Bài giảng Công nghệ Protein-Enzyme - Chương 2: Enzyme

•9/18/2020 •1 CHƢƠNG 2. ENZYME • Giới thiệu chung • Phân nhóm enzyme • Cơ chế xúc tác enzyme • Động học phản ứng enzyme • Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme • Sàng lọc cơ chất cho enzyme Một số khái niệm chung • Enzyme là chất xúc tác sinh học, có mặt trong tất cả các cơ thể sống • Chúng thúc đẩy một phản ứng xảy ra mà không có mặt trong sản phẩm cuối cùng. • Ngoại trừ một nhóm nhỏ RNA có tính xúc tác (ribozym), tất cả enzyme đều có bản chất là protein. • Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo của protein. • Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những phân tử L-amino acid liên kết với nhau tạo thành, gọi là enzyme một thành phần • Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành phần. Phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. •9/18/2020 •2 Nhóm ngoại: Có thể là hợp chất hữu cơ (coenzyme) nhƣ vitamin, NAD hoặc ion kim loại Phân loại enzyme/ Enzyme Classification (EC) Cách gọi tên: tên cơ chất đặc hiệu + tên của loại phản ứng + ase Phân loại: enzyme chia thành 06 lớp gồm; • Oxydoreductase: xúc tác cho phản ứng oxy hoá - khử. • Transpherase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị các nhóm từ một phân tử này đến một phân tử khác. • Hydrolase: xúc tác cho phản ứng thuỷ phân cũng là vận chuyển các nhóm chức năng nhưng chất nhận luôn là phân tử nước. • Lyase: xúc tác cho phản ứng thêm các nhóm vào nối đôi, hoặc tạo thành nối đôi bằng cách loại các nhóm. • Isomerase: xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá, chuyển vị các nhóm trong nội bộ phân tử tạo dạng đồng phần. • Ligase: xúc tác cho phản ứng tạo thành liên kết C-C, C-O, C-S và C-N bằng phản ứng ngưng tụ kèm theo phản ứng cắt đứt liên kết giàu năng lượng của các nucleosid trisphosphate, (thường là ATP). •9/18/2020 •3 • Mỗi lớp chia thành nhiều tổ, mỗi tổ chia thành nhiều nhóm, mỗi nhóm có nhiều enzym khác nhau. • Trong bảng phân loại, ký hiệu enzym thường gồm 04 chữ số ngăn cách nhau bởi dấu “.”: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzym. • Ví dụ: enzym mang ký hiệu EC 2.6.1.6 là enzym leucine transaminase thuộc nhóm Transferases (lớp 2), xúc tác phản ứng chuyển vị nhóm có chứa Nitơ (tổ 6/ Transferring nitrogenous groups), nhóm chứa Nitơ đó là nhóm amin từ Leucine (nhóm 6) • Phản ứng: L-leucine+ 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate Giới thiệu hệ thống phân loại enzyme quốc tế •9/18/2020 •4 •9/18/2020 •5 •9/18/2020 •6 •9/18/2020 •7 •9/18/2020 •8 • Xúc tác phản ứng oxy hóa khử. Cơ chất bị oxy hóa được coi là chất cho H. • Tên enzyme: Chất cho: Chất nhận oxidoreductase. • Tên thông dụng sẽ là Dehydrogenase • Tên Reductase cũng có thể dùng trong trường hợp chất nhận là O2 • Con số thứ 2 của các enzyme thuộc nhóm oxidoreductases (ngoại trừ 11, 13, 14 hoặc 15) chỉ nhóm trong chất cho hydrogen sẽ bị oxi hóa: nhóm -CHO-, - CHO hoặc –CO-COOH • Con số thứ 3, ngoại trừ EC 1.11, EC 1.13, EC 1.14 và EC 1.15 chỉ ra dạng chất nhận tham gia vào phản ứng xúc tác: NAD(P)+, Cytochrome, Oxy (O), S-S • Các enzyme thuộc lớp này: dehydrogenases, reductases • Ví dụ: lactate dehydrogenase (NAD+), acyl CoA dehydrogenase (FAD), ketoacyl-ACP reductase (NADPH/H+). Lớp 1. Oxidoreductase •9/18/2020 •9 Dehydrogenase Dehydrogenase: enzyme oxi hóa một cơ chất bằng cách chuyển 1 hoặc nhiều hydride (H-) tới một chất nhận, thường là NAD+/NADP+ hoặc một flavin coenzyme như FAD or FMN. • Aldehyde dehydrogenase (oxy hóa aldehyde) • Acetaldehyde dehydrogenase (chuyển acetaldehyde tới acetic acid) • Alcohol dehydrogenase • Glutamate dehydrogenase (enzyme chuyển hóa glutamate thành α- Ketoglutarate và ngược lại). • Lactate dehydrogenase • Pyruvate dehydrogenase (trong chu trình TCA, chuyển hóa Pyruvate thành Acetyl CoA) • Glucose-6-phosphate dehydrogenase (liên quan đến con đường pentose phosphate) • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (liên quan đến đường phân) Acetaldehyde dehydrogenase • Vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa ethanol • Ethanol ------------------------------ acetaldehyde Alcohol dehydrogenase Acetaldehyde dehydrogenase --------------------------- Acetic acid •9/18/2020 •10 Reductase • Reductase là enzyme xúc tác cho phản ứng khử • Ví dụ một số enzyme reductase • 5-alpha reductase • Dihydrofolate reductase • HMG-CoA reductase • Methemoglobin reductase • Ribonucleotide reductase • Thioredoxin reductase • E. coli nitroreductase • Methylenetetrahydrofolate reductase • Là những enzym vận chuyển nhóm, chẳng hạn: methyl, glycosyl • Tên enzyme: donor: acceptor grouptransferase • Tên thông dụng thường đặt theo acceptor grouptransferase hoặc donor grouptransferase. Chất cho thường là một cofactor (Coenzyme). • Một số phản ứng xúc tác được mô phỏng: X-Y + Z = X + Z-Y • Hoặc chuyển nhóm Y từ X sang Z hoặc cắt đứt liên kết X-Y khi có sự tham gia của Z. • Việc giải thích chỉ mang tính tương đối, vì vậy người ta thường đặt tên theo kiểu Y-transferase. • Các enzyme thuộc lớp này: kinases, aminotransferases, thiolases • Ví dụ: glucokinase (ATP), aspartate aminotransferase (PLP), b-ketothiolase Lớp 2. Transferase •9/18/2020 •11 Glucokinase • Glucokinase (EC 2.7.1.2) là một enzyme xúc tác phản ứng phosphoril hóa Glucose  Gluco-6-phosphate. • Quá trình glucokinase xảy ra ở các tế bào gan, tụy, ruột và não người và các động vật có xương sống. • Đột biến gene mã hóa cho enzyme này sẽ dẫn đến các bệnh đái đường, tụt đường huyết. Aspartate transaminase • Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa thuận nghịch aspartate và alpha- ketoglutarate thành oxaloacetate và glutamate • Enzyme này là một trong những cơ sở để đánh giá chức năng gan. Oxaloacetate + glutamate ⇌ aspartate + α-ketoglutarate •9/18/2020 •12 Lớp 3. Hydrolase • Xúc tác các phản ứng thủy phân • Phổ biến gặp: Peptidase, glycosidase, lipase, phosphatase. • Trypsin, amylase, triacylglycerol lipase, fructose- 1,6-bisphosphatase Peptidase Protease (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) thủy phân protein (liên kết peptide). Có 6 nhóm protease • Serine protease • Threonine protease • Cysteine protease • Aspartate protease • Metalloprotease • Glutamic acid protease •9/18/2020 •13 Serine protease • Trung tâm hoạt động có Serine • Chủ yếu có mặt ở các đường tiêu hóa • Tồn tại dưới dạng zymogen, bị ức chế bởi serine proteinase inhibitors • Thành viên: Nhóm chymotrypsin, subtilisin • Nhóm Chymotrypsin: ở eukaryote gồm Chymotripsin, trypsin, elastase. • Nhóm subtilisin: ở prokaryote Threonine protease • Threnonine proteases là một họ của các enzyme thủy phân protein có chứa Threonine (Thr) trong trung tâm hoạt động. • Là một trong các protease thuộc họ proteasome •9/18/2020 •14 Cystein protease • Cystein protease thường có mặt trong hoa quả: đu đủ, dứa, vả, kiwi. Lượng protease có nhiều khi quả còn chưa chín. Thường dùng làm mềm thịt. • Các cysteine protease có cơ chế xúc tác chung liên quan đến sự có mặt của trung tâm xúc tác chứa nhóm lưu huỳnh của cystein. Phản ức xúc tác xảy ra theo kiểu ái nhân (nucleophill). Aspartic proteases • Aspartic proteases sử dụng gốc aspartate cho việc xúc tác cơ chất. • Enzyme này có 2 aspartate bảo thủ cao ở trong trung tâm hoạt động (aspartyl protease). Enzyme này bị ức chế bởi pepstatin. pH tối ưu trong vùng acid. • Aspartic proteases bao gồm: pepsins, cathepsins, và renins. Chúng có cấu trúc gồm 2 domain (do sự lặp gene). • HIV-1 protease thuốc chính trong điều trị HIV • Chymosin (hay "rennin")  đông tụ sữa • Renin  điều hòa huyết áp, Vtế bào • Cathepsin D  marker cho ung thư vú • Pepsin  Enzyme con đường tiêu hóa • Plasmepsin  khả năng kháng bệnh sốt rét • Nepenthesin  nguồn gốc thực vật (giống pepsin) •9/18/2020 •15 Metalloproteinase • Sử dụng các cofactor là kim loại (Zn, Co) • Metalloproteinase có 2 subgroup: • Exopeptidases metalloexopeptidases (EC number: 3.4.17). • Endopeptidases: metalloendopeptidases (3.4.24) • Xử lý metalloproteinase bằng các chất chelate (EDTA) sẽ dẫn đến ức chế hoàn toàn. • EDTA, EGTA thường gắn với các ion kim loại hóa trị 2 (hay gặp trong đệm tách chiết DNA, RNA) Glycosidase • Glycoside hydrolases thủy phân liên kết glycosid. Có vai trò quan trọng trong việc phân giải các sinh khối sinh học (carbohydrate). • Các enzyme quan trọng trong nhóm này: • Cellulase, amylase, lysozyme, neuraminidase •9/18/2020 •16 Amylase • Alpha amylase • Beta amylase • Gamma amylase Alpha amylase • α-Amylase (EC 3.2.1.1) còn gọi là 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase hoặc glycogenase. α-Amylase thuộc nhóm metalloenzymes (cần sự có mặt của Ca2+). • Enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết glycosid trong phân tử polysacharide (glycogen, tinh bột). • Sản phẩm cuối cùng là các đường maltotriose, maltose, glucose và các dextrin (tùy thuộc vào nguồn cơ chất). • Ở động vật, α-Amylase có pH tối ưu trong khoảng 6,7-7,0. •9/18/2020 •17 Beta amylase • β-Amylase (EC 3.2.1.2) còn gọi là 1,4-α-D-glucan maltohydrolase, glycogenase, saccharogen amylase. • β-amylase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn, nấm và thực vật. • Khác với α-Amylase có khả năng thủy phân ngẫu nhiên, β-Amylase hoạt động từ đầu không khử, enzyme này thủy phân liên kết α-1,4 glycosid thứ hai và cắt liên kết tạo ra một phân tử maltose. • Trong quá trình chín của quả, β-amylase phân giải tinh bột tạo các đường maltose có mùi đặc trưng. Gamma amylase • γ-Amylase (EC 3.2.1.3) còn gọi là glucan 1,4-α- glucosidase, amyloglucosidase, exo-1,4-α-glucosidase, glucoamylase, 1,4-α-D-glucan glucohydrolase). • Enzyme có khả năng cắt liên kết α 1-4 glycosid cuối cùng từ đầu không khử của amylose và amylopectin giải phóng các phân tử gluocose. • pH tối ưu của γ-amylase trong môi trường acid, pH ~3. •9/18/2020 •18 Lysozyme • Lysozyme (muramidase hoặc N-acetylmuramide glycanhydrolase) (EC 3.2.1.17) có khả năng phân giải thành tế bào vi khuẩn. • Thủy phân liên kết 1,4-beta-giữa các gốc N-acetylmuramic acid và N-acetyl-D-glucosamine trong mạch peptidoglycan. • Lysozyme có nhiều ở các dịch tiết: nước mắt, nước bọt, sữa người và các dịch nhày. Ngoài ra có nhiều trong lòng trắng trứng. Cellulase • Cellulase gồm 1 nhóm các enzyme được tiết ra chủ yếu bởi nấm, vi khuản và nguyên sinh động vật có khả năng thủy phân cellulose. • Có một ít số động, thực vật cũng có khả năng sản xuất enzym này. • Phản ứng: Thủy phân liên kết 1,4-beta-D-glycosidic trong cellulose, lichenin, và các dạng D-glucan ở ngũ cốc. •9/18/2020 •19 Cơ chất cho cellulase Lichenin (mộc nhĩ, rêu) Cellulose • Xúc tác loại bỏ hoặc bổ sung thêm các gốc để tạo thành hoặc bẻ gãy các nối đôi. • Các enzyme thuộc nhóm synthase, decarboxylase, dehydratase • Ví dụ: citrate synthase, pyruvate decarboxylase (TPP), fumarase Lớp 4. Lyase •9/18/2020 •20 Lyase • EC 4.1 phân cắt liên kết carbon-carbon (decarboxylases, aldehyde lyases, oxo acid lyases • EC 4.2  carbon-oxygen: dehydratases • EC 4.3  carbon-nitrogen • EC 4.4  carbon-sulfur bonds • EC 4.5  carbon-halide bonds (halogen) • EC 4.6  phosphorus-oxygen (adenylate cyclase và guanylate cyclase) • EC 4.99  ferrochelatase Lớp 5. Isomerase • Xúc tác các phản ứng làm thay đổi cấu trúc (không phải thành phần). Sự thay đổi bao gồm: cấu trúc quang học, hình học, cấu trúc isomer • Các enzyme thuộc nhóm: isomerases, mutases • Ví dụ: glucose-6-phosphate isomerase, phosphoglycerate mutase • Các enzym chuyển hóa các dạng đồng phân có vai trò quan trọng khi sản xuất các chất dinh dưỡng vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sang dạng có thể hấp thụ được. • Vai trò trong dược phẩm (dạng hoạt động) •9/18/2020 •21 Isomerase • EC 5.1 xúc tác phản ứng racemization (racemases) và epimerization (epimerases) • EC 5.2  isomerization của các dạng đồng phân cis-trans • EC 5.3  intramolecular oxidoreductases • EC 5.4  intramolecular transferases (mutases) • EC 5.5  intramolecular lyases • EC 5.99  các loại isomerases khác (bao gồm topoisomerases) • Xúc tác cho những phản ứng có mặt 2 hợp chất đi kèm với việc thủy phân một liên kết đi kèm với việc thủy phân một liên kết phosphoanhydride (ATP) • Các enzyme thuộc nhóm này: synthetases, carboxylases, polymerases • Ví dụ: glutamine synthetase (ATP), pyruvate carboxylase (biotin), DNA polymerase Lớp 6. Ligase •9/18/2020 •22 • EC 6.1 tạo liên kết carbon-oxygen • EC 6.2  carbon-sulfur • EC 6.3  carbon-nitrogen • EC 6.4  carbon-carbon • EC 6.5  liết kết phosphoric ester (T4 ligase) • EC 6.6  nitrogen-kim loại T4-ligase Mammalian ligases • DNA ligase I:  Gắn các đoạn DNA Okazaki. • DNA ligase II:  tìm thấy ở các tế bào không phân chia (dạng trung gian của DNA ligase III). • DNA ligase III:  phức hợp DNA-protein sửa chữa, để hàn gắn các DNA trong quá trình sửa chữa. • DNA ligase IV:  tạo phức hợp xúc tác kết nối các DNA sợi đơ bị gẫy. Có vai trò trong quá trình tái tổ hợp sắp xếp các gene để hình thành kháng thể và các thụ thể của tế bào T trong quá trình phát triển hệ thống miễn dịch. •9/18/2020 •23  Trung tâm hoạt động: 1 phần trong phân tử enzym có chứa các nhóm chức trực tiếp kết hợp với cơ chất để chuyển hóa thành sản phẩm. Trung tâm hoạt động không có nghĩa là một vùng gồm các amino acid nằm liên tục trên chuỗi polypeptide mà chúng có thể nằm xa nhau (gần nhau về mặt không gian Một số enzyme có thêm vị trí dị lập thể: Là nơi gắn với chất ức chế không cạnh tranh hoặc chất hoạt hoá của E. Cấu trúc không gian Cơ chế xúc tác của enzyme • Enzyme  tăng tốc độ phản ứng (giảm hàng rào năng lượng của phản ứng hay năng lượng hoạt hóa). • Liên kết cộng hóa trị có năng lượng liên kết giữa 2 nguyên tử khoảng 50 đến 200 kcal/mol. Ở nhiệt độ phòng, năng lượng nhiệt động học khoảng 0.6 kcal/mol  các liên kết hóa cộng hóa trị này không thể bị bẻ gãy nếu như không có sự tham gia của các yếu tố bên ngoài (enzyme). • Enzyme sẽ tạo ra một “môi trường” làm giảm năng lượng hoạt hóa cần thiết. Cơ chế xúc tác •9/18/2020 •24 Course of reaction without enzyme EA without enzyme DG is unaffected by enzyme Progress of the reaction F re e e n e rg y EA with enzyme is lower Course of reaction with enzyme •9/18/2020 •25 Hoạt động của enzyme Tính đặc hiệu của enzym 1. Đặc hiệu lập thể • Phần lớn enzyme chỉ tác dụng lên một trong 02 dạng đồng phân không gian của các chất. Ví dụ: Lactacdehydrogenase chỉ tác dụng lên axit L-lactic mà không tác dụng với D-lactic. 2. Đặc hiệu kiểu phản ứng • Mỗi enzym chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hóa một cơ chất nhất định. • Ví dụ: Phản ứng oxy hóa khử, thủy phân, chuyển vị 3. Đặc hiệu cơ chất • Cơ chất là những chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzym. •9/18/2020 •26 • Đặc hiệu tuyệt đối: Enzym chỉ xúc tác trên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với chất nào khác. Ví dụ: Enzyme urease xúc tác cho phản ứng phân giải ure tạo ra NH3 và CO2 • Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Enzym chỉ xúc tác trên những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một kiểu liên kết và có những đòi hỏi nhất định đối với nhóm nguyên tử ở gần liên kết mà nó tác dụng. Ví dụ: Enzyme Maltase thuộc nhóm -glucozida chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết Glucoside được tạo thành từ nhóm OH- Glucoside của Glucose với nhóm -OH của một monose khác. • Đặc hiệu nhóm tương đối: Enzym không đỏi hỏi quá nghiêm ngặt về nhóm ở gần liên kết bị phân giải. Ví dụ: Lipase, proteinase. Bản chất hóa học của quá trình xúc tác bởi enzyme • Sự tương tác của cơ chất với trung tâm hoạt động của enzym • Trung tâm hoạt động được hình thành do sự tương tác của các nhóm chức, gốc amino acid thông qua liên kết hydro. Trung tâm hoạt động có tính chất linh động. • Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa trung tâm hoạt động và cơ chất được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất. • Mô hình hoạt động •9/18/2020 •27 Giả thuyết chìa và ổ khoá: Do Fisher đề xuất năm 1894, theo đó enzyme là ổ khoá, cơ chất là chìa khoá, chỉ khi chìa khớp với ổ khoá phản ứng mới xáy ra. Giả thuyết về khớp cảm ứng: Do Koshland đề xuất năm 1958, Giả thuyết này mềm dẻo hơn, phù hợp với đặc điểm của sinh học, cho đến nay chưa có giả thuyết nào khác thay thế nó. Sự hình thành các liên kết hóa học trong phức E-S 1. Tương tác tĩnh điện Được hình thành giữa nhóm tích điện của cơ chất với nhóm tích điện trái dấu của enzym 2. Liên kết hydro Liên kết hydro được hình thành khi khoảng cách giữa 2 nhóm khoảng 3 Angstrom 3. Tương tác van der Waals Tương tác này không có tính đặc hiệu nhưng có trò làm tăng khả năng tương tác cho phức E-S. 4.Tương tác kị nước •9/18/2020 •28 • Một số enzyme có thể dự đoán bằng cách phân loại sơ bộ. • Thực hiện các phản ứng chuyển hóa • Xác định va ̀ nhận dạng sản phẩm tạo thành bằng các phương pháp sắc ký (HPLC, FPLC, GCMS, NMR). • Ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện. • Việc tìm kiếm cơ chất rất vất vả, tốn nhiều thời gian và chi phí cao. • Các chương trình máy tính được sử dụng rộng rãi trong việc dự đoán các tương tác enzyme cơ chất. • Cơ sở của các phương pháp này là dựa vào những đặc điểm tương tự trong cơ chê ́ nhận diện và tương tác cơ chất. • Các phương pháp in silico đã đang được áp dụng rộng rãi. • Hiện nay có khoảng hơn 500 loại protease. • Nghiên cứu các sản phẩm thủy phân bằng phương pháp khối phổ (nhận dạng các mảnh peptide)  xác định được cơ chất cho enzyme. Sàng lọc cơ chất cho enzyme Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme  Mục đích: Đánh giá được khả năng xúc tác của enzyme.  Dựa vào 2 cơ sở chính: • Sản phẩm tạo thành trong một khoảng thời gian ở điều kiện tối ưu  Bởi các phản ứng màu với thuốc thử  Bằng HPLC, FPLC  Bằng huỳnh quang • Lượng cơ chất bị mất đi sau phản ứng xúc tác  Đơn vị hoạt độ  Hoạt độ tổng số  Hoạt độ riêng •9/18/2020 •29 Đơn vị hoạt độ enzyme • Đơn vị quốc tế (IU): độ hoạt tính sinh học của một enzyme • Một đơn vị IU là hoạt độ của một enzyme (không phải là lượng enzyme) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 1 µM cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tối ưu. Đơn vị enzyme (enzyme Unit) Đơn vị enzyme (U): Là lượng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa 1 µM cơ chất trong 1 phút 1 U ~ 1 µM cơ chất/ 1 phút • Đơn vị quốc tế (IU) khác với Đơn vị enzyme (U): •9/18/2020 •30 Đơn vị Katal • Đơn vị Katal (kat): Một đơn vị kat là lượng enzyme cần thiết cho phản ứng xúc tác chuyển hóa 1 mol cơ chất trong 1 giây ở điều kiện phân tích. • 1 kat ~ 1 mol cơ chất/ 1 giây • Quy đổi: 1 kat = 60.106 U Hoạt độ tổng số • Trong một mẫu enzyme chưa tinh sạch (ngoài thành phần enzyme có có nhiều thành phần protein khác) • Hoạt độ của enzyme (tính theo đơn vị hoạt độ) trên một đơn vị khối lượng protein •9/18/2020 •31 Hoạt độ riêng (specific activity) • Định nghĩa: số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng protein • Cơ sở để đánh giá độ sạch của mẫu enzyme • Mẫu enzyme càng sạch, số đơn vị hoạt độ enzyme sẽ càng lớn. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme Định lượng cơ chất mất đi sau một khoảng thời gian ở điều kiện tối ưu • Các phản ứng màu (đo quang phổ) • Các phương pháp phóng xạ • Bằng HPLC, FPLC • Bằng huỳnh quang (FACS, Elisa) •9/18/2020 •32 Nghiên cứu động học enzyme Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác.  Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme  Cho phép hiểu được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme  Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme  Khi lựa chọn các đơn vị hoạt động enzyme cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng. Ảnh hưởng của nồng độ enzym Động học các phản ứng enzym • Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S]>>[E] lúc này tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E]. • Đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác: v=k[E] • Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó. V [E] •9/18/2020 •33 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất P EES S E 2 1 1- k k k   E = Enzyme S = Cơ chất P = Sản phẩm ES = Phức hợp Enzyme - Cơ chất k1: Hằng số tốc độ phản ứng thuận (tạo thành ES) k-1: Hằng số tốc độ phản ứng nghịch (ES chuyển thành E và S) k2: Hằng số tốc độ phản ứng tạo thành sản phẩm •9/18/2020 •34 Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES. Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S. Gọi v0 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P. v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S] (k-1+k2)[ES] = k1[E][S] (1) •9/18/2020 •35 Vmax= k2[E0] Thay vào (3) ta có:    SK SVmax   M ov Phương trình Michaelis – Menten (1913) Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn 1 2 1 2 1 1 KK k k k k k k sM   •9/18/2020 •36 Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến giá trị vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S] Khi Km = [S] thì v0 =1/2 Vmax Giá trị km của một số enzym •9/18/2020 •37 k2 k3 k1 k-1   E + S ES  ES  E + P  SK ]][[k   M cat o SE v kcat = k2k3/(k2 + k3) Các phản ứng qua nhiều bước Cách tính Kcat ME: trọng lượng phân tử của enzym (Da = g/mol) mE: lượng enzym sử dụng cho phản ứng (g) mP: lượng sản phẩm tạo ra (mol) t: Thời gian phản ứng (s) Quan hệ giữa Vmax và Kcat: Vmax = Kcat *[E] •9/18/2020 •38 Giá trị kcat của một số enzym Ý nghĩa của Km • Km hiểu một cách đơn giản là thể hiện ái lực hoặc sức gắn của enzyme với cơ chất. • Giá trị Km càng thấp thì ái lực càng lớn (chỉ cần một lượng rất nhỏ cơ chất, phản ứng đã đạt được một tốc độ nhất định). • Giá trị Km càng cao  ái lực E và S thấp  cần nhiều cơ chất với đạt được tốc độ nhất định. •9/18/2020 •39 Ý nghĩa của Vmax • Vmax là nồng độ cơ chất mà ở đó tất cả các vị trí hoạt động (trung tâm hoạt động) của enzyme đã hoàn toàn bị bão hòa. • Vmax chịu ảnh hưởng bởi nồng độ cơ chất (phản ứng bậc 1). Ý nghĩa của Kcat • Kcat được xem là hằng số chuyển hóa của enzyme và được mô tả = số phản ứng enzyme trong 1 giây • Tỉ lệ Kcat/ km được gọi là hiệu năng xúc tác (catalytic effiency) của enzyme. Dùng để so sánh tính đặc hiệu của enzym với các cơ chất khác nhau. •9/18/2020 •40 Enzyme xúc tác phản ứng có 2 hay nhiều cơ chất Phản ứng không tạo phức 03 thành phần (phản ứng pingpong Phản ứng tạo phức 03 thành phần •9/18/2020 •41 Ảnh hƣởng của các chất ức chế enzyme • Ức chế cạnh tranh: Khi cơ chất và chất ức chế cạnh tranh nhau vị trí trung tâm hoạt động của enzyme • Ức chế không cạnh tranh: Khi chất ức chế gắn ở đâu đó trên phân tử enzyme dẫn đến giảm hiệu quả xúc tác của nó. • Sự phân biệt này có thể được xác định bằng cách vẽ phản ứng động học khi có mặt và không có mặt chất ức chế. Ức chê ́ cạnh tranh (Competitive Inhibition) •9/18/2020 •42 • Khi có mặt chất ức chế cạnh tranh, enzyme đòi hỏi nồng độ [S] lớn để cạnh tranh vị trí trung tâm hoạt động (để đạt được cùng một tốc độ khi không có chất ức chế). • Như vậy, Vmax có thể đạt được nếu đủ cơ chất (đòi hỏi nhiều cơ chất hơn) • Giá trị Km sẽ lớn hơn Ức chế không cạnh tranh (Uncompetitive Inhibition) •9/18/2020 •43 • Enzyme bị tấn công bởi chất ức chế  giảm hoặc mất hiệu quả xúc tác. • Tốc độ phản ứng enzyme (v) giảm ở tất cả các nồng độ cơ chất, bao gồm cả Vmax và ½ Vmax • Giá trị Km vẫn không thay đổi vì vị trí hoạt động của những enzyme (mà không bị ức chế) không thay đổi. (N-tosyl-L-phenylalanine chloromethylketone) Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa (activator)  Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trong nước.  Ví dụ: Mg++ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosintriphosphatase (cơ chất là ATP).  Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại: + Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định. + Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối. + Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion. + Phụ thuộc nồng độ cation kim loại . + Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích. + Phụ thuộc bản chất cation kim loại •9/18/2020 •44 Ảnh hưởng của nhiệt độ  Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trường, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant -Hoff. Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần..  Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là protein. Nếu tăng nhiệt độ lên trên 40-500C xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác. Sau nhiệt độ tối thích tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm.  Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấp enzyme Ảnh hưởng của pH  Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH, mỗi enzyme có một pH tối thích.  Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau: • Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp • Ở hai sườn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm coenzyme • Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất • Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt tính cực đại •9/18/2020 •45 Các yếu tố ảnh hưởng khác  Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất.  Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng.  Enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, càng tinh khiết thì enzyme càng kém bền, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền  Tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ tăng. Ví dụ: dưới tác động của tia tử ngoại ở nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng mất hoạt tính.  Tác động của một số ion kim loại trong dịch với nồng độ khoảng 10-3M như Ca++ làm tăng tính bền.