SUMMARY
Transcriptional activator, XlnR, has been known to play an important role in regulation of cell wall
degrading enzymes (CWDEs) in some pathogenic fungi. Here, we used RNA silencing to simultaneously
knock-down the expression of two XlnR like genes (Mg-XlnR) in the genome of rice blast fungus
Magnaporthe oryzae. Using Northern analysis, various levels of silencing of Mg-XlnR genes were observed in
knock-down mutants compared with those in the wildtype. Moreover, the reduction of MG-XLNR mRNA
observed in knock-down mutants resulted in the degradation of CWDEs mRNA and their extracellular
enzymes such as xylanases and cellulases. The decrease of blast lesions and their expansion on infected
leaves observed in silenced mutants indicated an important role of Mg-XlnR in regulation of CWDEs genes,
particularly xylanases and virulence of the rice blast fungus.
8 trang |
Chia sẻ: thucuc2301 | Lượt xem: 594 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Vai trò của các gen yếu tố phiên mã MG-XlNR liên quan đến hoạt động của các gen xylanases, cellulases và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn magnaporthe oryzae - Nguyễn Bảo Quốc, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119
112
VAI TRÒ CỦA CÁC GEN YẾU TỐ PHIÊN MÃ MG-XLNR LIÊN QUAN ĐẾN
HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC GEN XYLANASES, CELLULASES VÀ KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH CỦA NẤM ĐẠO ÔN Magnaporthe oryzae
Nguyễn Bảo Quốc1*, Nguyễn Ngọc Bảo Châu2
1Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh,
*baoquoc@hcmuaf.edu.vn
2Trường Đại học Mở tp. Hồ Chí Minh
TÓM TẮT: Yếu tố phiên mã XlnR có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của các gen liên
quan đến enzyme phá huỷ thành tế bào (CWDEs) của nấm bệnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng
công cụ ức chế gen (RNA silencing) để ức chế sự biểu hiện của hai gen yếu tố phiên mã MG-XLNR của
nấm đạo ôn. Phân tích bằng phương pháp Northern đã chỉ ra rằng các mức độ biểu hiện của hai gen này
suy giảm với nhiều mức độ khác nhau ở các mẫu đột biến khi so sánh với đối chứng. Sự suy giảm phân tử
mRNA MG-XLNR trên các mẫu đột biến cũng dẫn đến sự suy giảm không chỉ các phân tử mRNA của
CWDEs như xylanases, cellulases mà cả hoạt động của những enzyme phân hủy thành tế bào này. Sự suy
giảm các vết bệnh và mức độ lây lan của chúng trên lá cây ký chủ bị xâm nhiễm bởi các mẫu nấm đột biến
so với mẫu nấm đối chứng đã chỉ ra rằng các yếu tố phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn đóng vai trò rất
quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của các gen liên quan đến enzyme phá huỷ thành tế bào, đặc
biệt là các gen xylanases và đến khả năng gây bệnh trên cây trồng.
Từ khóa: Bệnh đạo ôn, ức chế gen, yếu tố phiên mã.
MỞ ĐẦU
Để lây nhiễm thành công, nấm gây bệnh đạo
ôn trên lúa thường hình thành các công cụ xâm
nhiễm như bào tử, giác bám và cọc xâm nhiễm
để phá huỷ lớp biểu bì và thành tế bào thực vật
[19]. Trong các công cụ xâm nhiễm của nấm
đạo ôn, giác bám đóng vai trò rất quan trọng
trong giai đoạn đầu gây bệnh vì nó có thể tấn
công tế bào cây ký chủ bằng cả hai cách là tạo
áp lực và tiết các enzyme phá hủy thành tế bào
theo dạng cơ học và hoá học nhằm tạo điều kiện
cho cọc xâm nhiễm tấn công vào bên trong để
lấy chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và phát triển
của nấm đạo ôn [6]. Việc sử dụng các enzyme
phân huỷ thành tế bào cây ký chủ của nấm bệnh
(CWDEs) được xem là một công cụ rất hiệu quả
để vượt qua rào cản thành tế bào nhằm tạo điều
kiện dễ dàng cho sự xâm nhiễm của nấm [22].
Có hai nhóm chính của CWDEs đóng vai trò rất
quan trọng liên quan đến khả năng xâm nhiễm
theo chiều dọc và chiều ngang của nấm đạo ôn
là endo-β-1,4 xylanases và cellulases [15, 21].
Hai nhóm này thường là một họ bao gồm nhiều
gen riêng lẻ qui định cùng một chức năng. Vì
vậy, việc xác định chức năng của từng gen bằng
phương pháp bất hoạt gen thường rất khó và
không hiệu quả do sự dư thừa chức năng. Có
nhiều phương pháp để khắc phục tình trạng này,
chẳng hạn như bất hoạt toàn bộ các gen riêng lẻ
trong một họ nhằm tạo một đột biến bất hoạt đa
gen. Tuy nhiên phương pháp này rất khó, mất
thời gian và không khả thi. Một phương pháp
khác là bất hoạt hoặc ức chế sự biểu hiện của
các gen yếu tố phiên mã như XlnR, ACEII kiểm
soát hoạt động của các họ gen liên quan đến
CWDEs [1]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
tập trung vào các gen dạng XlnR của nấm đạo
ôn. Gen XlnR được tìm thấy trên các nấm
Aspergillus niger, A. oryzae, Trichoderma
reesei, Fusarium oxysporum và có vai trò rất
rộng trong việc kiểm soát sự phiên mã của các
gen CWDEs mã hóa cho xylanases,
endoglucanase và hemicellulase [9, 16, 20].
Thông qua việc sử dụng công cụ BLAST, sự
hiện diện của hai gen tương đồng dạng XlnR
(MGG_01414.6 và MGG_02880.6, gọi chung là
Mg-XlnR) đã được xác định trong hệ gen của
nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae.
Chúng tôi sử dụng một công cụ di truyền ngược
gọi là ức chế sự biểu hiện của gen (RNA
silencing) để xác định chức năng của các gen
liên quan đến việc kiểm soát các hoạt động của
Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau
113
CWDEs trên nấm đạo ôn. Đồng ức chế hai gen
này bằng việc sử dụng phương pháp chọn lọc
mẫu đột biến ức chế (knock-down mutants) dựa
trên GFP fluorescence đã được phát triển và
ứng dụng trong các nghiên cứu trước đây [14,
15], chúng tôi đã chỉ ra vai trò của các gen Mg-
XlnR liên quan đến sự biểu hiện của các gen
CWDEs và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn
Magnaporthe oryzae. Việc tìm hiểu chức năng
của hai gen Mg-XlnR này sẽ được tiến hành và
đánh giá trong nghiên cứu này.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủng nấm, môi trường nuôi cấy và chuyển
gen trên nấm
Chủng nấm sử dụng trong nghiên cứu này là
Br48-GFP một dạng chủng có nguồn gốc từ
Br48 (một nòi lây nhiễm trên cây lúa mì) nhưng
có sự hiện diện của gen chỉ thị GFP [7]. Những
chủng này được giữ trong môi trường PDA
(potato dextrose agar) trong nhiều tháng. Các
chủng nấm này sẽ được nuôi cấy trong 100 ml
môi trường CM lỏng (0,3% casamino acids,
0,3% yeast extract, 0,5% sucrose) ở 26oC cho
việc chiết xuất RNA và tế bào nấm.
Tế bào nấm được chiết xuất bằng cách sử
dụng các enzyme có khả năng phân hủy thành tế
bào nấm (Sigma-Aldrich) và chuyển gen trên
nấm được tiến hành bằng phương pháp
polyethylen glycol (PEG) đã được mô tả trước
đây [12]. Trong quá trình chọn lọc đột biến ức
chế gen, các mẫu nấm chuyển gen sẽ được nuôi
cấy trong đĩa 96 lỗ chứa môi trường PDA và
GFP fluorescence của chúng sẽ được đo bằng
bằng máy Avro-SX (Perkin-Elmer, Hoa Kỳ) với
các bước sóng kích thích và phát tán lần lượt là
485 nm và 535 nm [14].
Cấu trúc ức chế gen
Một đoạn DNA của gen MGG_01414.6 gần
vùng 3’ có chiều dài khoảng 429 bp có trình tự
tương đồng cao với gen MGG_02880.6 được
khuếch đại PCR bằng cặp mồi: (5’
CATACTCCTGACGGGCAAGT 3’ và 5’
CACCTGTAGAGGGCCAGAAG 3’) sử dụng
DNA polymerase KOD Plus có khả năng hình
thành sản phẩm dùng để nhân dòng theo kiểu
thẳng đứng. Đoạn DNA sẽ được gắn vào cấu
trúc pSD1G ở vị trí EcoRV [14] hình thành cấu
trúc ức chế gen pSD1G-1414
Phân tích Northern blot
RNA tổng số của các mẫu nấm sẽ được tách
chiết bằng kit RNeasy Plant Mini của hãng
Qiagen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 16
microgram RNA tổng số sẽ được phân tách
bằng điện di trên gel agarose formadehyde
1,2%, sau đó được chuyển lên màng Hypond N+
(Amersham Bioscience). Dung dịch lai được sử
dụng trong thí nghiệm này là ULTRAhybTM
(Ambion) ở 68oC. Các đoạn dò RNA được
chuẩn bị theo hệ thống T7 và T3. Các đoạn mồi
để làm các đoạn dò được thể hiện trong bảng 1.
Phương pháp rửa màng và nhận biết tín hiệu lai
được thực hiện như đã mô tả trước đây [14].
Bảng 1. Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu
Gen Trình tự nucleotide Ghi chú
MGG_01414.6 – F 5’ CATACTCCTGACGGGCAAGT 3’
MGG_01414.6 5’ CACCTGTAGAGGGCCAGAAG 3’
Đoạn DNA dùng
đồng ức chế hai gen
Mg-XlnR
Fa10-F (MGG_01542.6) 5' CGTCGTCAACGAGATCTTCA 3'
Fa10-R (MGG_01542.6) 5' GGCGAGCCACTTCTTGAC 3'
Đoạn dò Fa10
(211 bp)
Fa11-F (MGG_08331.6) 5' GCAACAGCGGCAACTTTGT 3'
Fa11-R (MGG_08331.6 5' ACCGACCAGAACTGCTGAAA 3'
Đoạn dò Fa11
(301 bp)
Fa7 –F (MGG_07809.6) 5' CATGAACGGAGCTTCCAAGT 3'
Fa7 –R (MGG_07809.6) 5' ATCACGAGCACACTGAGCAT 3'
Đoạn dò Fa 7
(201 bp)
Phân tích enzyme phân huỷ thành tế bào
Sợi nấm được nghiền trong dung dịch đệm
bao gồm 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM
NaCl và 1% Nonidet P-40. Sau khi li tâm ở tốc
độ 10.000x g trong thời gian 10 phút. Nồng độ
protein trong dung dịch phía trên được đánh giá
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119
114
bằng kít Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad).
Protein chiết xuất được pha với dung dịch phân
tích enzyme bao gồm 5 mM 4-
methylumbeliferyl-beta-D-xylopyranoside trong
dung dịch đệm umbeliferone (50 mM Na2PO4
+ NaH2PO4, 1 mM mMb-mercaptoethanol, 5
mM EDTA). Hoạt động của enzyme xylanases
được đo bằng đĩa 96 giếng sử dụng máy Avro-
SX với các bước sóng kích thích và phát tán lần
lượt là 365 nm và 460 nm sau khi ủ mẫu trong
điều kiện tối ở nhiệt độ 30oC trong thời gian là 2
giờ. Đánh giá hoạt động của enzyme cellulases
được tiến hành theo phương pháp Somogyi-
Nelson như đã được mô tả trước đây [13, 17].
Chủng bệnh
Giống lúa mì Norin 4 được dùng để chủng
bệnh ở giai đoạn cây con trong thí nghiệm này.
Các cây con được trồng trong những chậu
plastic chứa đất Sakata Supermix (Sakata,
Yokohama, Nhật Bản) trong nhà kính ở nhiệt độ
25-30oC trong thời gian 3 tuần. Thao tác chuẩn
bị bào tử, chủng bệnh, lấy mẫu được tiến hành
theo quy trình đã đươc miêu tả trước đây [11].
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Đồng ức chế sự biểu hiện của các gen Mg-
XlnR của nấm đạo ôn bằng phương pháp ức
chế gen (RNA silencing)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng
cấu trúc ức chế gen pSilent-Dual1 (pSD1) với
phương pháp chọn lọc đột biến dựa trên GFP
fluorescence [14] để ức chế đồng loạt hai gen
Mg-XlnR (MGG_01414.6 và MGG_02880.6).
Để làm được việc này chúng tôi sử dụng một
đoạn 429 bp của gen MGG_01414.6 ở vùng 3’
có trình tự nucleotide tương đồng cao giữa hai
gen. So sánh trình tự của đoạn DNA của vùng
bảo tồn này với gen MGG_02880.6 đã chỉ ra
rằng, đoạn DNA của gen MGG-01414.6 tương
đồng khoảng 61% đối với gen MGG_02880.6
với chỉ số bắt cặp hoàn hảo (perfect match) lên
đến 11 nucleotide (hình 1). Đoạn DNA này
được gắn kết vào trong cấu trúc ức chế gen
pSD1G. Khoảng mười đến mười lăm mẫu nấm
chuyển gen có khả năng mọc trên môi trường
CM agar với kháng sinh Geneticin sẽ được chọn
lọc dựa trên sự suy giảm GFP fluoresence do bị
ức chế (một dạng chỉ thị). Các mẫu nấm này sẽ
được tiếp tục phân tích để xác định mức độ
đồng ức chế của hai gen Mg-XlnR bằng phương
pháp Northern blot. Kết quả chỉ ra rằng lượng
phân tử mRNA Mg_XlnR của các mẫu nấm
mang cấu trúc ức chế suy giảm ở nhiều mức độ
khác nhau khi so với đối chứng (hình 2A). Điều
này chỉ ra rằng đồng ức chế hai gen Mg-XlnR
trên đã được thực hiện thành công bằng phương
pháp ức chế gen (RNA silencing).
Ký hiệu gen Đoạn DNA của gen MGG_01414.6 (vùng bảo tồn) Chỉ số bắt cặp hoàn hào
MGG_01414.6 100% -
MGG_02880.6 61% 11 nt
Hình 1. Sơ đồ vùng bảo tồn của hai gen MG-XLNR (màu đen) và phân tích tính tương đồng của
trình tự của chúng cho việc đồng ức chế hai gen
Ưu thế của phương pháp ức chế gen so với
phương pháp bất hoạt gen (gene disruption) là
có khả năng tạo các đột biến đa gen hoặc cả một
họ gen có trình tự tương đồng. Phương pháp
này được đánh giá là nhanh và hiệu quả trong
các nghiên cứu chức năng của gen và đã được
sử dụng thành công trong việc xác định chức
năng của các họ gen như họ gen endoxylanases,
celulases, OSRac và hydrophobins trong các
nghiên cứu trước đây [8, 10, 15, 21]. Đột biến
ức chế gen (knock-down mutant) thường không
loại bỏ hết các phân tử mRNA chủ đích như đột
biến bất hoạt gen (knock-out mutant) mà chỉ
làm suy giảm lượng phân tử mRNA dẫn đến sự
suy giảm kiểu hình. Phương pháp này giúp hạn
chế những khó khăn trong việc xác định chức
Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau
115
năng gen nhất là những gen quan trọng, có khả
năng gây chết trên sinh vật. Tuy nhiên, nó cũng
có nhược điểm là đôi khi khó xác định được sự
thay đổi kiểu hình do mức độ biểu hiện của các
phân tử mRNA chủ đích khác nhau. Chính vì
vậy, việc xác định các đột biến ức chế mạnh
thông qua đồng ức chế với gen chỉ thị GFP như
được mô tả trước đây [14]) sẽ giúp cho kết quả
phân tích được chính xác hơn.
Hình 2. Phân tích Northern các mẫu đột biến ức chế Mg-XlnR của nấm đạo ôn. Lượng sử dụng bằng
nhau của phân tử RNA tổng số được thể hiện bằng rRNA được nhuộm bằng ethidium bromide. WT,
chủng bố mẹ (Br48-GFP), A3, A6, B7 là các đột biến ức chế (RNAi mutants). Các đoạn dò được sử
dụng trong phân tích Northern bao gồm đoạn dò MGG_01414.6 để nhận biết các phân tử mRNA
Mg-XlnR; đoạn dò Fa10 (MGG_01542.6) dùng để nhận biết các phân tử mRNA xylanase họ 10;
đoạn dò Fa11 (MGG_08331.6) dùng để nhận biết các phân tử mRNA xylanase họ 11; đoạn dò Fa7
(MGG_07809.6) dùng để nhận biết các phân tử mRNA cellulases họ 7.
Gen yếu tố phiên mã Mg-XlnR kiểm soát hoạt
động của các gen CWDEs của nấm đạo ôn
Dựa trên kết quả đồng ức chế hai gen Mg-
XlnR của nấm đạo ôn, chúng tôi chọn ra hai
mẫu đột biến đồng ức chế hai gen Mg-XlnR là
mẫu A6 (ức chế mạnh) và mẫu B7 (ức chế
tương đối) khi so với mức độ biểu hiện của
phân tử mRNA Mg-XlnR đối chứng và một mẫu
không bị ức chế là mẫu A3 để tiếp tục phân tích
Northern với các đoạn dò có trình tự bảo tồn
cao với các gen trong họ gen xylanases như
Fa10 (MGG_01542.6), Fa11 (MGG_08331.6)
và cellulases như Fa7 (MGG_07809.6). Kết quả
Northern chỉ ra rằng lượng phân tử mRNA của
các gen xylanases thuộc họ 10 (Fa10), họ 11
(Fa11) và cellulases thuộc họ 7 (Fa7) suy giảm
rất nhiều ở mẫu A6 và tương đối ở mẫu B7 so
với mức độ biểu hiện mRNA của các gen
CWDEs của mẫu đối chứng (hình 2B). Để
chứng minh thêm điều này, chúng tôi tiến hành
thí nghiệm đánh giá hoạt động của các enzyme
CWDEs như endoxylanases và cellulases ngoại
bào như đã mô tả trong phần vật liệu và phương
pháp nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở hình
3 cho thấy, lượng enzyme endoxylanases ngoại
bào suy giảm rất nhiều trên hai mẫu đột biến ức
chế và nhiều nhất là trên mẫu A6 khi so với đối
chứng. Lượng enzyme cellulases ngoại bào
cũng suy giảm nhưng không nhiều so với đối
chứng. Điều này chỉ ra rằng, ức chế các gen yếu
tố phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn sẽ dẫn
đến sự suy giảm hoạt động của các enzyme
CWDEs hay nói một cách khác là hai gen Mg-
XlnR kiểm soát sự phiên mã của các gen
CWDEs như endoxylanases, cellulases trên nấm
đạo ôn.
Vai trò của các gen yếu tố phiên mã dạng
XlnR được biết là kiểm soát hoạt động của các
gen thuộc nhóm xylanases là chính [2, 20]. Mặc
dù vậy, XlnR cũng được biết đến đóng vai trò
khá rộng trong việc kiểm soát hoạt động không
chỉ của các gen mã hóa cho các enzyme
A
B
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119
116
xylanases mà cả enzyme cellulose,
hemicellulose, D-xylose và các chu trình trao
đổi chất khác [3, 4, 5, 16, 18]. Trong nghiên cứu
này, vai trò của các gen Mg-XlnR dường như tác
động chính lên hoạt động của các gen mã hoá
cho các enzyme xylanases hơn là enzyme
cellulases. Hơn nữa, việc kiểm soát hoạt động
của các gen CWDEs không chỉ do một XlnR mà
thường do tương tác giữa nhiều yếu tố phiên mã
như Ace1, Ace2, phức hợp Hap kiểm soát [16].
Do đó, phương pháp realtime PCR (qRT-PCR)
cần được thực hiện để đánh giá thêm tác động
kiểm soát hoạt động các gen mã hoá cho các
enzyme cellulases của yếu tố phiên mã
Mg-XlnR trên nấm đạo ôn, M. oryzae.
Hình 3. Hoạt động của các protein enzyme xylanase và cellulase ngoại bào được ly trích từ hai mẫu
đột biến ức chế của nấm đạo ôn (A6 và B7) và mẫu đối chứng (chủng gốc, Br48-GFP). Các giá trị
trong biểu đồ thể hiện hoạt động tương đối của các enzyme xylanase và cellulose của mẩu đột biến
ức chế so với mẫu đối chứng (Br48-GFP). Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và các thanh sai số thể
hiện sự chênh lệch chuẩn giữa các nghiệm thức.
Hình 4. Đánh giá mức độ xâm nhiễm của hai đột biến ức chế Mg-XlnR và một đối chứng (chủng
gốc, Br48-GFP) của nấm đạo ôn. Thí nghiệm lây bệnh được tiến hành trên giống lúa mì Nourin 4
(N4) ở nhiệt độ 220C. 5 ngày sau khi chủng bệnh, các triệu chứng trên lá cây bị nhiễm đã được đánh
giá các mức độ bệnh. Cấp độ nhiễm bệnh của mẫu đối chứng (Br48-GFP) là cấp độ 5. Cấp độ
nhiễm bệnh của hai mẫu đột biến ức chế gen A6 và B7 lần lượt là 2 và 3. Thí nghiệm này được lặp
lại ít nhất 3 lần
Giống lúa mì (Nourin)
W-N4
A6-N4
B7-N4
Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau
117
Vai trò của yếu tố phiên mã Mg-XlnR đến
khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn
Để đánh giá vai trò của các đột biến ức chế
Mg-XlnR đến khả năng gây bệnh của nấm đạo
ôn, thí nghiệm chủng bệnh được tiến hành trên
giống lúa mì Norin 4 như miêu tả trong phần
nguyên liệu và phương pháp thí nghiệm. Kết
quả được trình bày ở hình 4 cho thấy, các mẫu
đột biến ức chế Mg-XlnR thể hiện xâm nhiễm
trên lá ở nhiều mức độ khác nhau nhưng ít hơn
so với mẫu đối chứng dùng chủng gốc có độc
lực cao Br48. Điều này chỉ ra rằng, bệnh không
hoàn toàn biến mất trên các mẫu đột biến, tuy
nhiên, các vết bệnh và mức độ lan rộng của nó
trên lá lại ít hơn so với đối chứng. Việc suy
giảm này của các mẫu đột biến được quan sát ở
nhiệt độ 22oC rõ hơn ở 26oC (không thể hiện dữ
liệu). Kết quả này khá tương thích mức độ biểu
hiện của phân tử xylanase mRNA và enzyme
ngoại bào ở giai đoạn sợi nấm của các mẫu đột
biến (hình 2 và 3). Xylanases trên nấm đạo ôn
được biết đến đóng vai trò rất quan trọng trong
việc hình thành các cấu trúc xâm nhiễm và khả
năng tấn công vào tế bào cây ký chủ cả theo
chiều dọc và chiều ngang. Đột biến của những
gen này làm suy giảm số lượng giác bám, khả
năng hình thành cọc xâm nhiễm để tấn công
theo chiều dọc của tế bào và khả năng lan tỏa
cọc xâm nhiễm sang các tế bào khác của cây
trồng theo chiều ngang, gia tăng phản ứng tự
chết (HR) dẫn đến tính kháng bệnh, giảm các
vết bệnh và sự lan rộng của vết bệnh đạo ôn trên
lúa mì [15]. Hơn nữa vai trò của các gen mã hoá
cho các enzyme cellulases liên quan đến khả
năng tấn công tế bào cây ký chủ cũng đã được
mô tả [21]. Những kết quả này đã chứng minh
được vai trò của các gen yếu tố phiên mã Mg-
XlnR đến khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn.
Việc suy giảm mà không phải biến mất hoàn
toàn mức độ nhiễm bệnh trên lá của các đột biến
Mg-XlnR là do đặc tính của đột biến ức chế gen
làm suy giảm các phân tử mRNA Mg-XlnR dẫn
đến suy giảm các phân tử mRNA của các gen
liên quan đến CWDEs và cuối cùng là làm giảm
các vết bệnh cũng như sự lan rộng vết bệnh
sang các tế bào khác trên lá của cây ký chủ.
Việc xác định chức năng của các gen Mg-XlnR
trong nghiên cứu này cũng giúp khẳng định
thêm vai trò của các gen CWDEs đặc biêt là họ
gen mã hoá cho các enzyme endoxylanases liên
quan đến khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn
trên cây trồng.
KẾT LUẬN
Đồng ức chế sự biểu hiện của hai gen yếu tố
phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn đã chỉ ra vai
trò quan trọng không chỉ của yếu tố phiên mã
mà cả các gen CWDEs, đặc biệt là các gen mã
hóa cho xylanases liên quan đến khả năng hình
thành cấu trúc xâm nhiễm và khả năng gây bệnh
của nấm đạo ôn. Hiểu được chức năng của các
gen yếu tố phiên mã liên quan đến độc tính của
nấm đạo ôn sẽ giúp cho các nghiên cứu ứng
dụng như ức chế gen thông qua cây ký chủ
(HIGS) nhằm tạo các giống kháng bệnh đạo ôn
sau này.
Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn
giáo sư Hitoshi Nakayashiki đã tạo điều kiện cho
chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này tại phòng
thí nghiệm bệnh cây, Đại học Kobe, Nhật Bản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Aro N., Saloheimo A., Ilmen M., Penttila
M., 2001. ACEII, a novel transcriptional
activator involved in regulation of cellulase
and xylanase genes of Trichoderma reesei.
J. Biol. Chem., 276(26): 24309-24314.
2. Calero-Nieto F., Di Pietro A., Roncero M. I.
G., Hera C., 2007. Role of the
transcriptional activator XlnR of Fusarium
oxysporum in regulation of xylanase genes
and virulence. MPMI, 20(8): 977-985.
3. de Vries R. P., Visser J., 1999. Regulation
of the feruloyl esterase (faeA) gene from
Aspergillus niger. Appl. Environ.
Microbiol., 65: 5500-5503.
4. Gielkens M. M., Dekkers E., Visser J., de
Graaff L. H., 1999. Two cellobiohydrolase-
encoding genes from Aspergillus niger
require D-xylose and the xylanolytic
transcriptional activator XlnR for their
expression. Appl. Environ. Microbiol., 65:
4340-4345.
5. Hasper A. A., Visser J., de Graaff L. H.,
2000. The Aspergillus niger transcriptional
activator XlnR, which is involved in the
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119
118
degradation of the polysaccharides xylan
and cellulose, also regulates D-xylose
reductase gene expression. Mol. Microbiol.,
36: 193-200.
6. Howard R. J., Ferrari M. A., Roach D. H.,
Money N. P., 1991. Penetration of hard
substrates by a fungus employing enormous
turgor pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88: 11281-11284.
7. Kadotani N. Nakayashiki H., Tosa Y.,
Mayama S., 2003. RNA silencing in the
phytopathogenic fungus, Magnaporthe
oryzae. Mol. Plant Microbe Interact, 16:
769-776.
8. Lacroix H., Spanu P. D., 2009. Silencing of
six hydrophobins in Cladosporium fulvum:
complexities of simultaneously targeting
multiple genes. Appl. Environ. Microbiol.,
75: 542-546.
9. Marui J., Tanaka A., Mimura S., de Graaff
L. H., Visser J., Kitamoto N., Kato M.,
Kobayashi T., Tsukagoshi N., 2002. A
transcriptional activator, AoXlnR, controls
the expression of genes encoding
xylanolytic enzymes in Aspergillus oryzae.
Fungal Genet. Biol., 35: 157-169.
10. Miki D., Itoh R., Shimamoto K., 2005.
RNA silencing of single and multiple
members in a gene family in rice. Plant
Physiol., 138: 1903-1913.
11. Murakami J., Tosa Y., Kataoka T., Tomita
R., Kawasaki J., Chuma I. et al., 2000.
Analysis of host species specificity of
Magnaporthe grisea toward wheat using a
genetic cross between isolates from wheat
and foxtail millet. Phytopathology, 90:
1060-1067.
12. Nakayashiki H., Kiyotomi K., Tosa Y.,
Mayama S., 1999. Transposition of the
retrotransposon MAGGY in heterologous
species of filamentous fungi. Genetics, 153:
693-703.
13. Nelson N., 1944. A photometric adaptation
of the Somogyi method for the
determination of glucose. J. Biol. Chem.,
153: 375-380.
14. Nguyen Q. B., Kadotani N., Kasahara S.,
Tosa Y., Mayama S., Nakayashiki H., 2008.
Systemic functional analysis of calcium
signaling proteins in the genome of the rice
blast fungus, Magnaporthe oryzae, using a
high-throughput RNA silencing system.
Mol. Microbiol., 68: 1348-1365.
15. Nguyen Q. B., Itoh K., Vu B. V., Tosa Y.,
Nakayashiki H., 2011. Simultaneous
silencing of endo-β-1,4 xylanase genes
reveals their roles in the virulence of
Magnaporthe oryzae. Mol. Microbiol.,
81(4): 1008-1019.
16. Rauscher R., Wurleitner E., Wacenovsky
C., Aro N., Stricker A. R., Zeilinger S.,
Kubicek C. P., Penttila M., and Mach R. L.,
2006. Transcriptional regulation of xyn1,
encoding xylanase I, in Hypocrea jecorina.
Eukaryot. Cell, 5: 447-456.
17. Somogyi M., 1952. Notes on sugar
determination. J. Biol. Chem., 195:19-23.
18. Stricker A. R., Grosstessner-Hain K.,
Würleitner E., Mach R. L., 2006. Xyr1
(xylanase regulator 1) regulates both the
hydrolytic enzyme system and the xylose
metabolism in Hypocrea jecorina. Eukaryot.
Cell., 5: 2128-2137.
19. Talbot N. J., 2003. On the trail of a cereal
killer: exploring the biology of
Magnaporthe grisea. Annu. Rev.
Microbiol., 57: 177-202.
20. van Peij N. N., Gielkens M. M., de Vries R.
P., Visser J., de Graaff L. H., 1998. The
transcriptional activator XlnR regulates both
xylanolytic and endoglucanase gene
expression in Aspergillus niger. Appl.
Environ. Microbiol., 64: 3615-3619.
21. Vu B. V., Itoh K., Nguyen Q. B., Tosa Y.,
Nakayashiki H., 2012. Cellulases belonging
to glycoside hydrolase families 6 and 7
contribute to the virulence of Magnaporthe
oryzae. Mol. Plant Microbe Interact, 25(9):
1135-1141.
22. Walton J. D., 1994. Deconstructing the cell
wall. Plant Physiol., 104: 1113-1118.
Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau
119
THE ROLE OF TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR MG-XLNR IN REGULATION
OF XYLANASES, CELLULASES AND VIRULENCE OF THE RICE BLAST
FUNGUS Magnaporthe oryzae
Nguyen Bao Quoc1, Nguyen Ngoc Bao Chau2
1Research Institute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh city
2Open University Ho Chi Minh city
SUMMARY
Transcriptional activator, XlnR, has been known to play an important role in regulation of cell wall
degrading enzymes (CWDEs) in some pathogenic fungi. Here, we used RNA silencing to simultaneously
knock-down the expression of two XlnR like genes (Mg-XlnR) in the genome of rice blast fungus
Magnaporthe oryzae. Using Northern analysis, various levels of silencing of Mg-XlnR genes were observed in
knock-down mutants compared with those in the wildtype. Moreover, the reduction of MG-XLNR mRNA
observed in knock-down mutants resulted in the degradation of CWDEs mRNA and their extracellular
enzymes such as xylanases and cellulases. The decrease of blast lesions and their expansion on infected
leaves observed in silenced mutants indicated an important role of Mg-XlnR in regulation of CWDEs genes,
particularly xylanases and virulence of the rice blast fungus.
Keywords: Magnaporthe oryzae, rice blast, transcriptional activator, RNA silencing, virulence.
Ngày nhận bài: 15-7-2013
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 4377_15625_1_pb_5604_0674_2017895.pdf