Vai trò của đa hình rs6010620 gen RTEL1 trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 1 VAI TRÒ CỦA ĐA HÌNH rs6010620 GEN RTEL1 TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM Lê Thị Hằng¹, Nguyễn Quý Hoài¹, Nguyễn Quý Linh¹, Nguyễn Thị Thu Hiền², Trần Huy Thịnh¹, Tạ Thành Văn¹, Trần Vân Khánh¹, Kiều Đình Hùng¹ ¹Trường Đại học Y Hà Nội, ²Bệnh viện K Trung ương Tính đa hình đơn (SNP) của gen ức chế ung thư RTEL1 được xem là nhân tố quan trọng đối với sự tiến triển của bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng kiểu gen GG của gen RTEL1 rs6010620 được xem là có nguy cơ mắc bệnh cao. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xác định tính đa hình rs6010620 của gen RTEL1 ở nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm so với nhóm chứng. Kết quả giải trình tự gen RTEL1 cho thấy tỷ lệ genotype AA, GA, GG ở nhóm bệnh nhân là 38,8%, 47,4%, 13,8% và nhóm chứng là 41,2%, 56,3% và 2,5%. Sự khác biệt giữa nhóm chứng và nhóm bệnh của kiểu gen GG là có ý nghĩa thống kê, chỉ ra rằng người mang kiểu gen GG của gen RTEL1 có khả năng mắc bệnh cao hơn. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ khóa: u nguyên bào thần kinh đệm, RTEL1, rs6010620 U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) là một trong các khối u não phổ biến nhất, chiếm khoảng 12 là 15% của tất cả các khối u não [1]. U nguyên bào thần kinh đệm thường hình thành trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng, và có thể thành khối u lớn trước khi xuất hiện những triệu chứng đầu tiên nên biểu hiện lâm sàng bằng hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng nề. Tổ chức Y tế Thế giới phân loại u nguyên bào thần kinh đệm như một u tế bào hình sao (Astrocytoma) cấp III và IV với độ ác tính cao, với thời gian sống trung bình của bệnh nhân chỉ là 15 tháng sau khi điều trị kết hợp hóa trị và xạ trị [2]. Do đó, phát triển những phương pháp chẩn đoán và điều trị mới đối với u nguyên bào thần kinh đệm là vô cùng cần thiết. Hiện nay, cùng với những đột phá trong y học, cơ chế phân tử của ung thư nói chung và u nguyên bào thần kinh đệm nói riêng đang dần được làm sáng tỏ. Những nghiên cứu đầu tiên về những tổn thương gen trong u nguyên bào thần kinh đệm đã được bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ 20, đã cho thấy vài trò quan trọng của một số gen trong bệnh sinh ung thư như thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (epidermal growth factor receptor, EGFR), gen ức chế ung thư TP53 [3]. Bên cạnh đó một số gen đánh giá mức độ ác tính và biệt hoá, hay kiểm soát sự phân chia của tế bào ung thư như RTEL1 cũng được xem xét và đánh giá trong u nguyên bào thần kinh đệm [4]. RTEL1 (regulator of telomere length-1) là Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa Sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 06/03/2017 Ngày được chấp nhận: 28/6/2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 20172 DNA helicase quan trọng giúp ổn định cấu trúc bậc hai của DNA và duy trì sự nguyên vẹn của telomere. RTEL1 điều khiển quá trình tái tổ hợp nhiễm sắc thể trong nguyên phân và giảm phân [5]. Trong những năm qua, các nhà khoa học đã đưa ra bằng chứng chứng minh các đột biến điểm trên gen RTEL1 làm tăng nguy cơ mắc các bệnh u não, u thần kinh đệm, hội chứng Hoyeraal-Hreidarsson. [6 - 8] Tuy nhiên, hiện nay rất ít nghiên cứu tiến hành để xác định xem RTEL1 được điều khiển như thế nào hay helicase RTEL1 đã lôi kéo các telomere tham gia thực hiện các chức năng của chúng ra sao trong quá trình phát sinh và tiến triển ung thư. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đột biến điểm đơn nucleotide (SNP) của gen RTEL1 có liên quan mật thiết tới các bệnh này. Một nghiên cứu thuộc Trường Đại học Y Xinan, Tứ Xuyên, Trung Quốc đã nghiên cứu trên 110 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm và 134 người khỏe mạnh, nhằm mục đích điều tra mối liên hệ giữa telomera kéo dài helicase1 (RTEL1) đa hình của gen và sự nhạy cảm đối với u nguyên bào thần kinh đệm với kết luận kiểu gen GG của SNP rs6010620 tăng nguy cơ u nguyên bào thần kinh đệm [7-10]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đa hình đơn SNP rs6010620 gen RTEL1 và mối liên quan của đa hình gen này với bệnh u nguyên bào thần kinh đệm trên bệnh nhân Việt Nam. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Nhóm bệnh gồm 80 bệnh nhân được chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm bằng mô bệnh học tại Bệnh viện Việt Đức Nhóm chứng gồm 80 người khỏe mạnh, không có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan nào, không mắc các bệnh mãn tính, đặc biệt là các bệnh lý về phổi. 2. Phương pháp 2.1. Thu thập mẫu Thu thập mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm và nhóm chứng. 2.2. Tách chiết DNA DNA được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi của bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm và người lành đối chứng. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết bằng phương pháp đo quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1.8 ÷ 2.0. 2.3. Xác định kiểu gen RTEL1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Vùng gen chứa SNP rs6010620 của gen RTEL1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, được thiết kế bởi phần mềm Primer 3, có trình tự: Mồi xuôi: 5’- TGT GTG GCC TCT TCC TTT C -3’ Mồi ngược: 5’-GCT GCT CCT CTC AAC ATC TC -3’ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94°C/5 phút, 35 chu kỳ [94°C/30 giây, 56°C/30 giây, 72°C/30 giây], 72°C/5 phút. Mẫu được bảo quản ở 4°C. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%, sau đó được tinh sạch để tiến hành giải trình tự. Giải trình tự gen theo quy trình sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Sau đó được phân tích trên hệ thống ABI Prism 310 (Applied Biosystems). 2.4. Xử lý số liệu thống kê. Xử lý số liệu theo phương pháp thông kê y học dựa vào phần mềm thống kê SPSS. 3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 3 Đề tài tuân thủ đạo đức trong nghiên cứu về Y học. Các đối tượng tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu. Các thông tin liên quan đến đối tượng tham gia nghiên cứu được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ 1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu Bảng 1. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu Nhóm Tuổi Nhóm bệnh n = 80 Nhóm chứng n = 80 p ≤ 40 10 12,5% 11 13,8% p = 0,5 40 - 60 49 61,3% 54 67,5% ≥ 60 21 26,2% 15 18,8% Tổng 80 100% 80 100% Bảng 1 cho thấy đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu. Theo đó, tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm thấp ở nhóm tuổi dưới 40 (12,5%), cao ở nhóm từ 40 đến 60 tuổi (61,3%)và giảm dần ở nhóm trên 60 tuổi (26,2%). Không có sự khác biệt về độ tuổi giữa nhóm chứng và nhóm bệnh nhân. Bảng 2. Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu Nhóm Giới Nhóm bệnh (n = 80) Nhóm chứng (n = 80) p Nam 51 63,8% 55 68,8% p = 0,5Nữ 29 36,2% 25 31,2% Tổng 80 100% 80 100% Bảng 2 miêu tả đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu. Tỷ lệ mắc bệnh trên nam giới cao hơn so với nữ giới (63,8% ở nam so với 36,2% ở nữ). Sự khác biệt về giới ở bệnh u nguyên bào thần kinh đệm là khác biệt có ý nghĩa. 2. Xác định tính đa hình SNP rs6010620 của gen RTEL1 ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm và người bình thường Vùng gen RTEL1 chứa SNP rs6010620 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 20174 đặc hiệu. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5%. Hình 1 là hình ảnh điện di sản phầm PCR khuếch đại vùng gen chứa SNP rs6010620 cho kết quả phù hợp với lý thuyết. Chất lượng sản phẩm tốt, gồm 1 băng duy nhất có kích thước 509 bp. Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen RTEL1 SNP rs6010620 MK: Marker 100bp; GB1-GB5: nhóm bệnh nhân; C1-C5: nhóm chứng;(-): chứng âm. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen có chứa đa hình đơn SNPrs6010620, gen RTEL1 được tinh sạch, giải trình tự bằng máy ABI-3100 và được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn của gen RTEL1 trên ngân hàng GeneBank (NG_033901). Hình 2. Hình ảnh giải trình tự đại diện của SNP rs6010620. Kết quả giải trình tự gen được trình bày ở hình 2. Kết quả cho thấy kiểu gen AA có một đỉnh nucleotide A duy nhất (bệnh nhân GB76); kiểu gen GA có hai đỉnh nucleotide G và nucleotide A (bệnh nhân GB17); kiểu gen GG có một đỉnh nucleotide G duy nhất (bệnh nhân GB2). TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 5 Hình 3. Tỷ lệ kiểu gen RTEL1 SNP rs6010620 của nhóm bệnh nhân và nhóm chứng Kết quả giải trình tự gen RTEL1 cho thấy với SNP rs6010620, kiểu gen AA chiếm tỷ lệ cao trong cả 2 nhóm: 48,8% ở nhóm bệnh và 53,8% ở nhóm chứng. Trong khi đó, tỷ lệ kiểu gen dị hợp AG trong nhóm bệnh và nhóm chứng là tương đồng nhau: 37,5% ở nhóm bệnh và 43,8% ở nhóm chứng. Ngược lại, kiểu gen đồng hợp GG chiếm tỷ lệ thấp nhất ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng: 13,8% ở nhóm bệnh và 2,5% ở nhóm chứng. Sự khác biệt tỷ lệ kiểu gen GG giữa nhóm bệnh và nhóm chứng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). IV. BÀN LUẬN Từ những nghiên cứu đột phá trong Y học, cơ chế phân tử của ung thư dần được sáng tỏ. Theo đó, chính sự tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn tới sự phát sinh, phát triển mọi dạng tế bào ung thư trong cơ thể. Quá trình chuyển dạng tế bào sang ác tính thường được đánh dấu bằng sự kích hoạt các gen gây ung thư và đột biến gây bất hoạt các gen áp chế ung thư nằm tại một số vị trí chủ chốt trên các con đường tín hiệu tế bào. Cơ chế điều hòa gen vốn hoạt động nhịp nhàng và chặt chẽ cũng bị rối loạn khiến hệ thống các enzym sửa chữa thương tổn gen của tế bào không thể khắc phục dẫn tới việc tích lũy một số lượng lớn các đột biến, khởi phát quá trình ung thư. Nhưng cũng chính các đột biến lại làm tăng ái lực của thuốc điều trị đích với các phân tử này và ức chế sự dẫn truyền tín hiệu trong các tế bào ung thư. Nhờ đó chúng làm tăng hiệu quả của thuốc điều trị đích trong việc tiêu diệt các tế bào ung thư [8]. Trong các loại u não, u nguyên bào thần kinh đệm là loại u rất ác tính, có thể hình thành khối u lớn trước khi xuất hiện triệu chứng. Đồng thời, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời gian sống của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 10 – 12 tháng. Do vậy, việc tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình sinh bệnh học của u nguyên bào thần kinh đệm để có thể can thiệp chính xác và hiệu quả, đồng thời đưa ra tiên lượng bệnh là điều rất cần thiết. Các nhà khoa học trên thế giới đã tìm thấy sự biến đổi một số gen như RTEL1, TP53, RB1, NF1, PIK3R1, ERBB2, EGFR, IDHl trong đó gen RTEL1 được phân loại như một gen ức chế khối u nếu gen bị đột biến, tế bào bị tổn thương DNA sẽ không được sửa chữa và kiểm soát, đó là cơ sở dẫn đến phát triển thành khối u [9]. Các đột biến hay gặp của gen trên u nguyên bào thần kinh đệm là các đột TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 20176 biến điểm. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy một số đa hình gen như SNPrs6010620, SNPrs2297440 trên intron 12 của gen RTEL1 có liên quan mật thiết tới nguy cơ mắc bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [10]. Trong nghiên cứu này, sau khi giải trình tự gen RTEL1 rs6010620, chúng tôi nhận thấy kiểu gen đồng hợp tử AA chiểm tỷ lệ cao nhất (38,8% ở nhóm bệnh và 41,2 % ở nhóm chứng) và kiểu gen GG chiếm tỷ lệ thấp nhất (13,8% ở nhóm bệnh và 2,5%) ở nhóm chứng. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố trên thế giới [10; 11]. Thêm vào đó, kiểu gen đồng hợp tử GG xuất hiện với tỷ lệ cao hơn trên nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm. Kết quả trên cho thấy kiểu gen GG có liên quan đến sự tăng nguy cơ mắc bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. Cũng thu được kết quả tương đồng như trên, Shujun Pei và cộng sự đã chỉ ra kiểu gen GG của SNP rs6010620 thường hay gặp ở bệnh nhân bị u nguyên bào thần kinh đệm, trong khi đó kiểu gen AG và AA thường hay gặp ở nhóm người bình thường, vì vậy người có kiểu gen GG tại vị trí SNP rs6010620 được xem như là người có nguy cơ cao bị bệnh [11]. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu về tính đa hình rs6010620 của gen RTEL1 ở nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm so với nhóm chứng cho thấy: Sự khác biệt giữa nhóm chứng và nhóm bệnh của kiểu gen GG là có ý nghĩa thống kê, người mang kiểu gen GG của gen RTEL1 có khả năng mắc bệnh cao hơn. Lời cám ơn Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu xác định đột biến một số gen trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma)” và sự giúp đỡ của các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Siegel R, Naishadham D, Jemal A (2012). Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 62, 10 – 29. 2. Kenneth A, Gelareh Z, Sheila M, Guido R, Andreas v.D. (2012). Glioblastoma: pathology, molecular mechanisms and markers. Acta Neuropathol. 129, 829 – 484. 3. Nagane M, Lin H. (2001). Aberrant receptor signaling inhuman malignant gliomas, mechanisms and therapeutic implications. Cancer Lett.162, 17 - 21 4. Soma G, Carl W, Anna M.D, Thomas B, Irina G. (2016). Genetic risk variants in the CDKN2A/B, RTEL1 and EGFR genes are associated with somatic biomarkers in glioma. J. Neurooncol. 127, 483 – 492. 5. Zhao W, Bian Y, Zhu W, Zou P, Tang G. (2014). Regulator of RTEL1 rs 6010620 polymorphism contribute to increased risk of glioma. Tumour Biol. 35, 5259 – 5266. 6. Ballew, B, J. et al (2013). A recessive founder mutation in regulator of telomere elongation helicase 1, RTEL1, underlies severe immunodeficiency and features of Hoyeraal- Hreidarsson syndrome. PLoS Genet. 9, 1-10 7. Xianfu C, Hongsheng C, Wu Z, Muhu C. (2012). Association between RTEL1 polymorphism and glioma susceptibility. Int. J Clin Exp Pathol. 9, 3957 – 3961. 8. Hanahan D, Weinberg RA (2000). The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57–70. 9. Gang L, Tianbo J, Hongjuan L, Chao C, Guodong G (2013). RTEL1 tagging SNPs and halotypes were associated with glioma development. Diagnostic Pathology. 8, 83-90. 10. Du SL, Geng TT, ChenC (2014). The RTEL1 rs6010620 polymorphism and glioma risk a meta-analysis based on 12 case – TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TCNCYH 108 (3) - 2017 7 control studies. Asian Pacific J. Can Prev. 15, 10175 – 10179. 11. Shujun P, Feng Z, Junle L, Qiang L, Peizhong S (2015). Association between RTEL1 polymorphism and susceptibility to glioma. Int J Exp Med. 8, 690 – 697. Summary THE ROLE OF TELOMERE ELONGATION HELICASE 1 (RTEL1) rs6010620 POLYMORPHISM TO GLIOBLASTOMA PATIENTS. Single nucleotide polymorphism (SNP) of tumor suppressor gene RTEL1 is considered an associated factor for the progression of glioblastoma. Previous studies showed that genotype GG of RTEL1 rs6010620 is correlated with high rate of glioblastoma. This study was performed to determine the ratio of SNP RTEL1 rs6010620 in glioblastoma patients. The sequencing data show the percentages of genotype AA, GA and GG in patients are 38.8%, 47.4%, 13.8% and the control are 41.2%, 56.3% and 2.5%, respectively. The difference between the patients and the control group is significant, with evidence that the genotype “GG” of rs6010620 was the protective genotype for glioma. Key words: glioblastoma, RTEL1, rs6010620