Vai trò của các gen yếu tố phiên mã MG-XlNR liên quan đến hoạt động của các gen xylanases, cellulases và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn magnaporthe oryzae - Nguyễn Bảo Quốc

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119 112 VAI TRÒ CỦA CÁC GEN YẾU TỐ PHIÊN MÃ MG-XLNR LIÊN QUAN ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC GEN XYLANASES, CELLULASES VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA NẤM ĐẠO ÔN Magnaporthe oryzae Nguyễn Bảo Quốc1*, Nguyễn Ngọc Bảo Châu2 1Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh, *baoquoc@hcmuaf.edu.vn 2Trường Đại học Mở tp. Hồ Chí Minh TÓM TẮT: Yếu tố phiên mã XlnR có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của các gen liên quan đến enzyme phá huỷ thành tế bào (CWDEs) của nấm bệnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng công cụ ức chế gen (RNA silencing) để ức chế sự biểu hiện của hai gen yếu tố phiên mã MG-XLNR của nấm đạo ôn. Phân tích bằng phương pháp Northern đã chỉ ra rằng các mức độ biểu hiện của hai gen này suy giảm với nhiều mức độ khác nhau ở các mẫu đột biến khi so sánh với đối chứng. Sự suy giảm phân tử mRNA MG-XLNR trên các mẫu đột biến cũng dẫn đến sự suy giảm không chỉ các phân tử mRNA của CWDEs như xylanases, cellulases mà cả hoạt động của những enzyme phân hủy thành tế bào này. Sự suy giảm các vết bệnh và mức độ lây lan của chúng trên lá cây ký chủ bị xâm nhiễm bởi các mẫu nấm đột biến so với mẫu nấm đối chứng đã chỉ ra rằng các yếu tố phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn đóng vai trò rất quan trọng trong việc kiểm soát hoạt động của các gen liên quan đến enzyme phá huỷ thành tế bào, đặc biệt là các gen xylanases và đến khả năng gây bệnh trên cây trồng. Từ khóa: Bệnh đạo ôn, ức chế gen, yếu tố phiên mã. MỞ ĐẦU Để lây nhiễm thành công, nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa thường hình thành các công cụ xâm nhiễm như bào tử, giác bám và cọc xâm nhiễm để phá huỷ lớp biểu bì và thành tế bào thực vật [19]. Trong các công cụ xâm nhiễm của nấm đạo ôn, giác bám đóng vai trò rất quan trọng trong giai đoạn đầu gây bệnh vì nó có thể tấn công tế bào cây ký chủ bằng cả hai cách là tạo áp lực và tiết các enzyme phá hủy thành tế bào theo dạng cơ học và hoá học nhằm tạo điều kiện cho cọc xâm nhiễm tấn công vào bên trong để lấy chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và phát triển của nấm đạo ôn [6]. Việc sử dụng các enzyme phân huỷ thành tế bào cây ký chủ của nấm bệnh (CWDEs) được xem là một công cụ rất hiệu quả để vượt qua rào cản thành tế bào nhằm tạo điều kiện dễ dàng cho sự xâm nhiễm của nấm [22]. Có hai nhóm chính của CWDEs đóng vai trò rất quan trọng liên quan đến khả năng xâm nhiễm theo chiều dọc và chiều ngang của nấm đạo ôn là endo-β-1,4 xylanases và cellulases [15, 21]. Hai nhóm này thường là một họ bao gồm nhiều gen riêng lẻ qui định cùng một chức năng. Vì vậy, việc xác định chức năng của từng gen bằng phương pháp bất hoạt gen thường rất khó và không hiệu quả do sự dư thừa chức năng. Có nhiều phương pháp để khắc phục tình trạng này, chẳng hạn như bất hoạt toàn bộ các gen riêng lẻ trong một họ nhằm tạo một đột biến bất hoạt đa gen. Tuy nhiên phương pháp này rất khó, mất thời gian và không khả thi. Một phương pháp khác là bất hoạt hoặc ức chế sự biểu hiện của các gen yếu tố phiên mã như XlnR, ACEII kiểm soát hoạt động của các họ gen liên quan đến CWDEs [1]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào các gen dạng XlnR của nấm đạo ôn. Gen XlnR được tìm thấy trên các nấm Aspergillus niger, A. oryzae, Trichoderma reesei, Fusarium oxysporum và có vai trò rất rộng trong việc kiểm soát sự phiên mã của các gen CWDEs mã hóa cho xylanases, endoglucanase và hemicellulase [9, 16, 20]. Thông qua việc sử dụng công cụ BLAST, sự hiện diện của hai gen tương đồng dạng XlnR (MGG_01414.6 và MGG_02880.6, gọi chung là Mg-XlnR) đã được xác định trong hệ gen của nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae. Chúng tôi sử dụng một công cụ di truyền ngược gọi là ức chế sự biểu hiện của gen (RNA silencing) để xác định chức năng của các gen liên quan đến việc kiểm soát các hoạt động của Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau 113 CWDEs trên nấm đạo ôn. Đồng ức chế hai gen này bằng việc sử dụng phương pháp chọn lọc mẫu đột biến ức chế (knock-down mutants) dựa trên GFP fluorescence đã được phát triển và ứng dụng trong các nghiên cứu trước đây [14, 15], chúng tôi đã chỉ ra vai trò của các gen Mg- XlnR liên quan đến sự biểu hiện của các gen CWDEs và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae. Việc tìm hiểu chức năng của hai gen Mg-XlnR này sẽ được tiến hành và đánh giá trong nghiên cứu này. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng nấm, môi trường nuôi cấy và chuyển gen trên nấm Chủng nấm sử dụng trong nghiên cứu này là Br48-GFP một dạng chủng có nguồn gốc từ Br48 (một nòi lây nhiễm trên cây lúa mì) nhưng có sự hiện diện của gen chỉ thị GFP [7]. Những chủng này được giữ trong môi trường PDA (potato dextrose agar) trong nhiều tháng. Các chủng nấm này sẽ được nuôi cấy trong 100 ml môi trường CM lỏng (0,3% casamino acids, 0,3% yeast extract, 0,5% sucrose) ở 26oC cho việc chiết xuất RNA và tế bào nấm. Tế bào nấm được chiết xuất bằng cách sử dụng các enzyme có khả năng phân hủy thành tế bào nấm (Sigma-Aldrich) và chuyển gen trên nấm được tiến hành bằng phương pháp polyethylen glycol (PEG) đã được mô tả trước đây [12]. Trong quá trình chọn lọc đột biến ức chế gen, các mẫu nấm chuyển gen sẽ được nuôi cấy trong đĩa 96 lỗ chứa môi trường PDA và GFP fluorescence của chúng sẽ được đo bằng bằng máy Avro-SX (Perkin-Elmer, Hoa Kỳ) với các bước sóng kích thích và phát tán lần lượt là 485 nm và 535 nm [14]. Cấu trúc ức chế gen Một đoạn DNA của gen MGG_01414.6 gần vùng 3’ có chiều dài khoảng 429 bp có trình tự tương đồng cao với gen MGG_02880.6 được khuếch đại PCR bằng cặp mồi: (5’ CATACTCCTGACGGGCAAGT 3’ và 5’ CACCTGTAGAGGGCCAGAAG 3’) sử dụng DNA polymerase KOD Plus có khả năng hình thành sản phẩm dùng để nhân dòng theo kiểu thẳng đứng. Đoạn DNA sẽ được gắn vào cấu trúc pSD1G ở vị trí EcoRV [14] hình thành cấu trúc ức chế gen pSD1G-1414 Phân tích Northern blot RNA tổng số của các mẫu nấm sẽ được tách chiết bằng kit RNeasy Plant Mini của hãng Qiagen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 16 microgram RNA tổng số sẽ được phân tách bằng điện di trên gel agarose formadehyde 1,2%, sau đó được chuyển lên màng Hypond N+ (Amersham Bioscience). Dung dịch lai được sử dụng trong thí nghiệm này là ULTRAhybTM (Ambion) ở 68oC. Các đoạn dò RNA được chuẩn bị theo hệ thống T7 và T3. Các đoạn mồi để làm các đoạn dò được thể hiện trong bảng 1. Phương pháp rửa màng và nhận biết tín hiệu lai được thực hiện như đã mô tả trước đây [14]. Bảng 1. Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu Gen Trình tự nucleotide Ghi chú MGG_01414.6 – F 5’ CATACTCCTGACGGGCAAGT 3’ MGG_01414.6 5’ CACCTGTAGAGGGCCAGAAG 3’ Đoạn DNA dùng đồng ức chế hai gen Mg-XlnR Fa10-F (MGG_01542.6) 5' CGTCGTCAACGAGATCTTCA 3' Fa10-R (MGG_01542.6) 5' GGCGAGCCACTTCTTGAC 3' Đoạn dò Fa10 (211 bp) Fa11-F (MGG_08331.6) 5' GCAACAGCGGCAACTTTGT 3' Fa11-R (MGG_08331.6 5' ACCGACCAGAACTGCTGAAA 3' Đoạn dò Fa11 (301 bp) Fa7 –F (MGG_07809.6) 5' CATGAACGGAGCTTCCAAGT 3' Fa7 –R (MGG_07809.6) 5' ATCACGAGCACACTGAGCAT 3' Đoạn dò Fa 7 (201 bp) Phân tích enzyme phân huỷ thành tế bào Sợi nấm được nghiền trong dung dịch đệm bao gồm 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl và 1% Nonidet P-40. Sau khi li tâm ở tốc độ 10.000x g trong thời gian 10 phút. Nồng độ protein trong dung dịch phía trên được đánh giá TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119 114 bằng kít Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). Protein chiết xuất được pha với dung dịch phân tích enzyme bao gồm 5 mM 4- methylumbeliferyl-beta-D-xylopyranoside trong dung dịch đệm umbeliferone (50 mM Na2PO4 + NaH2PO4, 1 mM mMb-mercaptoethanol, 5 mM EDTA). Hoạt động của enzyme xylanases được đo bằng đĩa 96 giếng sử dụng máy Avro- SX với các bước sóng kích thích và phát tán lần lượt là 365 nm và 460 nm sau khi ủ mẫu trong điều kiện tối ở nhiệt độ 30oC trong thời gian là 2 giờ. Đánh giá hoạt động của enzyme cellulases được tiến hành theo phương pháp Somogyi- Nelson như đã được mô tả trước đây [13, 17]. Chủng bệnh Giống lúa mì Norin 4 được dùng để chủng bệnh ở giai đoạn cây con trong thí nghiệm này. Các cây con được trồng trong những chậu plastic chứa đất Sakata Supermix (Sakata, Yokohama, Nhật Bản) trong nhà kính ở nhiệt độ 25-30oC trong thời gian 3 tuần. Thao tác chuẩn bị bào tử, chủng bệnh, lấy mẫu được tiến hành theo quy trình đã đươc miêu tả trước đây [11]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đồng ức chế sự biểu hiện của các gen Mg- XlnR của nấm đạo ôn bằng phương pháp ức chế gen (RNA silencing) Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng cấu trúc ức chế gen pSilent-Dual1 (pSD1) với phương pháp chọn lọc đột biến dựa trên GFP fluorescence [14] để ức chế đồng loạt hai gen Mg-XlnR (MGG_01414.6 và MGG_02880.6). Để làm được việc này chúng tôi sử dụng một đoạn 429 bp của gen MGG_01414.6 ở vùng 3’ có trình tự nucleotide tương đồng cao giữa hai gen. So sánh trình tự của đoạn DNA của vùng bảo tồn này với gen MGG_02880.6 đã chỉ ra rằng, đoạn DNA của gen MGG-01414.6 tương đồng khoảng 61% đối với gen MGG_02880.6 với chỉ số bắt cặp hoàn hảo (perfect match) lên đến 11 nucleotide (hình 1). Đoạn DNA này được gắn kết vào trong cấu trúc ức chế gen pSD1G. Khoảng mười đến mười lăm mẫu nấm chuyển gen có khả năng mọc trên môi trường CM agar với kháng sinh Geneticin sẽ được chọn lọc dựa trên sự suy giảm GFP fluoresence do bị ức chế (một dạng chỉ thị). Các mẫu nấm này sẽ được tiếp tục phân tích để xác định mức độ đồng ức chế của hai gen Mg-XlnR bằng phương pháp Northern blot. Kết quả chỉ ra rằng lượng phân tử mRNA Mg_XlnR của các mẫu nấm mang cấu trúc ức chế suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau khi so với đối chứng (hình 2A). Điều này chỉ ra rằng đồng ức chế hai gen Mg-XlnR trên đã được thực hiện thành công bằng phương pháp ức chế gen (RNA silencing). Ký hiệu gen Đoạn DNA của gen MGG_01414.6 (vùng bảo tồn) Chỉ số bắt cặp hoàn hào MGG_01414.6 100% - MGG_02880.6 61% 11 nt Hình 1. Sơ đồ vùng bảo tồn của hai gen MG-XLNR (màu đen) và phân tích tính tương đồng của trình tự của chúng cho việc đồng ức chế hai gen Ưu thế của phương pháp ức chế gen so với phương pháp bất hoạt gen (gene disruption) là có khả năng tạo các đột biến đa gen hoặc cả một họ gen có trình tự tương đồng. Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả trong các nghiên cứu chức năng của gen và đã được sử dụng thành công trong việc xác định chức năng của các họ gen như họ gen endoxylanases, celulases, OSRac và hydrophobins trong các nghiên cứu trước đây [8, 10, 15, 21]. Đột biến ức chế gen (knock-down mutant) thường không loại bỏ hết các phân tử mRNA chủ đích như đột biến bất hoạt gen (knock-out mutant) mà chỉ làm suy giảm lượng phân tử mRNA dẫn đến sự suy giảm kiểu hình. Phương pháp này giúp hạn chế những khó khăn trong việc xác định chức Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau 115 năng gen nhất là những gen quan trọng, có khả năng gây chết trên sinh vật. Tuy nhiên, nó cũng có nhược điểm là đôi khi khó xác định được sự thay đổi kiểu hình do mức độ biểu hiện của các phân tử mRNA chủ đích khác nhau. Chính vì vậy, việc xác định các đột biến ức chế mạnh thông qua đồng ức chế với gen chỉ thị GFP như được mô tả trước đây [14]) sẽ giúp cho kết quả phân tích được chính xác hơn. Hình 2. Phân tích Northern các mẫu đột biến ức chế Mg-XlnR của nấm đạo ôn. Lượng sử dụng bằng nhau của phân tử RNA tổng số được thể hiện bằng rRNA được nhuộm bằng ethidium bromide. WT, chủng bố mẹ (Br48-GFP), A3, A6, B7 là các đột biến ức chế (RNAi mutants). Các đoạn dò được sử dụng trong phân tích Northern bao gồm đoạn dò MGG_01414.6 để nhận biết các phân tử mRNA Mg-XlnR; đoạn dò Fa10 (MGG_01542.6) dùng để nhận biết các phân tử mRNA xylanase họ 10; đoạn dò Fa11 (MGG_08331.6) dùng để nhận biết các phân tử mRNA xylanase họ 11; đoạn dò Fa7 (MGG_07809.6) dùng để nhận biết các phân tử mRNA cellulases họ 7. Gen yếu tố phiên mã Mg-XlnR kiểm soát hoạt động của các gen CWDEs của nấm đạo ôn Dựa trên kết quả đồng ức chế hai gen Mg- XlnR của nấm đạo ôn, chúng tôi chọn ra hai mẫu đột biến đồng ức chế hai gen Mg-XlnR là mẫu A6 (ức chế mạnh) và mẫu B7 (ức chế tương đối) khi so với mức độ biểu hiện của phân tử mRNA Mg-XlnR đối chứng và một mẫu không bị ức chế là mẫu A3 để tiếp tục phân tích Northern với các đoạn dò có trình tự bảo tồn cao với các gen trong họ gen xylanases như Fa10 (MGG_01542.6), Fa11 (MGG_08331.6) và cellulases như Fa7 (MGG_07809.6). Kết quả Northern chỉ ra rằng lượng phân tử mRNA của các gen xylanases thuộc họ 10 (Fa10), họ 11 (Fa11) và cellulases thuộc họ 7 (Fa7) suy giảm rất nhiều ở mẫu A6 và tương đối ở mẫu B7 so với mức độ biểu hiện mRNA của các gen CWDEs của mẫu đối chứng (hình 2B). Để chứng minh thêm điều này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt động của các enzyme CWDEs như endoxylanases và cellulases ngoại bào như đã mô tả trong phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở hình 3 cho thấy, lượng enzyme endoxylanases ngoại bào suy giảm rất nhiều trên hai mẫu đột biến ức chế và nhiều nhất là trên mẫu A6 khi so với đối chứng. Lượng enzyme cellulases ngoại bào cũng suy giảm nhưng không nhiều so với đối chứng. Điều này chỉ ra rằng, ức chế các gen yếu tố phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn sẽ dẫn đến sự suy giảm hoạt động của các enzyme CWDEs hay nói một cách khác là hai gen Mg- XlnR kiểm soát sự phiên mã của các gen CWDEs như endoxylanases, cellulases trên nấm đạo ôn. Vai trò của các gen yếu tố phiên mã dạng XlnR được biết là kiểm soát hoạt động của các gen thuộc nhóm xylanases là chính [2, 20]. Mặc dù vậy, XlnR cũng được biết đến đóng vai trò khá rộng trong việc kiểm soát hoạt động không chỉ của các gen mã hóa cho các enzyme A B TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119 116 xylanases mà cả enzyme cellulose, hemicellulose, D-xylose và các chu trình trao đổi chất khác [3, 4, 5, 16, 18]. Trong nghiên cứu này, vai trò của các gen Mg-XlnR dường như tác động chính lên hoạt động của các gen mã hoá cho các enzyme xylanases hơn là enzyme cellulases. Hơn nữa, việc kiểm soát hoạt động của các gen CWDEs không chỉ do một XlnR mà thường do tương tác giữa nhiều yếu tố phiên mã như Ace1, Ace2, phức hợp Hap kiểm soát [16]. Do đó, phương pháp realtime PCR (qRT-PCR) cần được thực hiện để đánh giá thêm tác động kiểm soát hoạt động các gen mã hoá cho các enzyme cellulases của yếu tố phiên mã Mg-XlnR trên nấm đạo ôn, M. oryzae. Hình 3. Hoạt động của các protein enzyme xylanase và cellulase ngoại bào được ly trích từ hai mẫu đột biến ức chế của nấm đạo ôn (A6 và B7) và mẫu đối chứng (chủng gốc, Br48-GFP). Các giá trị trong biểu đồ thể hiện hoạt động tương đối của các enzyme xylanase và cellulose của mẩu đột biến ức chế so với mẫu đối chứng (Br48-GFP). Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và các thanh sai số thể hiện sự chênh lệch chuẩn giữa các nghiệm thức. Hình 4. Đánh giá mức độ xâm nhiễm của hai đột biến ức chế Mg-XlnR và một đối chứng (chủng gốc, Br48-GFP) của nấm đạo ôn. Thí nghiệm lây bệnh được tiến hành trên giống lúa mì Nourin 4 (N4) ở nhiệt độ 220C. 5 ngày sau khi chủng bệnh, các triệu chứng trên lá cây bị nhiễm đã được đánh giá các mức độ bệnh. Cấp độ nhiễm bệnh của mẫu đối chứng (Br48-GFP) là cấp độ 5. Cấp độ nhiễm bệnh của hai mẫu đột biến ức chế gen A6 và B7 lần lượt là 2 và 3. Thí nghiệm này được lặp lại ít nhất 3 lần Giống lúa mì (Nourin) W-N4 A6-N4 B7-N4 Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau 117 Vai trò của yếu tố phiên mã Mg-XlnR đến khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn Để đánh giá vai trò của các đột biến ức chế Mg-XlnR đến khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn, thí nghiệm chủng bệnh được tiến hành trên giống lúa mì Norin 4 như miêu tả trong phần nguyên liệu và phương pháp thí nghiệm. Kết quả được trình bày ở hình 4 cho thấy, các mẫu đột biến ức chế Mg-XlnR thể hiện xâm nhiễm trên lá ở nhiều mức độ khác nhau nhưng ít hơn so với mẫu đối chứng dùng chủng gốc có độc lực cao Br48. Điều này chỉ ra rằng, bệnh không hoàn toàn biến mất trên các mẫu đột biến, tuy nhiên, các vết bệnh và mức độ lan rộng của nó trên lá lại ít hơn so với đối chứng. Việc suy giảm này của các mẫu đột biến được quan sát ở nhiệt độ 22oC rõ hơn ở 26oC (không thể hiện dữ liệu). Kết quả này khá tương thích mức độ biểu hiện của phân tử xylanase mRNA và enzyme ngoại bào ở giai đoạn sợi nấm của các mẫu đột biến (hình 2 và 3). Xylanases trên nấm đạo ôn được biết đến đóng vai trò rất quan trọng trong việc hình thành các cấu trúc xâm nhiễm và khả năng tấn công vào tế bào cây ký chủ cả theo chiều dọc và chiều ngang. Đột biến của những gen này làm suy giảm số lượng giác bám, khả năng hình thành cọc xâm nhiễm để tấn công theo chiều dọc của tế bào và khả năng lan tỏa cọc xâm nhiễm sang các tế bào khác của cây trồng theo chiều ngang, gia tăng phản ứng tự chết (HR) dẫn đến tính kháng bệnh, giảm các vết bệnh và sự lan rộng của vết bệnh đạo ôn trên lúa mì [15]. Hơn nữa vai trò của các gen mã hoá cho các enzyme cellulases liên quan đến khả năng tấn công tế bào cây ký chủ cũng đã được mô tả [21]. Những kết quả này đã chứng minh được vai trò của các gen yếu tố phiên mã Mg- XlnR đến khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn. Việc suy giảm mà không phải biến mất hoàn toàn mức độ nhiễm bệnh trên lá của các đột biến Mg-XlnR là do đặc tính của đột biến ức chế gen làm suy giảm các phân tử mRNA Mg-XlnR dẫn đến suy giảm các phân tử mRNA của các gen liên quan đến CWDEs và cuối cùng là làm giảm các vết bệnh cũng như sự lan rộng vết bệnh sang các tế bào khác trên lá của cây ký chủ. Việc xác định chức năng của các gen Mg-XlnR trong nghiên cứu này cũng giúp khẳng định thêm vai trò của các gen CWDEs đặc biêt là họ gen mã hoá cho các enzyme endoxylanases liên quan đến khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn trên cây trồng. KẾT LUẬN Đồng ức chế sự biểu hiện của hai gen yếu tố phiên mã Mg-XlnR của nấm đạo ôn đã chỉ ra vai trò quan trọng không chỉ của yếu tố phiên mã mà cả các gen CWDEs, đặc biệt là các gen mã hóa cho xylanases liên quan đến khả năng hình thành cấu trúc xâm nhiễm và khả năng gây bệnh của nấm đạo ôn. Hiểu được chức năng của các gen yếu tố phiên mã liên quan đến độc tính của nấm đạo ôn sẽ giúp cho các nghiên cứu ứng dụng như ức chế gen thông qua cây ký chủ (HIGS) nhằm tạo các giống kháng bệnh đạo ôn sau này. Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn giáo sư Hitoshi Nakayashiki đã tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này tại phòng thí nghiệm bệnh cây, Đại học Kobe, Nhật Bản. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aro N., Saloheimo A., Ilmen M., Penttila M., 2001. ACEII, a novel transcriptional activator involved in regulation of cellulase and xylanase genes of Trichoderma reesei. J. Biol. Chem., 276(26): 24309-24314. 2. Calero-Nieto F., Di Pietro A., Roncero M. I. G., Hera C., 2007. Role of the transcriptional activator XlnR of Fusarium oxysporum in regulation of xylanase genes and virulence. MPMI, 20(8): 977-985. 3. de Vries R. P., Visser J., 1999. Regulation of the feruloyl esterase (faeA) gene from Aspergillus niger. Appl. Environ. Microbiol., 65: 5500-5503. 4. Gielkens M. M., Dekkers E., Visser J., de Graaff L. H., 1999. Two cellobiohydrolase- encoding genes from Aspergillus niger require D-xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression. Appl. Environ. Microbiol., 65: 4340-4345. 5. Hasper A. A., Visser J., de Graaff L. H., 2000. The Aspergillus niger transcriptional activator XlnR, which is involved in the TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 112-119 118 degradation of the polysaccharides xylan and cellulose, also regulates D-xylose reductase gene expression. Mol. Microbiol., 36: 193-200. 6. Howard R. J., Ferrari M. A., Roach D. H., Money N. P., 1991. Penetration of hard substrates by a fungus employing enormous turgor pressure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11281-11284. 7. Kadotani N. Nakayashiki H., Tosa Y., Mayama S., 2003. RNA silencing in the phytopathogenic fungus, Magnaporthe oryzae. Mol. Plant Microbe Interact, 16: 769-776. 8. Lacroix H., Spanu P. D., 2009. Silencing of six hydrophobins in Cladosporium fulvum: complexities of simultaneously targeting multiple genes. Appl. Environ. Microbiol., 75: 542-546. 9. Marui J., Tanaka A., Mimura S., de Graaff L. H., Visser J., Kitamoto N., Kato M., Kobayashi T., Tsukagoshi N., 2002. A transcriptional activator, AoXlnR, controls the expression of genes encoding xylanolytic enzymes in Aspergillus oryzae. Fungal Genet. Biol., 35: 157-169. 10. Miki D., Itoh R., Shimamoto K., 2005. RNA silencing of single and multiple members in a gene family in rice. Plant Physiol., 138: 1903-1913. 11. Murakami J., Tosa Y., Kataoka T., Tomita R., Kawasaki J., Chuma I. et al., 2000. Analysis of host species specificity of Magnaporthe grisea toward wheat using a genetic cross between isolates from wheat and foxtail millet. Phytopathology, 90: 1060-1067. 12. Nakayashiki H., Kiyotomi K., Tosa Y., Mayama S., 1999. Transposition of the retrotransposon MAGGY in heterologous species of filamentous fungi. Genetics, 153: 693-703. 13. Nelson N., 1944. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem., 153: 375-380. 14. Nguyen Q. B., Kadotani N., Kasahara S., Tosa Y., Mayama S., Nakayashiki H., 2008. Systemic functional analysis of calcium signaling proteins in the genome of the rice blast fungus, Magnaporthe oryzae, using a high-throughput RNA silencing system. Mol. Microbiol., 68: 1348-1365. 15. Nguyen Q. B., Itoh K., Vu B. V., Tosa Y., Nakayashiki H., 2011. Simultaneous silencing of endo-β-1,4 xylanase genes reveals their roles in the virulence of Magnaporthe oryzae. Mol. Microbiol., 81(4): 1008-1019. 16. Rauscher R., Wurleitner E., Wacenovsky C., Aro N., Stricker A. R., Zeilinger S., Kubicek C. P., Penttila M., and Mach R. L., 2006. Transcriptional regulation of xyn1, encoding xylanase I, in Hypocrea jecorina. Eukaryot. Cell, 5: 447-456. 17. Somogyi M., 1952. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., 195:19-23. 18. Stricker A. R., Grosstessner-Hain K., Würleitner E., Mach R. L., 2006. Xyr1 (xylanase regulator 1) regulates both the hydrolytic enzyme system and the xylose metabolism in Hypocrea jecorina. Eukaryot. Cell., 5: 2128-2137. 19. Talbot N. J., 2003. On the trail of a cereal killer: exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annu. Rev. Microbiol., 57: 177-202. 20. van Peij N. N., Gielkens M. M., de Vries R. P., Visser J., de Graaff L. H., 1998. The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger. Appl. Environ. Microbiol., 64: 3615-3619. 21. Vu B. V., Itoh K., Nguyen Q. B., Tosa Y., Nakayashiki H., 2012. Cellulases belonging to glycoside hydrolase families 6 and 7 contribute to the virulence of Magnaporthe oryzae. Mol. Plant Microbe Interact, 25(9): 1135-1141. 22. Walton J. D., 1994. Deconstructing the cell wall. Plant Physiol., 104: 1113-1118. Nguyen Bao Quoc, Nguyen Ngoc Bao Chau 119 THE ROLE OF TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR MG-XLNR IN REGULATION OF XYLANASES, CELLULASES AND VIRULENCE OF THE RICE BLAST FUNGUS Magnaporthe oryzae Nguyen Bao Quoc1, Nguyen Ngoc Bao Chau2 1Research Institute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh city 2Open University Ho Chi Minh city SUMMARY Transcriptional activator, XlnR, has been known to play an important role in regulation of cell wall degrading enzymes (CWDEs) in some pathogenic fungi. Here, we used RNA silencing to simultaneously knock-down the expression of two XlnR like genes (Mg-XlnR) in the genome of rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Using Northern analysis, various levels of silencing of Mg-XlnR genes were observed in knock-down mutants compared with those in the wildtype. Moreover, the reduction of MG-XLNR mRNA observed in knock-down mutants resulted in the degradation of CWDEs mRNA and their extracellular enzymes such as xylanases and cellulases. The decrease of blast lesions and their expansion on infected leaves observed in silenced mutants indicated an important role of Mg-XlnR in regulation of CWDEs genes, particularly xylanases and virulence of the rice blast fungus. Keywords: Magnaporthe oryzae, rice blast, transcriptional activator, RNA silencing, virulence. Ngày nhận bài: 15-7-2013