Xây dựng qui trình multiplex PCR phát hiện một số vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở lợn - Nguyễn Tuấn Anh

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14 8 XÂY DỰNG QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN Nguyễn Tuấn Anh1*, Nguyễn Thị Minh Tâm1, Trịnh Thị Thanh Huyền2, Ngô Quang Hưởng2, Phí Thị Thu Hiền2, Nguyễn Thị Hoàng2 1Công Ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương, *ntanhbio@gmail.com 2Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai TÓM TẮT: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện ba loài vi khuẩn có khả năng gây tiêu chảy cấp ở lợn bao gồm Salmonella spp., Clostridium perfringens và E. coli ETEC trong bệnh phẩm, phân và mô ruột, dựa trên kỹ thuật multiplex PCR. Các thông số tối ưu cho quy trình bao gồm: nồng độ mồi cho từng đối tượng tương ứng là 350 nM (Salmonella spp.), 200 nM (C. perfringens), 200 nM (E. coli ETEC), 50 nM mồi chứng nội (Porcine β-actin), nhiệt độ lai là 61oC. Ngưỡng phát hiện của quy trình là 2,5103 bản sao/phản ứng cho cả ba đối tượng. Quy trình được kiểm tra trên một số mẫu sinh thiết ruột và phân lợn bị bệnh tiêu chảy, kết hợp so sánh với kit thương mại cho thấy có khả năng phát hiện chính xác ba loài vi khuẩn tương đương với kit thương mại với hệ số Kappa tương ứng được xác định là 1,0; 0,45 và 0,56. Quy trình có khả năng phát triển thành một phương pháp chẩn đoán tiện lợi, nhanh chóng, đặc hiệu và chính xác; hơn nữa, có thể được sử dụng như một công cụ nghiên cứu dịch tễ học sự nhiễm những vi khuẩn này trong các quần thể lợn nuôi. Từ khóa: Clostridium perfringens, E. coli, Salmonella, multiplex PCR, bệnh tiêu chảy. MỞ ĐẦU Bệnh tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi lợn, gây nhiều tổn thất kinh tế, bệnh đe dọa nhóm lợn sơ sinh dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Ở lợn trưởng thành, bệnh thường tự khỏi nếu được chăm sóc tốt nhưng trong trường hợp lợn mẹ mang mầm bệnh, đàn con có thể bị lây nhiễm, tiêu chảy và tử vong trong thời gian ngắn do không có sức kháng bệnh. Bệnh có thể do vi khuẩn, virus, ký sinh trùng gây ra với triệu chứng tương tự nhau. Trong số các vi khuẩn có khả năng gây tiêu chảy cấp, Clostridium perfringens, Escherichia coli (ETEC) và Salmonella spp. là những đối tượng được quan tâm, chúng được tìm thấy trong những trường hợp lợn bị các bệnh về dạ dày, ruột. Clostridium perfringens là vi khuẩn Gram (+), hình thành bào tử, kị khí, thường có trong đất, nước thải và đường ruột của người và động vật. Clostridium perfringens được chia thành năm typ, từ A đến E, dựa trên khả năng sản xuất bốn loại độc tố là độc tố α (CPA), độc tố β (CPB), độc tố epsilon (ETX) và độc tố iota (IA) [6]. E. coli ETEC (Enterotoxigenic E. coli) là một tác nhân đáng lưu ý bởi tạo ra cả hai loại độc tố ổn nhiệt và nhạy nhiệt, được mã hóa bởi gene ST và LT [10], gây triệu chứng tiêu chảy nghiêm trọng ở lợn mới sinh và lợn cai sữa [2, 3]. Các chủng E. coli không gây bệnh vẫn hiện diện trong đường ruột của động vật khỏe mạnh nên cần phân biệt giữa E. coli và E. coli ETEC [1, 5]. Salmonella spp. là một trong những tác nhân gây tiêu chảy phổ biến ở lợn trưởng thành, trong đó, hai chủng Salmonella chủ yếu gây bệnh là S. choleraesuis và S. typhimurium, chiếm hơn 65% tình trạng nhiễm Salmonella ở lợn. Có khoảng 200 gene độc tồn tại ở Salmonella, trong đó gene invA có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của Salmonella vào thể chủ [8, 12]. Một số công trình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới nhằm vào những vi khuẩn này với nhiều mục đích khác nhau. Nguyễn Tuyên Quang (2007) [14] nghiên cứu xác định các yếu tố gây bệnh của E. coli với tiêu chảy ở lợn con, cho thấy, chủng E. coli ETEC phân lập được có tỷ lệ khác nhau về năm tổ hợp yếu tố gây bệnh là LT+STa+K88+Hly+ (52,2%), LT+STa+STb +K88+Hly-(11,1%), STa+K99+(17,2%), STa+ STb+(3,3%) và STb (15,7%). Kim et al. (2010) [7] đã nghiên cứu 122 mẫu phân lợn tiêu chảy từ 55 trang trại ở Hàn Quốc cho thấy có đến 114 mẫu E. coli thuộc nhóm ETEC, chứa gene K88, K99, K987P, LT, STa và STb. Kết quả khẳng Nguyen Tuan Anh et al. 9 định E. coli ETEC liên quan chặt chẽ đến tiêu chảy ở lợn con. Lin et al. (2004) [9] nghiên cứu tần số xuất hiện các gene độc tố ở C. perfringens bằng kỹ thuật multiplex PCR với kết quả cpa (98,2%), cpb (31,0%), cpb2 (46,0%), cpe (18,6%). Nguyễn Cảnh Tự và nnk. (2010) [15] cho thấy số lượng và tỷ lệ các chủng Salmonella có các yếu tố gây bệnh và độc lực mạnh phân lập được từ lợn bị tiêu chảy cao hơn rất nhiều so với ở lợn không bị tiêu chảy. Mtshali et al. (2012) [11] đã phát hiện E. coli, C. perfringens và Salmonella spp. từ phân động vật tại vườn thú quốc gia Nam Phi bằng kỹ thuật multiplex PCR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy trình phát hiện đồng thời ba tác nhân gây bệnh là C. perfringens, E. coli ETEC và Salmonella spp. trong các mẫu bệnh thu từ lợn nghi nhiễm dựa trên phương pháp multiplex PCR. Đối tượng nhân bản của multiplex PCR là các gene độc lực Cpa đối với C. perfringens, STa cho E. coli ETEC và inv cho Salmonella spp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu phân, mô ruột non của lợn con sơ sinh nghi nhiễm vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở khu vực Đồng Nai được thu thập trong khoảng thời gian từ 06/2010 đến 11/2012. Các chủng vi khuẩn sử dụng bao gồm Salmonella typhimurium (ATCC 29946), Escherichia coli ETEC (ATCC 35401). Đối với Clostridium perfringens, gene Cpa của mẫu vi khuẩn thu thập từ thực địa được tạo dòng vào plasmid pBluescript II SK (+) (Stratagene) và plasmid tái tổ hợp được đặt tên là pBlue- C. perfringens. Mồi sử dụng trong nghiên cứu do công ty IDT (Integrated DNA Technologies, Hoa kỳ) cung cấp. Bảng 1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu Tên Gene/Chủng Trình tự (5’→3’) Sản phẩm (bp) Nguồn gốc SA-F ATAAACTTCATCGCACCGTCA SA-R Inv, Salmonella spp. TACTTAACAGTGCTCGTTTAC 570 Lei et al., 2008 EC-F CAACTGAATCACTTGACTCTT EC-R STa, E. coli ETEC TTAATAACATCCAGCACAGG 158 Bosworth et al., 1997 CL-F GCTAATGTTACTGCCGTTGA CL-R Cpa, C. perfringens ACCCTCTGATACATCGTGTAAG 327 Das et al., 2009 IC-F ATCCTCACGGAGCGGGGCTAC IC-R Porcine β-actin TGCCCGACACCTACCCAGGAAG 243 Nghiên cứu này Xử lý bệnh phẩm: Mẫu phân, 1-2 g (rắn) hoặc 1-2 ml (lỏng) được hòa trong 5-7 ml PBS 1X, gạt phần dịch nổi vào falcon 15 ml. Ly tâm 2.800 x g trong 2 phút, thu 1,5 ml dịch nổi và li tâm tiếp ở 12.000 x g trong 20 phút, thu cặn. Hòa cặn trong 100 µl SDS 3%. Mẫu sinh thiết ruột lợn, 50 mg, được cắt nhỏ trong dung dịch SDS 3%, vortex mạnh trong 10-15 giây và ủ ở nhiệt độ 65oC trong 20 phút. Mẫu xử lý có thể được sử dụng để tách chiết DNA hoặc bảo quản ở -20oC. Tách chiết DNA: DNA bộ gene của vi khuẩn từ mẫu phân và mẫu sinh thiết đã xử lý được tách chiết theo phương pháp phenol: chloroform: isoamylalcohol (PCA) hoặc Boom [5]. Multiplex PCR: DNA sau khi tách chiết được nhân bản trong phản ứng multiplex PCR. Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U h-Taq DNA polymerase (Solgent), 200 µM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1X PCR buffer, 200 nM mồi CL-F/R, 200 nM mồi EC-F/R, 350 nM mồi SA-F/R, 50 nM mồi chứng nội IC (Porcine β-actin) và 5 µl DNA tách chiết trong tổng thể tích phản ứng là 25 µl. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: 15 phút ở 95oC, 40 chu kỳ lặp lại gồm 30 giây ở 94oC, 30 giây ở 61oC và 30 giây ở 72oC, và 6 phút ở 72oC. Sản phẩm nhân bản được phân tích qua điện di trên gel agarose 2% với thang phân tử 100 bp (Solgent). TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14 10 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xây dựng qui trình multiplex PCR Vật liệu sinh học là DNA bộ gene và plasmid tái tổ hợp từ 3 chủng vi khuẩn C. perfringens, E. coli ETEC và S. typhimurium. Số lượng bản sao vi khuẩn/µl được tính toán dựa trên công thức: Số lượng bản sao = (lượng DNA (ng)  6.022.1023)/(kích thước  1.109  650) [13]. Chúng tôi sử dụng ba tổ hợp với tỷ lệ 1:1:1 của ba vi khuẩn tương ứng với ba nồng độ (bản sao/µl ) là 5102 bản sao/µl, 5104 bản sao/µl và 5106 bản sao/µl. Chứng nội trong phản ứng multiplex PCR là một trình tự gene β-actin lợn được nhân bản với cặp mồi IC-F/R. Kết quả ở hình 1 cho thấy, các sản phẩm nhân bản trong phản ứng monoplex PCR với từng vi khuẩn có kích thước phù hợp với kích thước dự kiến, 570 bp đối với S. typhimurium, 158 bp đối với E. coli (ETEC), 327 bp cho C. perfringens và 243 bp cho chứng nội. Các sản phẩm nhân bản, kiểm tra bằng giải trình tự, phù hợp với các trình tự gene tương ứng đã công bố (kết quả không trình bày ở đây). Tuy nhiên, phản ứng multiplex PCR có hiệu quả nhân bản không đồng đều trên bốn gene mục tiêu ở các nồng độ vi khuẩn trung bình và thấp, 5102 và 5104 bản sao/µl, trong đó sản phẩm nhân bản gene chứng nội luôn chiếm ưu thế (hình 1A). Từ đây, chúng tôi tối ưu hóa hai thông số là nồng độ các cặp mồi và nhiệt độ lai của phản ứng PCR. Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm monoplex PCR và multiplex PCR từ 3 tổ hợp DNA 3 vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau 1. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5102 bản sao/µl; 2. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5104 bản sao/µl; 3. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5106 bản sao/µl; 4. DNA tách chiết từ mẫu phân âm tính với 3 vi khuẩn đang khảo sát; A. Phản ứng PCR multiplex; B và C là phản ứng PCR monoplex cho từng vi khuẩn. Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với các nồng độ mồi SA-F/R (Salmonella spp.) khác nhau 1. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5102 bản sao/µl; 2. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5104 bản sao/µl; 3. Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5106 bản sao/µl; 4. DNA tách chiết từ mẫu phân âm tính với 3 vi khuẩn khảo sát. Nồng độ mồi chứng nội IC-F/R được khảo sát theo xu hướng giảm, 200, 150, 100, và 50 nM/phản ứng. Trong khi đó, nồng độ mồi đặc hiệu cho C. perfringens và Salmonella spp., CL- F/R và SA-F/R, được khảo sát theo theo hướng tăng dần, 200, 250, 300 và 350 nM. Kết quả ở hình 2 cho thấy, ở nồng độ mồi SA-F/R (350 nM) là tốt nhất, kết quả nồng độ mồi CL-F/R A B C Nguyen Tuan Anh et al. 11 được chọn là 200 nM (không thể hiện ở đây). Nhiệt độ lai cho phản ứng multiplex PCR được khảo sát trong khoảng từ 55-65oC bao gồm: 55,0; 55,8; 57,1; 58,9; 61,4; 63,3; 64,5 và 65,0 oC. Khảo sát được lập lại ba lần với ba hỗn hợp vi khuẩn với nồng độ khác nhau. Kết quả ở hình 3 cho thấy, nhiệt độ 61,4oC cho hiệu quả nhân bản tốt nhất, thể hiện rõ nhất ở mẫu có nồng độ vi khuẩn thấp, chúng tôi chọn nhiệt độ lai là 61oC cho quy trình multiplex PCR. Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với các nhiệt độ lai khác nhau Lần 1: Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5102 bản sao/µl; lần 2: Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5104 bản sao/µl; lần 3: Hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở nồng độ 5106 bản sao/µl. Ngưỡng phát hiện của quy trình multiplex PCR Hình 4. Kết quả PCR từ hỗn hợp DNA 3 vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau Giếng 1, 7: 5105 bản sao/µl; giếng 2, 8: 5104 bản sao/µl; giếng 3, 9: 5103 bản sao/µl; giếng 4, 10: 5102 bản sao/µl; giếng 5, 11: 5101 bản sao/µl; giếng 6, 12: 5100 bản sao/µl. Ngưỡng phát hiện của quy trình multiplex PCR được xác định bằng cách sử dụng hỗn hợp 3 vi khuẩn có nồng độ 5105 bản sao/µl, pha loãng bậc 10 đến nồng độ thấp nhất là 5100 bản sao/µl, bổ sung vào dịch phân và dịch mô âm tính. DNA tách chiết từ 2 lô chất nền này được nhân bản với phản ứng multiplex PCR đã tối ưu hóa. Kết quả ở hình 4 cho thấy, tín hiệu dương tính ổn định ở nồng độ 5102 bản sao/µl (giếng 4 và 10) ở hai lần thí nghiệm trên dịch phân (mẫu 1-6) và dịch mô (mẫu 7-12). Như vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR được xác định là 5102 bản sao/µl. Kiểm tra quy trình multiplex PCR phát hiện đồng thời Clostridium perfringens, Escherichia coli (ETEC) và Salmonella spp. với kit thương mại Bảng 2. Kết quả so sánh qui trình multiplex PCR vi khuẩn với kit thương mại real-time PCR Kit C Kit E Kit S So sánh kit phát hiện vi khuẩn (+) (-) Tổng (+) (-) Tổng (+) (-) Tổng (+) 15 0 15 (83%) 9 4 13 (72%) 12 0 12 (67%) Kit multiplex PCR (-) 2 1 3 (17%) 0 5 5 (28%) 0 6 6 (33%) Tổng 17 (94%) 1 (6%) 18 9 (50%) 9 (50%) 18 12 (67%) 6 (33%) 18 Hệ số kappa (κ) 0,45 0,56 1,0 C. Kit C. perfringens; E. Kit E. coli ETEC; S. Kit S. typhimurium (Labhoo). TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14 12 Thử nghiệm được tiến hành trên một số mẫu chứng đại diện đã biết trước nồng độ và mẫu thực địa. Do không có kit thương mại tương đương nên chúng tôi sử dụng các kit real-time PCR (Labhoo) cho từng tác nhân vi khuẩn. Kết quả ở bảng 2 cho thấy, quy trình multiplex PCR vi khuẩn xây dựng trong nghiên cứu này có khả năng phát hiện C. perfringens, E. coli ETEC và Salmonella spp. tương đương với kit thương mại. Hệ số kappa nhận được cho thấy sự đồng thuận vừa phải đối với kit C (C. perfringens) và kit E (E. coli ETEC) và đồng thuận rất tốt đối với kit S (Salmonella spp.). Thử nghiệm quy trình multiplex PCR vi khuẩn trên mẫu thực địa Bảng 3. Kết quả thử nghiệm quy trình multiplex PCR vi khuẩn trên mẫu thực địa Tình trạng nhiễm/mẫu Số mẫu C. perfringens 53% (53/100) E. coli ETEC 4% (4/100) S. typhimurium 5% (5/100) C. perfringens và E. coli ETEC 2% (2/100) E. coli ETEC và S. typhimurium. 2% (2/100) C. perfringens và Salmonella spp. 4% (4/100) C. perfringens, E. coli ETEC và S. typhimurium 2% (2/100) Âm tính 28% (28/100) Kết quả thử nghiệm quy trình multiplex PCR vi khuẩn trên 100 mẫu chọn ngẫu nhiên từ lợn nghi nhiễm bao gồm cả phân và mô lợn sơ sinh và cai sữa cho thấy, tỷ lệ nhiễm C. perfringens rất cao (53%) (bảng 3). Kết quả giải trình tự một số mẫu đại diện (không thể hiện ở đây) cho thấy các mẫu này đều phù hợp với kết quả PCR. Tuy nhiên, do các mẫu sử dụng trong nghiên cứu này chỉ nhằm phục vụ việc xây dựng và đánh giá quy trình multiplex PCR nên mẫu chọn không đại diện cho tình hình dịch tễ học bệnh nhiễm này ở địa phương. KẾT LUẬN Quy trình multiplex PCR xây dựng trong nghiên cứu này có thể được sử dụng để phục vụ cho chẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ học bệnh tiêu chảy cấp trên lợn nuôi do vi khuẩn. Trong lĩnh vực thú y, quy trình có ưu điểm là thời gian xét nghiệm nhanh và cho kết quả chính xác. Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Đồng Nai, Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học tỉnh Đồng Nai, Công ty TNHH CNSH Khoa Thương đã giúp đỡ chúng tôi về kinh phí và thiết bị để thực hiện nội dung này. Xin cảm ơn các hộ chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Đồng Nai đã cung cấp cho chúng tôi nguồn mẫu thực địa dùng trong nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Abu S. M. R., El-Essawy A. K., Abu S. H. M., Ibrahim S. A., Roshdy R. A., 2006. Validity of multiplex PCR as an emerging technique for diagnosis of enterotoxigenic Escherichia coli. Egypt. J. Med. Lab. Sci, 15(1): 1-8. 2 Ahsani M. R., Mohammadabadi M. R., Shamsaddini M. B., 2010. Clostridium perfringens isolate typing by multiplex PCR. J. Ven. Anim. Toxins Trop. Dis., 16(4): 573-578. 3 Blanco M., Blanco J. E., Gonzales E. A., Mora A., Jansen W., Gomes T. A., Zerbini L. F., Yano T., de Castro A. F., Blanco J., 1997. Genes coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with toxic phenotypes. J. Clin. Microbiol., 35(11): 2958-2963. 4 Boom R., Sol C. J., Salimans M. M., Jansen C. L., Wertheim-van Dillen P. M., van der Noordaa J., 1990. Rapid and simple method Nguyen Tuan Anh et al. 13 for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol., 28(3): 495-503. 5 Do T. N., Cu P. H., Nguyen H. X., Au T. X., Vu Q. N., Driesen S. J., Townsend K. M., Chin J. J., Trott D. J., 2006. Pathotypes and serogroups of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from pre-weaning pigs in north Vietnam. J. Med. Microbiol., 55(Pt1): 93-9. 6 Garmory H. S., Chanter N., French M. P., Bueschel D., Songer J. G., Titball R. W., 2000. Occurrence of Clostridium perfringens beta2-toxin amongst animals, determined using genotyping and subtyping PCR assays. Epidemiol Infect, 124(1): 61- 67. 7 Kim Y. J., Kim J. H., Hur J., Lee J. H., 2010. Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea with diarrhea and characteristics of the virulence genes. Can. J. Vet. Res., 74(1): 59-64. 8 Lei I., Roffey P., Blanchard C., Gu K., 2008. Development of a multiplex PCR method for the detection of six common foodborne pathogens. J. Food Drug Anal., 16(4): 37-43. 9 Lin B. C., Heller S., Siedlik L., Marco T., 2008. A molecular approach to the characterization and evaluation of Clostridium perfringens type A field strains. Am. Assoc. Swine Vet.. 10 Moreno A. M., Baccaro M. R., Ferreira A. J. P., Hirose F., Campos D. S., 2003. Detection of the 2b toxin gene from Clostridium perfringens isolated in diarrheic piglets. Arquivos do Instituto de Biologia, 70(2): 135-138. 11 Mtshali K., Mtshali M. S., Nkhebenyane J. S., Thekisoe O. M. M., 2010. Detection of Salmonella, Clostridium perfringens and Escherichia coli from fecal samples of captive animals at the National Zoological Gardens of South Africa. Afr. J. Microbiol. Res., 6(15): 3662-3666. 12 Singer R. S., Cooke C. L., Maddox C. W., Isaacson R. E., Wallace R. L., 2006. Use of pooled samples for the detection of Salmonella in feces by polymerase chain reaction. J. Vet. Diagn. Invest., 18(4): 319- 25. 13 Tran V. T. N., Karley A., Dongol S., Nguyen T. H., Dunstan S., Holt K., Le T. P. T., Campbell J. I., Tran T. C., Nguyen V. V. C., Arjyal A., Koirala S., Basnyat B., Dolecek C., Farrar J., Baker S., 2010. The sensitivity of real-time PCR amplification targeting invasive Salmonella serovars in biological specimens. BMC Infect. Dis., p. 10: 125. 14 Nguyễn Quang Tuyên, 2007. Kết quả nghiên cứu xác định yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli đối với bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ. Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 15 Nguyễn Cảnh Tự, Trương Quang, 2010. Nghiên cứu vai trò của Salmonella trong hội chứng tiêu chảy của lợn sóc (lợn đê) nuôi tại Đắk Lắk. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 8(1): 114-119. TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 8-14 14 DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX PCR PROTOCOL FOR THE DETECTION OF SEVERAL BACTERIA CAUSING ACUTE DIARRHEA IN PIG Nguyen Tuan Anh1, Nguyen Thi Minh Tam1, Trinh Thi Thanh Huyen2, Ngo Quang Huong2, Phi Thi Thu Hien2, Nguyen Thi Hoang2 1Khoa Thuong Biotechnology Company 2Center of Biotechnology Applications, Dong Nai SUMMARY We established a multiplex PCR-based protocol for the detection of three bacteria Salmonella spp., Clostridium perfringens and E. coli ETEC causing acute diarrhea in pig from field samples, feces and intestinal biopsies. The PCR protocol was built up with technical parameters, such as primer concentrations that were 350 nM (Salmonella spp.), 200 nM (C. perfringens), 200 nM (E. coli ETEC), 50 nM internal control primer (porcine β-actin) and the annealing temperature was 61oC for all of primers used. The sensitivity of the protocol was found to be 5103 copies/reaction. The protocol was also screened for the presence of the bacteria in parallelly comparing with commercial kits on field samples and indicated that it could reliably detect three bacterial species with the Kappa values correlatively to be 1.0, 0.45 and 0.56. Finally, the protocol was set up successfully and could become a convenient, rapid, specific and accurate diagnostic kit to detect simultaneously three kinds of bacteria in field samples. Moreover, it could be used as a tool to study bacterial infection epidemiology in pig population. Keywords: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella, diarrhea, multiplex PCR. Ngày nhận bài: 15-7-2013