 15 ml Nhẹ nhàng bổ sung thêm môi trường rã đông với tốc độ 6-10 ml môi trường rã đông trong 2 phút, trộn nhẹ Ly tâm ở tốc độ 1.500-3.000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ môi trường có chứa DMSO, thu tế bào Tái huyền phù tế bào trong môi trường rã đông hoặc môi trường chuyên biệt Phần tế bào còn lại trong ống ly tâm có thể sử dụng để kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào Chuyển huyền phù tế bào vào Flask nuôi và tiến hành nuôi trong tủ nuôi tế bào ở điều kiện phù hợp