Xác định các đột biến trên gen RPOB liên quan đến tính kháng Rifampicin của một số chủng vi khuẩn lao thu thập tại miền Bắc Việt Nam

Nghiêm Ngọc Minh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 97 - 102 97 XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN RPOB LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG RIFAMPICIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO THU THẬP TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Nghiêm Ngọc Minh1*, Nguyễn Văn Bắc1, Vũ Thị Mai1, Cung Thị Ngọc Mai1, Vũ Thị Thanh1, Nguyễn Thái Sơn2 1Viện Công nghệ sinh học - Viện KH&CN Việt Nam, 2Bệnh viện 103 - Học viện Quân y TÓM TẮT Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis, MTB) là một trong những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện của nhiều chủng vi khuẩn lao với đặc trưng là kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng và lao đồng nhiễm HIV/AIDS. Những chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin (RIF) đồng thời cũng kháng với nhiều kháng sinh chống lao khác. Phương pháp sinh học phân tử cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác các trường hợp bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cặp mồi rpoB-F1 và rpoB-R1 đã được thiết kế nhằm khuếch đại đoạn gen rpoB gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB (còn gọi là “the mutation hot spot region”). Sau khi PCR nhân gen rpoB ở 7 chủng vi khuẩn lao thu thập tại Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương, phân tích trình tự đoạn gen rpoB của chúng thấy xuất hiện các đột biến sai nghĩa xảy ra tại codon 516 (GAC→GTC) (20%) và codon 531 (TCG→TTG) (66,67%) có liên quan đến kháng RIF. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn trong việc thay đổi phác đồ điều trị và kiểm soát bệnh lao ở một nước có mức độ bệnh nhân lao cao như nước ta. Từ khóa: Gen rpoB, lao kháng đa thuốc, rifampicin, vi khuẩn lao ∗ MỞ ĐẦU Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis, MTB) thuộc giống Mycobacterium, họ Mycobacteriaceae [7]. Đây là vi khuẩn truyền nhiễm được tổ chức y tế thế giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu bởi mức độ lây lan và hậu quả nghiêm trọng của chúng gây ra đối với sức khỏe con người. Theo ước tính của WHO trên thế giới có khoảng 42 vạn người mắc lao đa kháng thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu vực Châu Phi và Đông Âu. Ở Việt Nam mỗi năm có khoảng 100.000 người mắc bệnh lao và 20.000 người chết đứng thứ 12 trong tổng số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao [2]. Ngày nay, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn khi xuất hiện các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant – MDR), kháng thuốc phổ rộng (Extensively ∗ Tel: Drug Resistance – XDR) và đồng nhiễm HIV/AIDS. Vì vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc có ý nghĩa hết sức to lớn đối với y học cũng như sức khỏe con người. Hai phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc được sử dụng rộng rãi hiện nay là phương pháp xác định kiểu hình và phương pháp xác định kiểu gen. Trong đó, phương pháp xác định kiểu hình dựa trên khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh phải mất 4 – 8 tuần và đòi hỏi nồng độ của mẫu cao, nên độ nhạy của phản ứng thấp. Khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp xác định kiểu gen dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng như giải trình tự gen, lai trên pha rắn, real-time PCR[13]. Trong đó giải trình tự gen vẫn là phương pháp cơ bản, xác định MDR trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng chính xác và rõ ràng nhất. Genome của M. tuberculosis được giải trình tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Nghiêm Ngọc Minh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 97 - 102 98 4.411.529 bp, chứa 65% guanine và cytosine. Trên 90% tổng số gen được dự đoán là có mã hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene) [8]. Gen rpoB là một đoạn DNA có kích thước 3519 bp, nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase [12]. Thông qua enzyme này, RIF gây tác dụng lên chức năng phiên mã tạo RNA thông tin (mRNA) ở vi khuẩn lao. Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng RIF có đột biến trên gen này [7, 12]. Trong đó, các đột biến sai nghĩa làm thay đổi amino acid Ser→Leu, His→Arg, Arg→Val tương ứng với vị trí đột biến tại codon 531 (TCG→TTG), codon 526 (CAC→GAC), và codon 516 (GAC→GTC) [6,12]. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Nguồn DNA tổng số của vi khuẩn lao DNA tổng số được tách chiết và tinh sạch từ các chủng vi khuẩn lao có trong các mẫu bệnh phẩm ở Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương theo phương pháp phenol/chloroform/isoamyl alcohol [9]. Các sinh phẩm hóa chất chính Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Fermentas), kit tách chiết plasmid (Qiagen), vector nhân dòng pBT, chủng vi khuẩn E.coli DH5α (Fermentas) và một hóa chất khác như: cao nấm men, peptone từ ICN (Mỹ), các enzyme BamHI, T4 ligase từ Fermentas. Các chủng M. tuberculosis được nuôi cấy trên môi trường Lowenstein-Jensen. Các chủng E. coli được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (10 g/l Bacto-tryptone; 5 g/l Yeast extract; 10 g/l NaCl; pH 7,2). Phương pháp nghiên cứu Thiết kế mồi Các cặp mồi được thiết kế tại những vùng có độ bảo thủ cao nhất và phải chứa vùng “nóng” - “hot-spot region” gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB của chủng dại H37Rv. Trên cơ sở đó, các cặp mồi đặc hiệu rpoB-F1 (5’-GCC ACC ATC GAA TAT CTG GT-3’) và rpoB-R1 (5’-ACA CGA TCT CGT CGC TAA CC-3’) được thiết kế để nhân vùng gen 571 bp của gen rpoB. Tách chiết DNA và khuếch đại gen DNA tổng số của M. tuberculosis được tách chiết theo phương pháp phenol/chlorofrom/isoamyl alcohol [9]. Phản ứng PCR nhân đoạn gen rpoB đặc hiệu với thể tích 25 µl gồm: 2,5 µl đệm PCR 10X; 2 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl dNTP 2,5 mM; 1 µl mỗi loại mồi rpoB-F1 và rpoB-R1 10 pmoles/µl; 0,25 µl Taq DNA polymerase 5 U/µl; 3 µl mẫu DNA tổng số, 12,75 µl nước deion và theo chu trình nhiệt như sau: 01 chu kỳ 950C/5 phút; 32 chu kỳ (940C/1 phút; 560C/45 giây; 720C/1 phút); 01 chu kỳ 720C/10 phút; và giữ ở 40C đến khi phân tích. Dòng hóa rpoB vào vector pBT Sau khi khuếch đại, tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification của hãng Bioneer, đoạn gen rpoB tiếp tục được dòng hóa vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp mang gen rpoB (ký hiệu : pBrpoB). Hỗn hợp phản ứng nối ghép 10 µl (1 µl dung dịch đệm 10X T4 ligase; 1 µl vector pBT; 5 µl sản phẩm PCR; 1 µl T4 ligase; 2 µl nước deion), hỗn hợp phản ứng được ủ ở 220C trong 1 giờ. Mix 5 µl sản phẩm nối ghép với tế bào khả biến E. coli DH5α và sốc nhiệt ở 420C trong 70 giây. Sản phẩm biến nạp được bổ sung 200 µl LB lỏng, lắc 220 vòng/phút 370C trong 1 giờ và hút 100 µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung carbenicillin 100 mg/l, IPTG 100mg/l và X-gal 200 mg/l. Đĩa thạch được ủ qua đêm ở 370C. Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc xanh trắng, lựa chọn khuẩn lạc trắng nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin 100 mg/l. Tách chiết DNA plasmid theo hướng dẫn của hãng Qiagen để kiểm tra gen rpoB có gắn thành công vào vector pBT hay không bằng phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế BamHI. Plasmid cho kết quả dương tính tiếp tục phục vụ cho quá trình giải trình tự gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Nghiêm Ngọc Minh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 97 - 102 99 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết DNA và khuếch đại gen DNA tách từ các chủng M. Tuberculosis được chạy điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (không minh họa kết quả). DNA tinh sạch được dùng làm khuôn để nhân gen rpoB bằng phản ứng PCR với cặp mồi rpoB-F1 và rpoB- R1. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 1) đã thu được một băng DNA đặc hiệu, có kích thước 571 bp tương ứng với kích thước dự đoán khi thiết kế mồi. Do vậy, sản phẩm PCR tiếp tục được dùng để dòng hóa và xác định trình tự. Hình 1. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoB bằng cặp mồi rpoB-F1 và rpoB-R1. M: thang chuẩn DNA 1 kb; 1-7 các chủng tương ứng TB02-111, TB02-115, TB02-116, TB02-117, TB02-118, TB02-122; 8 đối chứng âm. Hình 2. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp gen rpoB bằng enzyme BamHI. M: thang chuẩn DNA 1 kb; 1-7 các chủng tương ứng TB02-111, TB02-115, TB02-116, TB02-117, TB02-118, TB02-122. Sản phẩm PCR được chèn vào vector nhân dòng pBT thành vector tái tổ hợp pBrpoB và biến nạp vào E. Coli DH5α. Khuẩn lạc trắng (do có đoạn DNA quan tâm chèn vào giữa gen β-galactosidase) mọc trên đĩa thạch được chọn để nuôi cấy và tách plasmid kiểm tra. Để xác định chính xác gen chèn, plasmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI. Kết quả điện di kiểm tra cho một băng có kích thước tương ứng với đoạn gen rpoB (∼ 571 bp) các băng còn lại là pBT đã bị cắt (∼ 2,7 kb) hoặc pBrpoB chưa cắt hết Hình 2 Điều đó cho thấy đoạn gen rpoB đã được chèn vào vector pBT. Các vector tái tổ hợp này được chọn để xác định trình tự gen. Đọc trình tự và phân tích gen Đoạn gen rpoB của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu sau khi đọc trình tự được xử lý kết quả qua phần mềm tin sinh học BioEdit. So sánh trình tự nucleotide và acid amin từ các mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotide và acid amin của chủng dại H37Rv chúng tôi thấy xuất hiện các đột biến khác nhau trên các chủng lao kháng thuốc, kết quả được thể hiện ở hình 3 và hình 4. Trong số 6 chủng kháng thuốc RIF có chủng TB02-111 xảy ra đột biến tại codon 516 (GAC→GTC) (20%) làm thay đổi amino acid Asp→Val. Có 4 chủng TB02-115, TB02-116, TB02-117, TB02-122 xảy ra đột biến tại 531 (TCG→TTG) (66,67%) làm thay đổi amino acid Ser →Leu. Chủng nhạy cảm với RIF không phát hiện thấy đột biến nào trên đoạn gen này. Nhiều quan sát về đột biến ở vùng nóng 81 bp của gen rpoB đã được công bố [1, 3, 4], khoảng 96% các chủng lao kháng RIF có đột biến ở vùng này của gen rpoB. Đột biến chủ yếu xảy ra ở các vị trí codon 516, 526, 531. Năm 2008, Gonul Aslan và cộng sự đã tiến hành thu thập 30 mẫu bệnh phẩm tại nhiều vùng khác nhau của Châu Á. Kết quả thu đươc 14 mẫu kháng RIF có đột biến tại codon 531 (64,2%), 516 (7,1%) [5]. Tại Việt Nam, Caws và các đồng tác giả (2006) đã xác định đột biến liên quan đến tính kháng đa thuốc trên 131 chủng vi khuẩn lao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Nghiêm Ngọc Minh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 97 - 102 100 được phân lập tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch. Kết quả đã xác định được 100 chủng có đột biến trên gen rpoB tại codon 531 (43%), 526 (31%), 516 (15%) [3]. Những kết quả nghiên cứu trên thế giới đều cho rằng đột biến ở gen rpoB chủ yếu là thay thế một nucleotide, ít có các đột biến phức tạp [12, 4]. Theo tác giả Lishi Qian và cộng sự năm 2002 đã nghiên cứu đột biến ở RRDR (rifampin resistance determining region – vùng quyết định kháng RIF) của gen rpoB trên 66 chủng vi khuẩn lao được thu thập ở 4 nước Đông Á là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Trong số các chủng vi khuẩn lao đó có 59/66 (89,4%) được xác định là có đột biến. Ở các chủng đột biến đã xác định trình tự cho thấy mỗi chủng chỉ có một đột biến điểm ở một codon. Có 58/59 trường hợp là đột biến thay thế, chỉ có 1 trường hợp duy nhất là đột biến thêm nucleotide [10] Như vậy, các mẫu lao kháng thuốc được thu thập từ nhiều nơi trên thế giới có đặc điểm chung đó là xảy ra đột biến tại codon 516, 531 với dạng đột biến điển hình là 531 Ser→Leu với một tần suất rất cao (66,67%). Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn thống nhất với các công bố trong và ngoài nước. Hình 3. So sánh trình tự nucleotide các chủng nghiên cứu với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Nghiêm Ngọc Minh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 97 - 102 101 Hình 4. So sánh trình tự acid amin các chủng nghiên cứu với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv KẾT LUẬN Đoạn gen rpoB của 7 chủng M. tuberculosis nghiên cứu thu nhận từ Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương đã được nhân lên thông qua phản ứng PCR. Tách dòng, tạo vector tái tổ hợp, tách chiết DNA plasmid có chứa đoạn gen rpoB và xác định trình tự đã được thực hiện thành công. Tiến hành xác định trình tự và phát hiện đột biến trên gen rpoB 571 bp của 6 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thì có chủng TB02-111 xuất hiện dạng đột biến thay thế một nucleotid tại codon 516 Asp→Val, và đột biến tại codon 531 Ser →Leu ở 4 chủng TB02-115, TB02-116, TB02-117, TB02-122 của gen rpoB. Điều này cũng phù hợp với những công bố thường gặp nhất về đột biến sai nghĩa tại codon 516 và codon 531 của các tác giả trong nước và trên thế giới. Lời cảm ơn Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài nhánh “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn lao và lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử” thuộc chương trình KC10/06-10. Một số kết quả xác định trình tự được thực hiên trên các thiết bị của phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Andréia Rosane M. Valim, Maria Lucia R., et al (2000), “Mutations in rpoB Gene of Multidrug Resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Brazil”, J. Clin. Microbiol, 38: 3119-3122. [2]. Bộ Y Tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. [3]. Caws, M., Duy, P. M., Tho, D. Q., Lan, N. T. N., Hoa, D. V., Farrar, J. (2006), “Mutations Prevalent among Rifampin and Isoniazid Resistant Mycobacterium tuberculosis Isolate from a Hospital in Vietnam”, J. Clin. Microbiol. 44: 2333-2337 [4]. Cavusoglu, C., Hilmioglu, et al (2002), “Characterization of rpoB mutations in rifampin- resistant clinial isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing and Line Probe Assay”, J. Clin. Microbiol. 40: 4435-4438. [5]. Gonul Aslan and et al (2008), “Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug resistant clinical mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Tukey”, Jpn. J. Infect. Dis., 61, 255-260 [6]. James M (1995) Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights. Clinical Microbiol Rev 8: 496-514. [7]. Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi Sinh Vật Y học, Nhà Xuất bản Học viện Quân Y, Hà Nội. [8]. Palomino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V. (2007), Tuberculosis 2007 – from basic science to patient care, www.tuberculosistextbook.com [9]. Phạm Hùng Vân (2007) Các quy trình kỹ thuật sinh học phân tử thường được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu y sinh học. (http:www.nk-biotek.com.vn). [10]. Qian, L., Abe, C., Lin, T.P., Lin, T.P., Yu, M.C., Cho, S.N., Wang, S., Douglas, J.T. (2002), “rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from East Asian countries” J. Clin. Microbiol., 40, pp. 1091-1094. [11]. Tuberculosis (2007), External gene search for ‘Rv0667’, [12]. Telenti, A., Imboden, P., Marchesi, F., Lowrie, D., Cole, S., Colston, M.J., Matter, L., Schopfer, K., Bodmer, T. (1993), “ Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, Lancet 341, pp. 647-650. 13. Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Nghiêm Ngọc Minh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 97 - 102 102 SUMMARY DEFINITION OF MUTATION IN THE RPOB GENE CONCERNING WITH RIFAMPICIN RESISTANCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COLLECTED IN NORTHERN VIETNAM Nghiem Ngoc Minh1∗, Nguyen Van Bac1, Vu Thi Mai1, Cung Thi Ngoc Mai1, Nguyen Thai Son2 1Institute of Biotechnology, 2Hospital 103 – Vietnam Military Medical University Mycobacterium tuberculosis (MTB) is a pathogenic bacterial species in the genus of Mycobacterium causing most cases of tuberculosis. As reported by WHO tuberculosis threatens the health of one third of the world’s population. The most facing problem which makes tuberculosis become more seriously is the appearance of antibiotic-resistant TB strains classified as Multi-drug Resistant TB (MDR-TB), Extensively Drug Resistant (XDR) and TB co-infected with HIV/AIDS. screening and detecting drug-resistant strains would help the treatment and diagnosis for tuberculosis more effective in patients. Advantages in molecular biological techniques such as PCR allow researchers rapidly, exactly identify the drug-resistant M. Tuberculosis strains isolated from patients. In this study, primer pairs rpoB-F1 and rpoB-R1 were designed to amplify the rifampicin resistance determining region (RRDR) including 27 codon of the rpoB gene. After amplified sequences of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from 7 patients of the Tuberculosis and Lung hospital in Hanoi, they were frowarded for sequencing. The results of sequence analysis showed that a mutation at the codon 516 (GAC→GTC) and 531(TCG→TTG ) were detected. And this result was useful method to change the treatment for these patients. Key words: Gen rpoB, multi-drug resistant, Mycrobacterium tuberculosis, rifampicin. ∗ Tel: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên