Bài giảng Công nghệ Protein-Enzyme - Chương 3: Các phương pháp nghiên cứu protein/enzyme

9/18/2020 1 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PROTEIN/ ENZYME Chƣơng 3  Mục đích • Để làm gì? • Số lượng bao nhiêu? • Độ tinh sạch như thế nào?  Đối tƣợng • Thu nhận từ đối tượng nào? • Đối tượng đó như thế nào? • Có thỏa mãn được “mục đích” không?  Xây dựng quy trình • Cần những nhóm phương pháp? • Các phương pháp có tính khả thi không? • Nhóm phương pháp phù hợp nhất là gì? 9/18/2020 2  Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme • Phá tế bào • Loại bỏ tạp chất • Phân tách protein/ enzyme • Bảo quản protein/ enzyme  Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp • Tách dòng • Biểu hiện và tinh sạch  Cải biến protein/ enzyme  Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng Các nội dung chính trong nghiên cứu protein/ enzyme Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme Protein nội bào Protein ngoại bào Định tính và định lượng Phá vỡ tế bào Loại bỏ tạp chất Bảo quản Tinh sạch 9/18/2020 3 Protein ngoại bào (Extracellular proteins) Những protein được tổng hợp trong tế bào sau đó tiết ra ngoài môi trường ngoại bào để thực hiện các chức năng sinh học của tế bào và cơ thể: • Protein tham gia truyền tín hiệu ngoại bào: hormone, cytokine, chemokine • Các enzyme tiêu hóa: trypsin, pepsin • Protease ngoại bào: Cathesin • Kháng thể dịch thể Trypsin (EC3.4.21.4) và Chymotrypsine (EC3.4.21.1) 9/18/2020 4 • Trypsin và chymotrypsin là 02 enzyme phổ biến của hệ tiêu hóa, sinh ra từ tuyến tụy sau đó tiết vào dịch ruột non. • Trypsin thuộc nhóm serine protease, nó thường cắt các chuỗi peptide tại vị trí cacboxyl của lysine hoặc arginine (ngoại trừ trường hợp sau amino acid này là proline). • Chymotrypsin thường cắt các liên kết peptide tại vị trí cacboxyl của một số amino acid kị nước có kích thước lớn như tyrosine, triptophan, phenylalanine Pepsin (EC3.4.23.1) • Pepsin thuộc nhóm aspartate protease, sinh ra ở trong dạ dày. Cùng với Trypsin và Chymotrypsin là 03 enzyme thuộc nhóm phân giải protein được tìm thấy dưới dạng tinh thể trong hệ tiêu hóa. • Pepsin thường cắt hiệu quả đối với các liên kết peptide tạo ra giữa Amino acid kị nước và Amino acid thơm như tyrosine, triptophan, phenylalanine. 9/18/2020 5 9/18/2020 6 • Thu dịch nuôi cấy: Ly tâm  loại bỏ tế bào  Dịch enzyme ngoại bào • Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, chi phí thấp 9/18/2020 7 Protein nội bào (Intracellular proteins) • Nghiền đồng thể • Siêu âm • Dùng áp suất • Nghiền với cát, hạt thủy tinh • Vortex mạnh với các hạt thủy tinh • Xử lý bằng enzyme: lysozyme • Sử dụng: chất hoạt động bề mặt (SDS) Phá vỡ tế bào: Tùy thuộc vào tính chất của mỗi loại tế bào mà sử dụng phương pháp phù hợp 9/18/2020 8 9/18/2020 9 9/18/2020 10 Các chất hoạt động bề mặt • Ionic (cation hoặc anion): SDS, LiDS Protein  các subunit (gây biến tính)  xác định Mw • Nonionic: Triton X-100, Tween 20  tách phức hợp protein (ít gây biến tính) (có khả năng kết tủa). • Zwiterionic: CHAPS  hạn chế protein-protein interaction  ít gây biến tính protein. Thao tác với protein enzyme • Ở nhiệt độ thấp 40C • Giảm thiểu các bước trong quy trình tách chiết, tinh sạch • Bảo quản trong các đệm chiết phù hợp và có mặt các chất ức chế protease (PMSF, EDTA) • Các chất thường dùng trong quá trình bảo quản (albumin, glycerol, PEG) 9/18/2020 11 Các thành phần thƣờng gặp trong dung dịch đệm tách chiết protein: • PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mM): Ức chế protease • HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, 50 mM , pH 7.5): Là phân tử lưỡng điện hữu cơ, dùng để tạo dung dịch đệm, duy trì pH. • EDTA (5 mM): Ức chế protease • EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid, 5 mM): tạo phức với một số ion kim loại như Ca2+, Mg2+. Thường sử dụng trong biểu hiện và tinh sạch protein. • Na3VO4 (Sodium orthovanadate, 1 mM): Là chất ức chế tyrosine phosphatases, alkaline phosphatases and ATPases. • NaF (25 mM): Là chất ức chế Ser/Thr and acidic phosphatases • DTT (Dithiothreitol, C4H10O2S2 , 2 mM): Cắt các liên kết disulfide trong phân tử protein • Glycerol (5%): Tạo môi trường ổn định cho protein • Triton X-100 (1%): Liên kết các cấu trúc màng • Chất ức chế protease khác Đệm tách chiết protein (Protein extraction buffer) Các chất ức chế protease (Protease inhibitors)  Là các phân tử có khả năng úc chế hoạt động chức năng của protease, trong tự nhiên các chất ức chế này thường là các phân tử protein.  Phân loại protease: theo loại protein mà nó ức chế hoặc theo cơ chế tác động.  Protease Inhibitor Cocktails: Là hỗn hợp các chất ức chế đã được thương mại hóa, mỗi sản phẩm sẽ ức chế một nhóm protease khác nhau. Các chất tạo phức (chelating bond): Ethylenediamine Serpin (serine protease inhibitor) 9/18/2020 12 • Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF): Ức chế một số serine protease bằng cách tạo phức không thuận nghịch với các enzym này. Chất này khi tan trong nước sẽ nhanh chóng bị phân giải, khi sử dụng nên hòa tan trong các dung môi như ethanol, isopropanol, DMSO • Ethylenediaminetetraacetate (EDTA): Ức chế metalloprotease thông qua việc tạo phức với một số ion kim loại như Ca2+, Fe3+ • Pepstatin A: ức chế aspatyl protease như pepsin, renin, cathepsin D, chymosin. Chất này không tan trong nước, chloroform, benzen nhưng tan trong methanol, ethanol hoặc DMSO khi có mặt acetic acid. • Leupeptin (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal): Là chất ức chế được tìm thấy trong tự nhiên ức chế cysteine, serine vàthreonine protease (papain, plasmin) • Aprotinin: Ức chế một số serine protease đặc biệt là plasmin, trypsin, chymotrypsin. Giới thiệu một số chất ức chế Cô đặc dung dịch protein • Tủa • Bay hơi ở áp suất thấp • Ly tâm dùng màng bán thấm • Thẩm tích 9/18/2020 13 Tủa • Muối trung hòa: (NH4)2SO4  thẩm tích loại muối • Dung môi hữu cơ (aceton, ethanol 80%): Nhanh  biến tính • pHi:  khó xác định chính xác pH Bay hơi ở áp suất thấp • Speed Vac (Vacumm) 9/18/2020 14 Ly tâm dùng màng bán thấm Thẩm tích (dialysis) 9/18/2020 15 Bảo quản protein/ enzyme • Phụ thuộc vào mục đích sử dụng • Thời gian ngắn (giữ hoạt tính enzyme, khả năng biến tính thấp): 1-7 ngày ở 40C • Thời gian dài (> 7 ngày): giữ ở 40C dưới dạng tủa với (NH4)2SO4 hoặc -80 0C. • Đông khô • Bảo quản trong glycerol, albumin, PEG Các chất cho bảo quản Albumin: Bổ sung trong các dung dịch đệm, tăng độ bền và ổn định cấu trúc protein/ enzyme  Pha loãng các dung dịch protein, enzyme Glycerol: • Chống đóng băng (dùng trong bảo quản protein enzyme lâu dài) • Tương tự Ethylene glycol, propylene glycol khi tan trong nước  phá vỡ các liên kết H giữa các phân tử H2O  không thể hình thành cấu trúc kết tinh. • 60-70% glycerol  đóng băng ở -37.80C • Thường sử dụng làm dung môi cho các enzyme 9/18/2020 16 Dung dịch đệm • Là hỗn hợp axit yếu và base liên hợp của nó • pH của dung dịch chỉ thay đổi không đáng kể khi cho một lượng nhỏ axít hoặc kiềm vào. • Ít tương tác đến các phản ứng enzyme • Làm bền enzyme pKa • Hằng số phân ly acid (Ka) HA  A− + H+ • Giá trị pKa càng lớn  khả năng phân ly càng thấp • Dung dịch đệm tốt khi pH ~ pKa  Đệm axit, đệm kiềm 9/18/2020 17 Chọn dung dịch đệm nhƣ thế nào ? • Giá trị pH ~ pKa • Mức thay đổi pH phụ thuộc vào độ pha loãng • Lưu ý ảnh hưởng của nhiệt độ • Khả năng hòa tan (protein enzyme quan tâm) • Khả năng tương tác với các thành phần khác có trong dung dịch, phản ứng enzyme • Khả năng hấp thụ UV (đo quang phổ) • Mức độ thấm qua màng sinh học (tương tác hay không tương tác với tế bào) • Chi phí Lƣu ý khi chọn dung dịch đệm • Nồng độ: 50 mM  thử đầu tiên • pH: tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm • Loại đệm: cationic hoặc anionic buffer (sắc ký trao đổi ion). Tris  cationic  trao đổi anion. PBS  anionic  trao đổi cation. • Khi làm việc ở pH sinh lý (với tế bào, mô)  MES, PIPES, MOPS (Good’s buffer). 9/18/2020 18 Đệm phosphate • Phạm vi pH 8-11 • Tủa hoặc gắn với nhiều cation đa trị • Ức chế 1 số enzyme (kinase, phosphatase, dehydrogenase) • pH thay đổi khi pha loãng • Dễ bị nhiễm khuẩn Đệm Tris • Khả năng đệm kém khi pH < 7,0 • Chứa nhiều nhóm NH2 có khả năng phản ứng • Ảnh hưởng đến nhiều phản ứng enzyme (xúc tác bởi alkaline phosphatase (dephosphoril hóa) • Thấm qua màng sinh học (tương tác) • pH chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và độ pha loãng 9/18/2020 19 Đệm Acetate • Phạm vi pH đệm hẹp (4-6) • Không sử dụng được với các hệ thống tế bào Đệm Citrate • Có khả năng gắn tạo phức với một số protein (phức kim loại). • Ít sử dụng với các hệ thống tế bào 9/18/2020 20 Đệm MOPS • Không gây ảnh hưởng đến sinh lý tế bào • Ảnh hưởng đến phản ứng Lowry (Bradford không bị ảnh hưởng). • Đắt Đệm HEPES • Không gây ảnh hưởng đến sinh lý tế bào • Ảnh hưởng đến phản ứng Lowry • Tạo ra các gốc tự do  ảnh hưởng đến các phản ứng oxy hóa khử 9/18/2020 21 Đệm Borate • Tạo phức với các mono, oligosaccharide, nucleic acid, pyridine nucleotide. • Tương tác với glycerol • Ít dùng với hệ thống tế bào Cách bảo quản dung dịch đệm • Pha nồng độ cao • Tách riêng acid và base liên hợp • Giữ lạnh (40C) • Khử trùng (hấp, lọc) 9/18/2020 22 Các phƣơng pháp phân tách protein/ enzyme  Dựa vào tính mang điện của protein/ enzym • Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) • Điện di (Electrophoresis) • Tạo vùng đẳng điện (Isoelectric focusing)  Dựa vào tính phân cực của protein/ enzym • Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography) • Sắc ký giấy (Paper Chromatography) • Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography) • Sắc ký ngược pha (Reverse-phase Chromatography) • Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography)  Dựa vào kích cỡ của protein • Thẩm tích và siêu lọc (dialysis and ultrafiltration) • Điện di trên gel (Gel Electrophoresis) • Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) • Ly tâm siêu tốc (Ultracentrifugation)  Sắc ký gắn ái lực (Specificity of binding-affinity chromatography) Ly tâm siêu tốc (Ultracentrifugation) 9/18/2020 23 Thẩm tích và siêu lọc (Ultrafiltration) 9/18/2020 24 Sắc ký (Chromatography)  Sắc kí là phương pháp tách các cấu tử được phân bố giữa hai pha: pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định.  Các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.  Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn. Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh.  Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh. 9/18/2020 25 Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) 9/18/2020 26 9/18/2020 27 Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography) Sắc ký giấy (Paper Chromatography) 9/18/2020 28 Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography) Sắc ký ngược pha (Reverse-phase Chromatography) 9/18/2020 29 Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography) Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) 9/18/2020 30 Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography) 9/18/2020 31 9/18/2020 32 Điện di protein trên giấy (Paper electrophoresis) Điện di protein trên gel (Gel electrophoresis): SDS-PAGE 9/18/2020 33 PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 9/18/2020 34 H2O 2.975 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml 10% (w/v) SDS 0.05 ml Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8%) 0.67 ml 10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 0.05 ml TEMED 0.005 ml Thành phần cho 5 ml Stacking gel Acylamide percentage 6% 8% 10% 12% 15% H2O 5.2ml 4.6ml 3.8ml 3.2ml 2.2ml Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 2ml 2.6ml 3.4ml 4ml 5ml 1.5M Tris(pH=8.8) 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml 10% SDS 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 10% (w/v) ammonium persulfate (APS) 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl Thành phần cho 10 ml Running gel Acrylamide % M.W. Range 7% 50 kDa - 500 kDa 10% 20 kDa - 300 kDa 12% 10 kDa - 200 kDa 15% 3 kDa - 100 kDa 9/18/2020 35 25 mM Tris-HCl 200 mM Glycine 0.1% (w/v) SDS Thành phần cho 1X Running Buffer 10% w/v SDS 10 mM Beta-mercapto-ethanol 20 % v/v Glycerol 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v Bromophenolblue Thành phần cho 5X Loading Buffer Nhuộm gel: Sử dụng thuốc nhuộm có Coomassie Brilliant Blue hoặc bạc Protein size marker: Là hỗn hợp các loại protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã được tinh sạch, dùng làm đơn vị chuẩn. 9/18/2020 36 Phân tách theo vùng đẳng điện (Isoelectric focusing) 9/18/2020 37 Điện di protein 02 chiều (Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis) 9/18/2020 1 Công nghệ protein tái tổ hợp (Recombinant Protein Technology) 9/18/2020 2 Ứng dựng của protein tái tổ hợp:  Phân tích các chức năng sinh học  Nghiên cứu tương tác protein-protein  Xác định quan hệ giữa cấu trúc và chức năng  Nghiên cứu, xác định cấu trúc  Nghiên cứu ứng dụng protein trong điều trị  Sản xuất vacxin  Sản xuất enzym  Tạo kháng thể đặc hiệu Các bước chính của quá trình sản xuất protein tái tổ hợp: • Phân lập gen mong muốn (tách dòng) • Chuyển gen mong muốn vào vector biểu hiện • Chuyển vector vào tế bào vật chủ • Tăng sinh tế bào • Tách chiết và tinh sạch protein 9/18/2020 3  Sản xuất protein tái tổ hợp như thế nào? (Lựa chọn các hệ thống biểu hiện protein: vector biểu hiện, vật chủ)  Bằng cách nào để biểu hiện được cấu trúc DNA tái tổ hợp? (Quá trình phiên mã và dịch mã xảy ra thế nào, lựa chọn promoter, tag-fusion)  Protein tái tổ hợp sẽ được biểu hiện ở đâu trong tế bào? (Nội bào, ngoài bào, thể vùi hay dịch tiết)  Những vẫn đề phát sinh trong quá trình biểu hiện và tinh sạch Tách dòng (Cloning) 9/18/2020 4 Vector tách dòng (Cloning vector) Lực chọn hệ thống biểu hiện căn cứ vào kích thước và đặc tính của protein – Các protein lớn (>100 kDa) Nên chọn eukaryote – Các protein nhỏ (<30 kDa) Nên chọn prokaryote – Các protein cần thiết phải có quá trình Glycosylation? Nên chọn baculovirus hoặc tế bào động vật – Cần năng suất cao, chi phí thấp ? Nên chọn E. coli – Các protein cần thiết phải có quá trình điều hòa sau dịch mã? Nên chọn nấm men, baculovirus hoặc các tế bào eukaryote 9/18/2020 5 Đặc điểm E. coli Nấm men Tế bào động vật Côn trùng Phân giải protein ? ? Y Y Glycosylation N ? Y ? Sự tiết ? Y Y Y Folding ? ? Y Y Phosphorylation N ? Y ? Acetylation N Y Y ? Amidation N Y Y Y Năng suất >50% 1% 30% Một số đặc điểm của các hệ thống biểu hiện thường gặp Hệ thống biểu hiện vi khuẩn • Sinh trưởng nhanh (có thể tạo protein sau 8h nuối cấy) • Năng suất biểu hiện cao (50-500 mg/L) • Thành phần môi trường khá đơn giản nên chi phí thấp • Giá thành sản xuất thấp • Khó biểu hiện các protein lớn (>50 kDs) • Không có quá trình glycosylation hoặc loại bỏ các peptide tín hiệu • Các protein từ Eukaryotic đôi khi gây độc cho vi khuẩn • Không thể biểu hiện các protein giàu liên kết S-S Ưu điểm Nhược điểm 9/18/2020 6 Hệ thống biểu hiện Pichia • Có thể biểu hiện được những protein có kích thước lơn (>50 kDa) • Có quá trình glycosylation và loại bỏ các peptide tín hiệu • Có thể biểu hiện các protein giàu liên kết S-S Những ưu điểm nội trội hơn vi khuẩn • Nấm men là sinh vật nhân thực đơn bào • Mang các đặc điểm giống với hệ thống biểu hiện vi khuẩn nhưng có một số ưu điểm của tế bào nhân thực • P. pastoris là loài nấm men có thể sử dụng methanol như là nguồn carbon (sử dụng alcohol oxidase) • Có promoter rất mạnh cho biểu hiện gen alcohol oxidase (AOX) (~30% protein được tạo ra khi cảm ứng) Hệ thống biểu hiện Baculovirus • Sinh trưởng rất chậm (10-12 ngày để set-up) • Nuôi cấy tế bào chỉ thích hợp trong khoảng 4-5 ngày • Thời gian set-up lâu, không đơn giản như nấm men • Có thể biểu hiện protein lớn (>50 kDa) • Có quá trình glycosylation chuẩn và loại bỏ các peptide tín hiệu • Sản lượng rất cao, chi phí thấp Nhược điểm Ưu điểm • Autographica californica multiple nuclear polyhedrosis virus (Baculoviurs) • Virus này thường nhiễm vào tế bào một số côn trùng • Chúng sử dụng promoter rất mạnh để tăng cường biểu hiện protein vỏ sau khi đã xâm nhập vào trong tế bào 9/18/2020 7 Baculovirus Expression ~12 ngày Hệ thống biểu hiện tế bào động vật • Sự chọn lọc tốn thời gian (Hàng tuần cho việc set-up) • Nuôi cấy tế bào chỉ phù hợp trong những giai đoạn thời gian giới hạn • Quá trình set-up tốn rất nhiều thời gian, chi phí cao, sản lượng khiêm tốn • Có thể biểu hiện protein lớn (>50 kDa) • Có quá trình glycosylation chuẩn và loại bỏ các peptide tín hiệu, tạo ra các prrotein đích thực Nhược điểm Ưu điểm 9/18/2020 8 Hệ thống biểu hiện Ưu điểm Nhược điểm E. coli • Có thể tiến hành đồng thời với tách dòng • Nhanh • Dễ thao tác • Chi phí thấp • Khả năng biểu hiện thấp • Tính hòa tan thấp • Thiếu quá trình cải biến sau dịch mã Cell-free • Nhanh hơn • Skips cell transformation, growing, and lysis • Lượng protein sinh ra thấp • Giá thành cao • Khó khăn trong quá trình tối ưu hóa điều kiện biểu hiện Yeast • Glycosylation • Hiệu quả kinh tế cao • Protein duy trì các liên kết disulfide • Quá trình glycosylation ở mỗi loại tế bào động vật là khác nhau Baculovirus • Thích hợp với hầu hết eukaryote • Sự biểu hiện được giới hạn bởi giai đoạn nhiễm • Quá trình tạo virut gồm rất nhiều bướcnumerous steps • Duy trì số lượng virut cao Tế bào động vật • Là môi trường tự nhiên cho các protein động vật • Lượng protein thấp • Chi phí cao  Vector biểu hiện cần thích hợp với hệ thống biểu hiện (vector từ prokaryote cho tế bào prokaryote, vector từ eukaryote cho tế bào eukaryote)  Cần phải có sự kết hợp tố của các yếu tố: • Promoter mạnh • Có các vị trí gắn cho ribosome • Phải có các trình tự kết thúc dịch mã • Phải có các đuôi ái lực (Affinity tag) hoặc trình tự có khả năng bị hòa tan (Solubilization sequences) • Phải có vùng nhận diện các vị trí cắt của enzym giới hạn (multi- enzyme restriction site). Lựa chọn vector biểu hiện 9/18/2020 9 Các vùng quan trọng trên một vector biểu hiện • Origin of replication (ORI): Trình tự DNA cho phép DNA polymerase thực hiện quá trình tái bản plasmid. • Các marker chọn lọc (Amp or Tet): Đây là một gen, khi nó biểu hiện sẽ cho phép tế bào vật chủ sống sót trên môi trường chọn lọc. • Vùng cảm ứng promoter: Trình tự ADN ngắn giúp tăng cường biểu hiện của gen liền kề. • Multi-cloning site (MCS): Trình tự ADN chữa nhiều vị trí cắt enzym giới hạn khác nhau. • Tag-fusion: Trình tự ADN mã hóa cho một protein hoặc một đoạn polipeptide. 9/18/2020 10 9/18/2020 11 Đuôi ái lực (Affinity tag) Số Aa Trình tự Ái lực với Poly-His Thường là 6 HHHHHH Ni Poly-Arg Thường là 5 RRRRR Cation- exchange Glutatione S-transferase 211 Protein Glutathione Maltose-binding protein 396 Protein Cross-linked amylose Streptavidin binding protein 38 Peptide Streptavidin Calmodulin-binding protein 26 Peptide Calmodulin Chitin-binding protein 51 Protein domain Chitin c-myc 11 EQKLISEEDL Anti-body HA(Hemaglutanin) 9 YPYDVPDYA Anti-body Flag/x3Flag 8/24 DYKDDDK/ DYKDDDK x3 Anti-body T7 11 MASMTGGQQMG Anti-body Một số đuôi liên kết với protein tái tổ hợp (Tag-fusion) thường gặp Small ubiquitin- modifier (SUMO) Glutathione- S-transferase (GST) Thioredoxin N-utilization substrate (NusA) Maltose binding protein (MBP) Vai trò của các Tag-Fusion là gì? 9/18/2020 12 Chuyển gen đích từ vector tách dòng sang vector biểu hiện NcoI HindIII Biến nạp vào tế bào chủ • Biến nạp bằng shock nhiệt • Biến nạp bằng xung điện • Biến nạp bằng súng bắn gen • Biến nạp thông qua tế bào chủ trung gian (Agrobacter) 9/18/2020 13 Phát hiện sự biểu hiện của protein tái tổ hợp 9/18/2020 14 Tinh sạch protein tái tổ hợp 9/18/2020 15 Một số vấn đề trong quá trình sản xuất protein tái tổ hợp  Vấn đề cần quan tâm khi thiết kế mồi?  Làm thế nào để tách Tag-fusion khỏi protein đích?  Ảnh hưởng của tag-fusion đến cấu trúc protein đích? Cách xử lý?  Hướng giải quyết khi protein không biểu hiện?  Cải biến protein tái tổ hợp  Phân tích chức năng protein  Phân tích cấu trúc protein  Phân tích mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng  Phân tích các trung tâm hoạt động  Thiết kế các protein mang đặc tính mới 9/18/2020 16 Transition Đột biến điểm Đột biến đoạn Mất đoạn Đột biến Thêm đoạn Transversion Ngẫu nhiễn (Random) Định hướng (Directed) Đột biến ngẫu nhiên (Random Mutagenese)  Khó xác định vị trí đột biến  Thường sử dụng cho nghiên cứu các gen chưa rõ trình tự, cấu trúc  Tạo thư viện đột biến  Một số phương pháp tạo đột biến chủ yếu • Sử dụng chủng vi khuẩn gây đột biến E.coli XL1red • Sử dụng tia tử ngoại (UV) • Sử dụng phương pháp cải biến hóa học: deamination, alkylation, Base-Analog Mutagens • Sử dụng phương pháp PCR: DNA shuffling, error prone PCR 9/18/2020 17 Chủng vi khuẩn XL1-Red  Chủng vi khuẩn này mang các đột biến thiếu hụt 03 con đường sửa chữa ADN chính: • mutS: Không sửa chữa lỗi bắt cặp không phù hợp (error-prone mismatch repair) • mutD: Thiếu hụt enzyme 3´- to 5´- exonuclease của DNA polymerase III • mutT: Không có khả năng thủy phân 8-oxodGTP  Khi chuyển các gen đích vào vi khuẩn này khả năng sinh ra đột biến cao hơn khoảng 5000 lần so với chủng E. coli bình thường. Tăng tỷ lệ đột biến bằng tia UV 9/18/2020 18 Cải biến hóa học: Khử nhóm Amin (Deamination) Chất gây đột biến thường dùng: HNO2, NaHSO3, NH2OH 9/18/2020 19 Cải biến hóa học: Đột biến Base-Analog 9/18/2020 20 Cải biến hóa học: Alkyl hóa (Alkylation) Chất gây đột biến thường dùng: Ethyl methane sulfonate (EMS), Dimethyl sulfate Phương pháp PCR: DNA shuffling 9/18/2020 21 Phương pháp PCR: Error Prone PCR Đột biến điểm định hướng (Site-Directed Mutagenesis)  Xác định vị trí đột biến  Sử dụng đối với các gen đã biết trình tự  Ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng protein 9/18/2020 22 Các kiểu đột biến điểm định hướng 9/18/2020 23 9/18/2020 24 FUSION-PCR