Xạ khuẩn streptomyces chartreusis CP23X9 sinh Xylanase: đặc điểm sinh học và phân loại - Vũ Văn Lợi

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50 45 XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 SINH XYLANASE: ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI Vũ Văn Lợi, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Thị Hồng Liên, Phạm Thị Bích Hợp, Phan Thị Hồng Thảo* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *pthongthao@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Xylan là thành phần chính của hemicellulose, được cấu tạo từ các phân tử D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên. Sự phân hủy xylan bởi xylanase được nghiên cứu nhiều ở vi sinh vật, đặc biệt là nấm và xạ khuẩn. Hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh xylanase cao được quan tâm bởi tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chúng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp giấy và bột giấy. Trong nghiên cứu này, chủng CP23X9 có khả năng phân hủy xylan đã được mô tả đặc điểm sinh học và phân loại. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn xanh và vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử trên từng chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng CP23X9 sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, ở điều kiện nhiệt độ, pH khá rộng (nhiệt độ 15-45oC; pH = 5-10) và chịu được nồng độ muối NaCl đến 6%. Xạ khuẩn CP23X9 có khả năng đồng hoá nhiều loại đường như D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và L- rhamnose. Đặc biệt, chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) và không sinh cellulase. Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng với khóa phân loại xạ khuẩn ISP, khóa phân loại của Bergey và kết quả phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 có đặc điểm tương đồng cao (99%) với loài Streptomyces chartreusis. Hoạt tính xylanase của Streptomyces chartreusis CP23X9 có thể ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy. Từ khóa: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, đặc điểm sinh học, phân loại xạ khuẩn, xylanase. MỞ ĐẦU Xylan là thành phần chính của hemicellulose, chiếm 20-35% khối lượng chất khô. Thành phần của xylan bao gồm mạch chính được cấu tạo bởi đường D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên O- acetyl, α-L-arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl. Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự tham gia hoạt động của tổ hợp xylanase [4]. Đến nay, xylanase từ vi sinh vật được quan tâm chú ý mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như bột giấy, thức ăn chăn nuôi, chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học và công nghiệp đồ uống. Xylanase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài vi sinh vật khác nhau như vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn (Penicillium janthinellum, Arthrobacter sp., Streptomyces cyaneus, S. albus, S. Chromofuscus và S. chartreusis) [2, 5, 8]. Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn được công bố có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và không có hoạt tính cellulase [8]. Sử dụng xylanase trong tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lượng chlorine (Cl2) và hypochlorine (ClO2) dùng trong trong tẩy trắng, đồng thời giảm lượng hóa chất thải ra môi trường. Đến nay, xylanase từ S. albus và S. chromofuscus đã được ứng dụng thành công trong tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ chủng S. albus giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% và xylanase từ S. chromofuscus có hiệu quả tẩy trắng tăng 9,1% so với không xử lý [8]. Trong bài này, chúng tôi nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn CP23X9 sinh xylanase cao nhằm ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chủng xạ khuẩn và vi sinh vật kiểm định: Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, Escherichia coli PA2, Staphylococcus aureus 208P và Candida albicans nhận từ bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Vu Van Loi et al. 46 Môi trường nuôi cấy và phân loại: các môi trường theo ISP (International Streptomyces Project). Môi trường GI (g/l): Oat spelts xylan 5; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.H2O 0,0; pH 7,2-7,5. Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.H2O 0,01; pH 7,2-7,5. Môi trường Gause II (g/l): Glucose 10; pepton 5; cao thịt 0,5; NaCl 5; pH 7,2-7,5. Phương pháp Phương pháp xác định hoạt tính xylanase Hoạt tính xylanase được xác định bằng đo lượng đường khử giải phóng ra từ 0,5% (w/v) oat spelts xylan, sử dụng 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS) là chất phản ứng [3] và D-xylose làm đường chuẩn. Một đơn vị hoạt tính enzyme xylanase được định nghĩa là lượng enzyme cần để giải phóng ra 1µmol xylose từ oat spelts xylan 0,5% (w/v) trong điều kiện thí nghiệm [7]. Phân loại CP23X9 bằng quan sát đặc điểm hình thái, phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA Nghiên cứu đặc điểm sinh học theo phương pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại Bergey [6, 12]. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tan tiết ra môi trường được đánh giá theo Shirling và Gottlieb (1966) trên bảng màu của Tresner & Backus [10, 11]. Hình dạng cuống sinh bào tử và bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử JSM-5000. Phân tích trình tự gen 16S rDNA DNA tổng số của chủng CP23X9 được tách chiết theo phương pháp của Sambrook & Russell (2001) [9]. Gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi GF1 (5'- TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và GR1 (5’-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm SeqAssem version 01/2005 và Sequencher version 4.0.5. Mức độ tương đồng gen 16S rDNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các trình tự gen 16S rDNA trong Genbank. Mức độ tương đồng di truyền của các chủng được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tuyển chọn xạ khuẩn sinh xylanase Từ các mẫu mùn gỗ mục đã phân lập được 12 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xylanase. Trong số đó, chủng CP23X9 sinh tổng hợp xylanase mạnh nhất (42,70 U/ml) được lựa chọn để định tên đến loài nhằm sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo (bảng 1). Bảng 1. Hoạt tính xylanase của một số chủng xạ khuẩn tuyển chọn Chủng Xylanase (U/ml) Chủng Xylanase (U/ml) CP5X1 36,75 CP18X3 34,38 CP6X5 27,33 CP18X21 23,32 CP12X7 21,34 CP20X2 36,07 CP13X8 22,79 CP22X6 25,59 CP13X11 30,86 CP23X9 42,70 CP16X6 33,25 CP25X11 24,13 Chủng xạ khuẩn tuyển chọn có hoạt tính xylanase tương đương với hoạt tính xylanase thu nhận từ các chủng xạ khuẩn được một số tác giả công bố trên thế giới như Streptomyces chartreusis L1105 (45,16 U/ml), S. albus (32,53 U/ml), S. chromofuscus (43,01U/ml) [2, 8]. Đặc điểm sinh học của chủng CP23X9 Đặc điểm nuôi cấy Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn vàng xám, sinh trưởng tốt trên các môi trường ISP1- 3, ISP5-7, Gause I, Gause II và sinh trưởng yếu TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50 47 trên môi trường ISP4 và Gause I. Khuẩn ty khí sinh có màu vàng trên môi trường ISP1 và ISP6, màu xanh trên ISP2-ISP5, Gause I và Gause II. Trên các môi trường ISP1, ISP4, ISP5, ISP6 và Gause I, khuẩn ty cơ chất có màu vàng và có màu xám trên ISP2, ISP3, ISP7 và Gause II. Chủng CP23X9 không tạo sắc tố melanin trên các môi trường nghiên cứu (hình 1a, 1b). Hình 1. Khuẩn lạc mặt trước (a), mặt sau (b), bề mặt bào tử (c) và cuống sinh bào tử (d) của chủng CP23X9. Đặc điểm bào tử dưới kính hiển vi điện tử Chủng CP23X9 được nuôi trên môi trường ISP2 sau 5 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử JSM-5000 ở độ phóng đại 5000 lần cho thấy, cuống sinh bào tử của chủng CP23X9 có dạng xoắn (S) (hình 1d), trên một chuỗi có khoảng 10-50 bào tử. Ở độ phóng đại 10000 lần, bề mặt bào tử dạng gai (sp) (hình 1c). Đặc điểm sinh lý sinh hóa Nghiên cứu khả năng đồng hóa các nguồn đường là chỉ tiêu quan trọng để tiến hành phân loại xạ khuẩn theo khóa phân loại của Nomomura trong ISP (1974) [6]. Kết quả cho thấy chủng CP23X9 có khả năng đồng hoá nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi trường có bổ sung D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose, phát triển yếu trên môi trường có lactose, D-fructose và saccharose nhưng không phát triển trên môi trường có sorbitol. Xạ khuẩn CP23X9 có thể sinh trưởng được ở điều kiện nhiệt độ từ 15- 45C, pH 5-10 và chịu được nồng độ muối NaCl tới 6% w/v. Dịch nuôi cấy từ chủng CP23X9 có khả năng ức chế một số chủng vi khuẩn kiểm định như Bacillus subtilis 6630, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus 208P. Tuy nhiên, chủng này lại không có khả năng ức chế Sarcina lutea, Escherichia coli PA2 và nấm Candida albicans. Chủng có hệ enzyme ngoại bào phong phú như ligninase, protease, amylase, nhưng không sinh tổng hợp cellulolase. Định tên đến loài chủng CP23X9 Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng nghiên cứu theo các khóa định tên loài xạ khuẩn trong ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey, chúng tôi xác định chủng CP23X9 có thể xếp vào nhóm xạ khuẩn Streptomyces. Tuy nhiên, để phân loại chủng CP23X9 đến loài, cần kết a b c d Vu Van Loi et al. 48 hợp kết quả về đặc điểm sinh hóa và trình tự gen 16S rDNA. Từ kết quả xác định trình tự cho thấy, gen 16S rDNA của chủng CP23X9 có độ tương đồng cao (98-99%) với các gen tương ứng của một số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình 2): S. chartreusis XSD08102, S. chartreusis DA10203, S. chartreusis HA10304, S. chartreusis DSM41255 (99%), S. flavovariabilis 1184, S. phaeoluteigriseus ISP5182, S. bobili NBRC13199, S. galilaeus JCM 4757, S. pseudovenezuelae HBUM174623 (98%). Như vậy, kết quả phân loại cho thấy chủng xạ khuẩn CP23X9 có đặc điểm rất gần gũi và có độ tương đồng cao với loài Streptomyces chartreusis nên chủng xạ khuẩn này được đặt tên là Streptomyces chartreusis CP23X9. Hình 2. Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces chartreusis CP23X9 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA Khả năng sinh tổng hợp xylanase Trong những năm gần đây, khả năng sinh tổng hợp xylanase từ các chủng xạ khuẩn cũng được nhiều tác giả công bố như S. cyaneus [5], S. albus, S. chromofuscus [8], Streptomyces sp. Lb24 [7], S. chartreusis [2] và Streptomyces AMT-3 [40]. Theo Li et al. (2011) [2], chủng S. chartreusis L1105 sinh xylanase đạt cực đại (45,16 U/ml) sau 7 ngày trên môi trường sử dụng oat spelt xylan làm nguồn cacbon. Chủng xạ khuẩn CP23X9 trong công bố này thể hiện khả năng sinh tổng hợp xylanase cao (42,70 U/ml) không sinh tổng hợp cellulose và qua phân loại cho thấy đây là một trong những loài xạ khuẩn có ý nghĩa trong việc ứng dụng xử lý tẩy trắng bột giấy đã được nhiều tác giả công bố. Thí dụ, sau quá trình ủ bột giấy với xylanase từ S. chartreusis L1105, S. Thermoviolaceus và Streptomyces sp. QG-11-3 hệ số kappa (thể hiện mức độ khử lignin) giảm lần lượt là 12,2; 16 và 23% [2]. Sử dụng xylanase từ chủng S. albus giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% so với không xử lý. Trong khi đó, hiệu quả tăng độ sáng của bột giấy nhận được là 9,1% khi sử dụng xylanase từ S. chromofuscus [8]. Khả năng sinh tổng hợp xylanase của Streptomyces chartreusis CP23X9 trong nghiên cứu này đạt tới 42,70 U/ml cho thấy là đây là một trong những chủng xạ khuẩn bản địa quí, có triển vọng trong xử lý tẩy trắng bột giấy. TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50 49 KẾT LUẬN Chủng CP23X9 phân lập từ gỗ mục, sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, trong khoảng nhiệt độ và pH khá rộng (nhiệt độ 15- 45oC; pH 5-10) và chịu được nồng độ NaCl đến 6%. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn xanh hoặc vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử trên từng chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng có hệ enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) và không sinh cellulase. Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng nghiên cứu theo các khóa phân loại ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey và kết hợp với kết quả phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 thuộc loài Streptomyces chartreusis với độ tương đồng 99%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bajai B. K., Razdan K., Sharma A., 2010. Thermoactive alkali-stable xylanase production from a newly isolated Streptomyces sp. SU9. Indian J. Chem. Technol., 17: 375-380. 2. Li X., Sun B., Zhao J., Lv Y., Song H., Li E., Zhu Y., 2011. Production and improved bleaching abilities of a thermostable xylanase from a newly isolated Streptomyces chartreusis strain. Afr J. Biotechnol., 10(64): 14132-14142. 3. Miller L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem., 31: 426-431. 4. Nascimento R. P., Coelho R. R. R., Marques S., Alves L., Gírio F. M., Bon E. P. S., Amaral-Collaco M. T., 2002. Production and partial characterisation of xylanase from Streptomyces sp. strain AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil. Enzyme Microb. Technol., 31: 549-555. 5. Ninawe S., Kapoor M., Kuhad R. C., 2008. Purification and characterization of extracellular xylanase from Streptomyces cyaneus SN32. Bioresour. Technol., 99: 1252-1258. 6. Nomomura H., 1974. Key for classification and identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP. J. Ferment. Technol., 52(2): 78-92. 7. Rawashded R., Saadoun I., Mahasneh A., 2005. Effect of cultural conditions on xylanase production by Streptomyces sp. (strain Ib 24D) and its potential to utilize tomato pomace. Afr. J. Biotechnol., 4(3): 251-255. 8. Rifaat H. M., Nagieb Z. A., Ahmed Y. M., 2005. Production of xylanase by Streptomyces species and their bleaching effect on rice straw pulp. Appl. Ecol. Environ. Res., 4(1): 151-160. 9. Sambrook J., Russell D. W., 2001. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 10. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966. Cooperative description of type culture of Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol., 19(4): 391-512. 11. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966. Methods for characterisation of Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol., 16(3): 313-340. 12. Wilkins W., 1989. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2, Vol. 3, Vol. 4. Publisher Springer-Verlag, New York. Vu Van Loi et al. 50 STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 PRODUCING XYLANASE: BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND CLASSIFICATION Vu Van Loi, Nguyen Van Hieu, Nguyen Thi Hong Lien, Pham Thi Bich Hop, Phan Thi Hong Thao Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Xylan is the major component of hemicellulose that makes up for plant cell. It is constructed by 1,4-β- linked-D-xylopyranosyl units with several side-groups. Xylan can be degraded by xylanase from microorganisms such as fungi, bacteria and actinomyces. Enzyme xylanase is widely applied in industry, such as textile, paper and pulp, and food production. In this study, an Actinomyces strain CP23X9 producing xylanase was characterized and identified. The results showed that strain CP23X9 can grow well on different media with a wide range of temperature between 15-45oC; pH 5-10, and salinity of 0-6%. On the agar plate, the strain has blue aerial mycelia and pale yellow vegetative mycelia. The mature spore chains appeared spirals, moderately long, bearing 10 to 50 spores each; the spore surface spiny. The strain utilized carbon sources such as D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose. Strain CP23X9 capable of extracellular enzymes producing, such as ligninase, protease, amylase and with high xylanase activity (42.7 U/ml). Based on the biological characteristics and phylogenetic analysis of 16S rDNA, it can be concluded that strain CP23X9 is close to Streptomyces chartreusis (99%), hence identified as Streptomyces chartreusis CP23X9. The xylanase activity of Streptomyces chartreusis CP23X9 will be used in improved bleaching abilities in future Keywords: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, Actinomyces classification, biological characteristics, xylanase. Ngày nhận bài: 30-6-2013