Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Tác Giả : Lê Hoàng Duy Danh mục : Chương 1 : Sơ chế các chất cần thiết cho nuôi cấy. Chương 2 : Hướng dẫn nuôi cấy Vi khuẩn. Chương 3 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật. Chương 4 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật và động vật hữu nhũ. Lời Ngỏ : Tài liệu tham khảo từ 1 cuốn sách chuyên nghành sinh học xuất bản năm 1972, tài liệu để tham khảo thêm cho sinh viên chuyên nghành công nghệ sinh học. Tài liệu này không phải tài liệu xét nghiệm chỉ tập trung vào kiến thức nuôi cấy tế vào và vi sinh vật, kiến thức cơ bản cho công nghệ tế bào gốc sau này, nhìn chung công nghệ hiện nay sử dụng máy móc để giảm gánh nặng cho các nhà nghiện cứu nhưng cách thức nuôi cấy vẫn không khác gì những năm đầu của công nghệ sinh học. Chương 1 : Sơ chế các chất cần thiết cho nuôi cấy. Dung dịch Hanks Đậm gấp 10 lần. Cách pha : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Pha 2 dung dịch riêng A và B riêng rẽ sau đó kết hợp lại : Dung dịch A : NaCl : 80g. KCl : 40g. 7H2O + MgSO4 : 1g. MaCl2. .6H2O : 1g. CaCl2 : 1,4g Nước cất 2 lần 500ml. Dung dịch B : Na2HPO4.2H2O : 0,75g Na2HPO4.12H2O : 1,5g. KH2PO4 : 0,6g. Glucozơ : 10g Nước cất 2 lần 480 ml. ** Pha 2 dung dịch muối như trên sau đó đổ dung dịch A vào dung dịch B một cách từ từ vừa đổ vừa khuấy. Cuối cùng cứ mỗi lít dung dịch cho thêm 20 ml dung dịch 1% đỏ phenol. Lọc qua lọc giấy, để làm tiệt trùng thì có 2 cách : + Cách thứ 1 là cách tốt nhất là lọc qua Seitz (lọc ngăn vi khuẩn). + Cách 2 sấy ước ở 100 độ C trong 20 phút, sấy 3 lần trong 3 ngày liên tiếp. Nhưng trong trường hợp này CaCl2 phải pha riêng vào cho thêm sau khi sấy, trước khi dùng.  Tiệt trùng xong thì đóng vào lọ 500-1000 ml đậy kín bằng nút cao su. Thử vô trùng bằng cách cấy 0,5 ml dung dịch vào môi trường canh thang thịt – pepton và thách Sabouraud.  Bảo quản dung dịch mẹ trong tủ lạnh có thể bảo quản được đến 6 tháng. Trước khi dùng đem pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần vô trùng. Dung dịch làm việc đem sấy 100 độ C, 10 phút với áp suất 0,7 at , điều chỉnh PH bằngng dung dịch bica 1,4% có PH = 7,2 – 7,4.  Cứ 100 ml dung dịch cho 2,5 – 3 ml. Chú ý : + Dung dịch làm việc trong phòng không quá 1 tháng. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 + Chưa pha bica có thể sử dụng 6 tháng. Bica là tên viết tắt : Bicacbonat Na, Bicacbonat Ca, Bicacbonat Mg.... Dung dịch Earle Thành phần dung dịch chuẩn đặc 10 lần trong 1 lít như sau : NaCl : 68g. KCl : 4g. CaCl2 : 2g. MgSO4.7H2O : 2g. NaH2PO4.7H2O : 1,25g. Glucozơ : 10g. Đỏ Phenol : 0,2g. Hòa tan các thành phần mưới theo trật tự kể trên trong nước cất 2 lần. Riêng CaCl2 thì phải pha riêng và cho vào sau vừa cho vừa trộn lọc qua lọc Seitz. Khử vô trùng đậy nút cao su. Bảo quản ở buồng lạnh. Trước khi pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần. Lọc lại lần thứ 2. Điều chỉnh PH để có PH = 7,4 – 7,5 bằng cách cho thêm vào 4 – 4,4 ml dung dịch 5% Bica vào 100 ml dung dịch muối. Nếu cần thì cho giảm PH thì cho luồn khí CO2 đi qua sau khi khí này đã được đi qua bình chứa axit H2SO4 hay đi qua lọc bông. Dung dịch đệm FotFat Tùy theo yêu cầu cụ thể của công tác có thể cần cụ thể của công tác có thể cần đến dung dịch đệm Fotfat chứa các ion Ca và Mg. Cách pha 1 lít dung dịch này đặc 10 lần như sau : Dung dịch A : NaCl : 80g KCl : 2g CaCl2 : 80g. KCl : 2g CaCl2 : 1g MgCl2.6H2O : 1g Nước cất 2 lần 1000 ml. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Dung dịch B : Na2HPO4.12H2O : 28,98g KH2PO4 : 2g Nước cất 2 lần : 10 ml Trước khi dùng cứ 100ml dung dịch A cho thêm 800 ml nước cất 2 lần sau đó cho thêm 100 ml dung dịch B. Lọc qua lọc Seitz và giữ ở tủ lạnh. Nếu trong dung dịch đệm Fotfat không cần các Ion Ca và Mg thì cách pha như sau : NaCl : 8g. KCl : 0,2g Na2HPO4.12H2O : 2,9g KH2PO4 : 0,2g Nước cất 2 lần cho đầy 1 lít sấy vô trùng 110 độ trong 30 phút có thể giữ được ở nhiệt độ phòng. Dung dịch Trypsin Hòa tan 1g Trypsin Difco trong 100ml dung dịch đệp Fotfat. Lọc qua lọc giấy hay lọc bông sau đó lọc qua lọc Seitz thử vô trùng bằng các cấy vào canh thang thịt Pepton và thạch Sabouraud. Ở trạng thái đống băng (-20 độ C) dung dịch Trypsin có thể bảo quản được mấy tháng ở + 4 độ C, chỉ giữ được vài tuần lễ. Trước khi dùng đem pha loãng 4 lần với dung dịch đệm Fotfat hay dung dịch Hanks vô trùng để có nồng độ cuối cùng là 0,25%. Dung dịch Vecxen (Vecxen là muối của axit etylen diamin tetra-axetic) Để điều chế dung dịch 0,02% người ta cấy 0,5g Vecxen hòa tan trong 2500ml dung dịch đệm Fotfat không chứa Ion Ca và Mg rót vào lọ 50ml, sấy vô trùng dưới áp suất 1 at, 30 phút. Bảo quản ở 4 độ C trong thời gian 1 -2 tháng tránh ánh sáng. Dung dịch đỏ Phenol 1% Trước hết chứa 100ml 1N NaOH bằng cách trộn 10ml dung dịch NaOH bảo hòa(li tâm dung dịch NaOH bảo hòa để bỏ hết cặn) với 90 ml nước cất 2 lần. Sau đó cứ 10g đỏ Phenol hòa tan trong cồn cho thêm 20ml dung dịch 1N NaOH lắc đều để lắng mấy phút. Hút hết nước trong ở bên trên cho vào ống đo lường 1 lít và cho thêm vào chỗ cặn độ 10ml 1N NaOH lại lắc và hút lấy nước trong hộp vào ống đong, cứ tiếp tục như thế cho đến khi thuốc đỏ Phenol tan hết. Tuy nhiên 1N NaOH dùng để hòa tan 10g Phenol Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 4 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 không được quá 70ml vì nếu số lượng NaOH nhiều quá thì dung dịch có màu đỏ thẫm không dùng được vào nuôi cấy tế bào. Dung dịch đỏ trung tính Muốn chế dung dịch 0,1% đỏ trung tính người ta hòa tan 0,1g thuốc vào 100ml cồn Etyl 60 độ dung dịch này dùng để nhuộm ống tế bào để đếm và để phát hiện Plecơ . Dung dịch Cristal Violet(xem thêm) Dung dịch này cũng dùng để nhuộm sống tế bào để đếm trong khi làm Trypsin hóa mô. Pha 0,1% dung dịch Cristal Violet trong 0,1N axit Nitric. Tạo Huyết Thanh Ứng dụng dùng để thêm vào môi trường dinh dưỡng 1 lượng nhất định từ 5 – 10% để tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh Điều chế : Lấy máu của động vật thường là của Bê, Ngựa & của người..... Cho vào lọ rộng cổ để trong tủ ấm 20 – 30 độ C cho máu đông, sau đó dùng que tách máu đông ra khỏi lọ, đặt lọ vào tủ lạnh +4 độ C trong 1 – 2 ngày. Chắt huyết thanh li tâm 2000 vòng/phút trong 20 phút lọc lấy huyết thanh qua lọc Seitz rót vào lọ hay ống và đậy nắm cao su, thử vô trùng và bảo quản ở tủ từ 4 – 20 độ C. Tùy mục đích sử dụng có thể dùng tươi hay đun ở 50 độ C trên 30 phút trước khi dùng cần thử độc tính đối với tế bào. Chất làm nhũ hóa Liên quan đến chất béo chia nhỏ chất béo... Dung dịch Glyxerin 15% trong H2O huyết thanh ngựa bình thường không chứa chất bảo quản, dung dịch Sacarozơ 10% với Gelatinh 1% có PH 6,8 – 7 hoặc các dung dịch chứa glucozơ, lactozơ có 10 – 30% sữa. Thủy phân t inh bột Nguyên lí : Dùng(H2SO4 hoặc HCl) với áp lực dư. Dịch thủy phân thu được trung hòa bằng Na2CO3 hoặc NaOH. Nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thủy phân thì có thể dùng CaCO3 hoặc nước vôi để trung hòa, sau đó lọc qua lọc ép khung bản với than hoạt tính để khử màu : Dịch thủy phân thường là glucoza, 1 lượng nhỏ aa, khoán chất có thể đem làm cô đặc lại 60-70% để sử dụng dần. • Dùng enzim : Bột gạo, bột ngô đã tách phôi men α amilaza hay β Amilaza, Bột đậu tương là 1 nguồn Nitơ kỹ thuật chứa 40% Protein 19% chất béo và các Axit amin. Cách làm cao ngô Bắp Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 5 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Cách làm cao ngô thường có màu nâu sẫm 150 kg hạt không mọt không mốc, rửa sạch ngậm với 220l nước, máy tỉ lệ nước bằng 1:1,3 thêm 2 lít HCl 30% và 1,2 kg Na2SO3 để làm dịch ngâm có PH = 3 và nồng độ SO2 có 0,25% ngâm 48 giờ ở 50 – 55 độ C. Sau khi kết thúc dịch ngâm được gia nhiệt tới 75 – 80 độ C dùng sữa vô đã lọc sạch, chỉnh PH 8 – 8,2 để lắng 30 phút cho protein kết tủa. Lọc qua lọc ép khung bản và rữa bả bằng nước nóng. Dịch lọc và nước rửa được điều chỉnh PH bằng HCl tới 5 và cô chân không ở 60 độ C tới 28 độ bé. Thành phần lớp tạo phủ dùng để làm phương pháp plecơ : 1. Dung dịch Earcle đặc 10 lần không chứa đỏ 18 ml Phenol và Bica. 2. Nước cất vô trùng : 60 ml 3. Huyết thanh bê hoặc khỉ 3,6 ml 4. NaHCO2 (7,5%) : 5,4 ml 5. Đỏ trung tính (1:1000) : 3 ml 6. Penixilin : 18.000 đơn vị 7. Streptomixin : 18.000 đơn vị Thạch phủ này đảm bảo tế bào sống được 8 – 12 ngày • 2% thạch • Môi trường dinh dưỡng dung dịch Gey A đặc 10 lần 20% • Dung dịch Gey B đặc 10 lần 10% • Tris 0,2 M, PH = 7,6 đặc 10 lần 10% • 5% Lactoalbumin Hydrolisat 10% • Chứa 10% huyết thanh bê • Đỏ trung tính 1:1000 • Nước cất 30% Dung dịch Gey B NaCl : 8g KCl : 0,375g Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 6 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 CaCl2 : 0,275g MgCl2 : 0,21g Na2HPO4 : 0,15g KH2PO4 : 0,025g Glucoza : 2g NaHCO3 : 0,25g Nước cất 2 lần 1000ml có thêm đỏ Phenol làm chất chỉ thị màu, bảo quản ở nhiệt độ +4 độ C thời gian 1 tháng. Tách Enzim dùng muối trung tính kết tủa là Sunfat amon [(NH4)2SO4] tỉ lệ 50 – 60 % dùng (Etanol, Izopropanol và axeton) chiết nước nấm men cho 3-4 thể tích cồn vào 1 thể tích nước chiết enzim để trách giảm hoạt tích enzim cần lạnh xuống 3 – 5 độ C khuấy mạnh, khi enzim kết tủa lắng xuống cần li tam cần rửa đến 2 – 3 lần ca độ cho vào bình hút ẩm hoặc máy sấy chân kh6ong sản phẩm thu được ở dạng bột. Chương 2 : Nuôi cấy vi khuẩn. Tóm tắt nội dung chương 2 : bài này hướng dẫn nuôi cấy những vi khuẩn có lợi, và ứng dụng vào cuộc sống, cách nuôi cấy vi khuẩn khác cũng tương tự các bạn tìm hiểu thêm tại trường hoặc hỏi những người có chuyên môn. Bảng vi khuẩn và ứng dụng của vi khuẩn. Vi sinh vật sản sinh Bản chất sản phẩm trao đổi chất Hoạt tính Dược học Aerobacter cloal Amanita muscaria và các nấm khác. Polisacarit Muscarin. Chống viêm tăng phó giao cảm. Bacillus anthracis. Dịch lọc thô nước chiết. Giống Eponefrin hoat tính tim mạch. Bacillus licheniforms. Nước chiết thô Giống ACTH Bacillus subtilis. // // Các loài Claviceps. Ecgotalcaloit Phong bế adreneric kích thích cơ trơn hoạt tính CNS Corticium caeruleum. Ruglovasin A & B Hạ huyết áp. Fusarium oxysporum. Axit Fusaric Caxit5-butylpicolinic Hạ huyết áp. Nhiều loài Fusarium. Nước chiết thô. Gây buồn nôn. Gibbrella Zea Zlagenin Gây hạ protein, gây động dục. Zearalenon Gây động dục. Lactobacillus leichmannii Nước chiết thô. Giống ACTH. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 7 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Lenzites trabea Rugulovasin A & B Hạ huyết áp Lentinus Edodes Lentysin Giảm lipit máu. Lenzites trabea Rugulovasin A & B Hạ huyết áp. Naematoloma fasciculare Naemototin Giảm động mạch vành Oospora-astringenes Oosponals oospo lacton, oospong lycol Co cơ. Oudemansiella radicata Oudenon Hạ huyết áp. Nhiều loài Panaeolus Serotonin 5 hydroxytriptophan Co mạch. Pellicularia filamentosa Rugulovasin A & B Hạ huyết áp. Penicillium convor ruglosum Rugulovasin A & B Hạ huyết áp. Penicillium corylophiloides Rugulovasin A & B Hạ huyết áp. Penicilium purpurogenum Rugulovasin A & B Hạ huyết áp Penicilium Rugulosum // // Phialocepphala repens Phialoxin Chống đông. Psilocybe mexicana và các nấm khác Psiloxin Tăng hoạt động tâm thần. Rhizoc tonia leguminicola Slaframin Tăng phó giao cảm. Salmoella enteriditis Nước chiết thô. Giống ACTH. Salmonella tiphi // // Serratia marcescens // // Nhiều loài Serratia Proteaza(TSP) Chống viêm. Streptomyces allbire ticuli Leupeptin Chống Plaxmin, chống viêm ức chế, các men Trypsin Papainmen chống đông máu và các men khác. Streptomyces argenteolus Var.toyonakensis Pepstatin Ức chế Pepxin. Treptomyces cacaoi Varasoensis Proteinnaza trung tín. Chống viêm. Treptomyces caespitosus Pepstatin Ức chế pepsin Treptomyces chartreusis Leupeptin Như stm.albireticuli Streptomyces grioseolus Proteinnaza trung tín Chống viêm. Streptomyces griseus proteaza Giống Insulin Streptomyces hygroc picus Chimostatin. ức chế chimotripsin Streptomyces kinoluteus Kinonaza B1 Proteinnaza Chống viêm Streptomyces lavendulae Chimostatin Leupeptin ức chế chimotripsin như stm.albireticuli Streptomyces nigrifaciens Var.FFD-101 Nigrifactin Chống hixtamin Streptomyces : noboritoensis Leupeptin Như stm.albiraticuli Streptomyces : roseochromogenes // // Streptomyces roseus Leupeptin Như stm.albiraticuli Streptomyces testaceus Leupeptin Ức chế Peptin Streptomyces thioluteus Leupeptin Như stm.albiraticuli Streptomyces Verticillatus Var Zynogenes Retikinonaza I & II Proteinaza trung tin. Chống Viêm. Streptomyces EF-44-201 4 thành phần S-PI Ức chế pepsin Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 8 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Các loài streptomyces Enzim Giảm nhóm Protein A & B của máu. Zygosporiu Masonii Zygosporin A Chống Viêm Zygosporium Mycophilum Zygosporin A Chống Viêm Penicillium chrysogenum Penixylin Điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, nấm hoặc virus. Streptomyces Erythryus Tetraxiclin // Streptomyces Griseus Streptomyxin // Striptomyces erythreus Eritromixin // Penixillium patulum Grizeofulvin // Clavileps purpurea Alcaloit của nấm cựa gà như : Ecgotamin, Ecgotoxin Trong khoa sản (giúp vào việc co tử cung) và điều trị các bệnh mạch máu, bệnh nhứt đầu 1 bên. Propionibacterium Shermanii Vitamin(B12) corinoit Điều trị thiếu máu ác tính. Ca1v loại vi khuẩn xạ khuẩn và nấm. Steroit có cấu trúc được thay đổi 1 cách đặc hiệu nhờ vi sinh vật. Chế phẩm hoocmon Ví dụ để kìm hãm sự rụng trứng để điều trị viêm và thấp khớp. Acetobacter subboxy dans L-socboza (Tiền chất để tổng hợp axit ascorbic) Tiền chất của Vitamin C Dextran Chất thay thế huyết tương. Leuconostoe mesenteroides Aspergllus niger Enzim Chuẩn đoán lâm sàn hóa sinh. Penixilium chryso genum Glucozooxydaza Chuẩn đoán bệnh đái đường. Escherichia coli Asparaginaza Kiềm hãm khối u và bệnh bạch cầu. Streppiococcus spec Streptokinaza Điều trị bệnh mạch máu. Bacillus subtilis Penixilinaza Loại trừ Penixilin Rhizpus spec. Lipaza. Thuốc trị tiêu hóa. Môi trường nuôi dưỡng kháng sinh Penixil in Các chủng Penixil in : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 9 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Penicyllum, Aspergllus Penicillum notatum, Pichrysogenum. Môi trường nuôi cấy : 30g Lactozơ kỹ thuật, 3g NaNO3, o,5g KH2PO4, 0,25g MgSO4 0,2g C6H5Ch2CooH, 0,044g ZnSO4 Nước cất vừa đủ 1 lít dùng NaOH điều chỉnh PH tới 5,5 Cấy chìm gam/lít : Cao ngô : 2 Glucozơ : 2 Lactozơ : 0,5 Nitrat amol : 0,125 Sunfat Magie : 0,025 Sunfat Nitrat : 0,05 Kali Photohat monobazic : 0,2 CaCO3 : 0,5 Treptomixin Môi trường : Có glucoz ơ, bột đậu tương, cao ngô, ngoài ra còn có muối Amon, photphat và CaCO3 điều chỉnh PH. Giberel in Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 10 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Môi trường : Sacarozơ : 40 – 60 Tatarat amon : 7 KH2PO4 : 2 MgSO4.7H2O : 0,2 Hỗn hợp chứa các nguyên tố vi lượng PH = 5,5 thêm 0,5 Cao ngô. Eremothecium a shbyii và Ashbya gossypii Giới thiệu chủng vi khuẩn tạo ra Ribolavin (hay còn gọi là B12). Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 11 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 E.ashbyii có khuẩn ti dạng sợi kích thướt 2 – 4 x 60 – 80 Micromet. Khuẩn ti có cấu tạo phân nhánh. Giống này sinh sản vô tính bằng bào tử, có hình 1 đầu 1 đầu nhỏ mỗi bào tử nang chứa 8 – 10 bào tử nảy mầm phát triển thành khuẩn ti. Trên môi trường thạch E.ashbii còn non có màu trắng dần sang màu vàng già hơn có thể bị phân hủy, có màu vàng lục huỳnh quang (5 – 10 ngày cấy 1 lần). Ashbya gosspii sống kí sinh ở nụ bông, cafe, 1 số cây khác, cấu tạo có hình thoi 1 đầu khá dài tránh ánh nắng mặt trời nhiệt độ phát triển 28 độ C. Môi trường E.ashbyii : Bã mía : 130 γ/gam. Khô hạt bông : 1000 Khô đậu tương : 2200 Khô lạc : 3500. Mầm đại mạch : 6000 Mầm thóc : 5000 Bã đậu : 3000 Có 5% đường vàng, 3% dịch thủy phân protein chưa tới Pepton 1% phôi mì, 0,3% cao thịt, 0,3 % cao thịt, 0,3% KH2PO4, 0,25% NaCl và nước cất, PH = 6, 7 ngày cấy 1 lần nhiệt độ = 28 độ C. Tetraxyclin Còn gọi là Tetraxin, steclin, acromixin, polixiclin tạo bằng phương pháp hóa học Clotetraxylin hoặc nuôi cấy xạ khuẩn Str.aureofaciens. Môi trường nuôi cấy : Sacacroza : 2% Cao ngô : 0,24 Bột đậu tương : 2 CaCO3 : 0,4 NaCl : 0,5 Rỉ đường : 0,2 . Phương pháp chiết lấy các chất từ vi nấm : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 12 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 • Phương pháp nuôi cấy riêng rẻ các khuẩn lạc trên môi trường rắn là gelatin hoặc thạch (agar - agar) • Penixilin nhờ mốc màu xanh lục Penicillium notatum. • Đối với sản phẩm là chất hòa tan trong dung dịch nuôi cấy thì phải li tâm tách lấy phần dịch rồi cho kết tủa, làm sạch, có thể cho kết tinh trở lại hoặc sản phẩm nằm trong tế bào thì phải phá vỡ vỏ tế bào rồi mới tiến hành tách và làm sạch tiếp theo pectinaza phân hủy pectin • Sự chuyển hóa Steroit như tạo thành cortizol sự oxi hóa không hoàn toàn như sự tạo thành axit axetic và sobboza để sản xuất axit ascorbic (Vitamin C), những thành tựu của quá trình này được ứng dụng trong sản xuất Cortizon, axit asscorbic(Vitamin C), axit glucomic tiền chất của Aphidr in và các chất điều trị các chứng viêm khớp. 1 số loại Vi khuẩn có lợi cho công môi trường : Vi khuẩn dùng dầu mỏ làm thức ăn  ứng dụng dùng để phân hủy dầu mỏ hay các vệt dầu loang ... . Achromabater, Alkigenes,Bacillus, Bacterium, Corynerbacterium,Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibria.... Chủng nấm men, nấm mốc : Acremonium, Aspergilus, Candida, Cyfromyces, Debaryomyces, Endomyces, Hansenula monilia, Penicillium, Scopuluriosis, Torulopsis. Khuẩn Ty xạ khuẩn : Micromonospora , Mycobacterium.... Các chủng sử dụng Hydrocacbua : Candida lipolytica, Cointermedias, C.Tropicalis, C.Parasilops, S.guilliermondii..... Tên các loại vi khuẩn gây bệnh: Phế cầu : Pneumococcus. Lậu cầu : Conococcus. Màn não cầu : Miningococcus. Bruxela (Brucella). Micobacterium bền với axit . Trực khuẩn than : Bacillus anthracis. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 13 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Vi khuẩn hiếm khí gây bệnh trực khuẩn đường ruột. Các vi khuẩn influenxa Strepto và Staphylococcus Tụ cầu khuẩn : Staphylococcus. ............................... 1 số cách đột biến cơ bản : Treptomixin là xạ khuẩn Streptomyces griseus còn gọi là Actinomyces Streptomixin  Đột biến nhờ tia tử ngoại. Polysacarit của sinh vật sinh ra ta thấy có dextran trùng hợp từ các gốc glucoza, Levan trùng hợp từ Fructoza nhờ vi khuẩn Aerobacter Levanicum và Pulalan trùng hợp từ Maltoza nhờ loại nấm tương tự nấm men là Pullularia Pullulans. Dextran là Plysacarit do vi khuẩn lactic có phân tử lượng là 15000 – 50000000 liên kết giữa các gốc glucoza với nhau bằng mối 1,6 glucorit vi khuẩn sinh ra Leuconostoc mesenteroides. Đột biến : Hợp chất chứa Nitơ như Nitrozomety guanidin metyldicloroety lamin, nitrix, Hydroxylamin hay EtylametanSunfotnat. Inozit rượu mạch vòng 6 nguyên tử. Chương 3 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật. Về chương này cũng nhẹ vì VN ở cách viện sinh học VN đều làm được hết nên tôi cũng chỉ nhắc lại đôi nét về hoocmon Thực vật. Hoocmon thực vật gồm có : Auxin, Giberilin, Xitokin kích thích mô non phân hóa thành cây con. Cách thức : Trước hết dùng 1 tổ hợp phá màn xenlulo bằng Trypxin thành tế bào trần sau đó nuôi trong môi trường dinh dưỡng tiếp đến xử lí hoocmon thành cây con. Hiện nay trên nét có rất nhiều tài liệu về hoocmon thực vật GIới thiệu các chất trong thành phần : • Giberelin được tìm thấy trong việc phá ngủ các hạt giống có tác dụng kích thích nẩy mầm hình thành bằng con đường lên men (lột bỏ vỏ hạt cho lên men) được phân lập từ rễ cân lúa Von và 1 số khác, giống vi khuẩn Fusariummonilifome, Fusarium OxySprum có tất cả 38 loại : + A1 : C19H24O6 Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 14 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 + A2 : C19H26O6 + A3 : C19H22O6 + A4 : C19H24O5 ....... A12 : C20H28O4........ A38 : C20H26O6. Giberelin thúc quả xanh chóng chín và cảm ứng ra hoa ở cây dứa Trên chương nuôi vi khuẩn có giới thiệu cấu trúc. • Auxin là hợp chất của β-indolaxetic chứa trong bộ phận sinh sản của cây cối tham gia vào quá trình sinh trưởng nẩy mầm của hạt giống  hình ảnh minh họa : Chức năng : Auxin Ức chế hạt nảy mầm và kích thích sự rụng lá. • Xitokin (Cytokin) là chất được chiết suất trong tế bào bạch cầu của động vật hay nhựa cây thực vật từ Limphokin Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 15 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Chức năng : Kích thích ra rễ của cành giâm (chiết) và kích thích thu tinh tạo hạt • Etilen : Nuôi cấy tế bào và mô thực vật (nhân giống vô tính) và kích thích sinh trưởng của chồi non • Axit Abscisic Pha ngủ cho mầm hạt, củ khoai tây và tạo quả không hạt Chương 4 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật và động vật hữu nhũ. Tinh chế Phôi : Tinh chế mô phôi được dùng rộng rãi nhất để cho thêm vào môi trường nuôi tế bào + Phôi gà có trống ấp 9-11 ngày lấy phôi cắt bỏ mắt, ,mỏ, chân, cánh, rửa bằng dung dịch hanks trong 1 cái cốc, rồi dùng kéo cắt thật nhỏ hay nghiền nhỏ cho vào ống rồi cho thêm vào 1 thể tích bằng ấy dung dịch hanks chứa 100 đơn vị trong 1ml của Penixilin và Sterptomyxin. Li tâm 30 phút, hút lấy nước trong ở trên là tinh chế phôi gà 50% thử vô trùng như thường lệ, bảo quản ở 12-20 độ C trong ống đậy nút cao su, trước khi dùng phải làm tan chảy li tâm 30 phút, tốc độ 2000 – 3000 vòng/ phút, hút lấy nước trong. Đối với phôi người hay các động vật khác cũng tiến hành tương tự chỉ khác là ngâm mô đã nghiền trong dung dịch hanks 30 phút trong tỷ ấm 37 độ trước khi li tâm. Môi trường dinh dưỡng 5% Lactoalbumin hydrolysat. Gọi tắt là “LH” Đây là môi trường, phổ cập nhất dùng để nuôi tế bào thành phần gồm có : - Lactoalbumin Hydrolysat : 5g Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 16 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 - NaCl : 0,85g - Nước cất 2 lần : 1000ml Trước tiên là hòa tan NaCl vào nước cất. Sau đó cho Lactoal bumin Hydrolysat vào lọc qua lọc Seitz rót vào lọ, đậy nút cao su hàn Parafin (là sáp nến hay sáp đèn cầy), thử vô trùng bằng cách cấy vào canh than thịt Pepton và thạch Saboureaud. Lacoalbumin Hydrolisat thường được dùng ở nồng độ 0,5% nên trước khi dùng phải pha loãng dung dịch mẹ ra 10 lần với dung dịch hanks hay dung dịch Earle. Môi trường Parker còn gọi là (199) Đây là môi trường tổng hợp thường được dùng để dưỡng tế bào sau khi đã gây nhiễm virus Điều chế môi trường Parker đặc 10 lần : - Chuẩn bị các dung dịch riêng rẻ : + Dung dịch 1 tính bằng gam cho 1 lí t môi trường L - acginin : 0,7g L - histidin : 0,2g L – Lizin : 0,7g Dl – Triptophan : 0,2g Dl – phenilalanin : 0,5g Dl – metionin : 0,3g Dl – axit glutamic : 1,5g Dl – serin : 0,5g Dl – treonin : 0,6g Dl – lơxin : 1,2g Dl – izolơxin : 0,4g Dl – valin : 0,5g L – Hydroxyprolin : 0,1g Glyxin : 0,5g Dl – axit asparaginic : 0,6g Dl – alfa – alanin : 0,5g (dl – α - alanin) Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 17 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 L – prodin : 0,4g L – glutamin : 1g Sodium axetat : 0,5g Các axit amin này cùng với sodium axetat được câ sẵn và hỗn hợp ở dạng bột và sẽ cho vào môi trường theo trật tự sẽ nói sau . + Dung dịch 2 : Hòa 400mg L – lirozin và 200mg L-xistin trong 200mg 0,075N HCl đun nóng lên tới 85 – 90 độ C. Lắc mạnh không để sôi, sau đó để dung dịch vào nồi đun cách thủy nhiệt độ 37 độ C thỉnh thoảng lắc cho tan hoàn toàn. + Dung dịch 3 : Axit Nicotinic : 25mg Amit axit nicotic : 25mg Piridioxin Hydroclorit : 25mg Tiamin Hydroclorit : 10mg Ribolavin : 10mg Calcium Pantotenat : 10 mg L – Inozit : 50mg Axit para aminobenzoic : 50 mg Cholin Clorit : 500mg Hòa tan tất cả trong 175 ml nước cất 2 lần, lắc mạnh và khuấy bằng que thủy tinh cho nước cất 2 lần thêm cho đủ 200ml. Rót ra mỗi ống 2ml và bảo quản ở - 20 độ C. + Dung dịch 4 : Sơ bộ chế 2 dung dịch với 2 thành phần như sau A : L – glutation : 10 mg L – Sytin Hydroclorit : 20 mg Axit Ascocbic : 10 mg Hòa tan trong 100 ml nước cất 2 lần. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 18 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 B : Vitamin A : 20 mg Cồn etyl (95%) 2 ml Tween 80 (dung dịch 5% trong 20ml nước ) Vitamin A hòa tan trong cồn etyl sau đó cho thêm tween 80 (axit oleic) Trộn 2 dung dịch A và B cho nước cất 2 lần thêm vào cho đủ 200 ml và cho thêm vào cho đủ 200ml và cho thêm 1g Adeno Zintrifotfat Sodium (ATP) Chế xong rót dung dịch vào ống 10ml và bảo quản ở -20 độ C + Dung dịch 5 : Hòa 100mg biotin trong 75ml, nước cất 2 lần cho thêm 1ml dung dịch 1N HCl để bảo quản được bền hơn cho nước cất 2 lần vào cho đủ 100ml rót ra ống 1ml và bảo quản -20 độ C + Dung dịch 6 : Hòa 10mg axit folic (tinh thể) trong 100ml dung dịch Hanks, rót ra ống 1ml và bảo quản ở - 20 độ C + Dung dịch 7 : Hòa 20mg Vitamin D2 (Calciferol) , trong 40ml cồn etyl 90% cho thêm 40mg Cholesterin. Để làm tan Cholesterin phải lắc mạnh và khuấy bằng que. Sau đó cho thêm 60ml dung dịch 5% Tween 80 rót ra ống từng 5ml một và bảo quản ở -20 độ C. + Dung dịch 8 : 10 mg Vitamin E (alfatocaferol fotfat) Hòa tan trong 100ml nước cất 2 lần rót ra 2 ống từng 1 ml và bảo quản ở - 20 độ C. + Dung dịch 9 : 10 mg Vitamin K hòa trong 100ml nước cất 2 lần, lắc mạnh và đặt và nồi cách tủy 37 độ cho đến khi tan hoàn toàn. Rot ra từng 1 ml và bảo quản ở - 20 độ C. + Dung dịch 12 Hòa 18 mg Guanin (Chlorit) trong 167 ml nước cất 2 lần cho thêm 0,5 ml NH4OH đậm đặc và cho nước cất 2 lần thêm vào cho đủ 180 ml. Đun sôi để nguội và lại cho thêm nước cất cho đủ 180ml. + Dung dịch 13 : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 19 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Hòa 100 mg d-riboza và 100mg α –dezoxyriboza trong 100 ml nước cất 2 lần. Rót từng 5 ml 1 vào ống và bảo quản ở - 20 độ C + Dung dịch 14 : Hòa 100 mg nước cất 2 lần hòa tan 40 mg axit adenilic : Rót ra ống từng 5ml một và bảo quản ở -20 độ C. + Dung dịch 15 : Hòa tan 10 mg Fe(NO3)3.9H2O trong 100 ml nước cất 2 lần. Cho thêm 1 giọt HNO3 đậm đặc. Rót ra ống từng 2ml một và bảo quản ở -20 độ C. Chế môi trường 199 đặc 10 lần trong dung dịch Hanks a. Hòa tan 80 g NaCl trong 200 ml dung dịch 2 cho thêm 30 ml dung dịch 12 và 30 ml dung dịch 13. Hòa tan vào trong hỗn hợp này 4g HCl và sau đó cho 2g MgSO4.7H2O b. Trong 1 bình khác hòa tan 0,6g KH2PO4 trong 55 ml nước cất 2 lần. Hòa tan thêm và đó 0,6g Na2HPO4 (không ngậm nước) hay 1,52g Na2HPO4.12H2O và cho thêm nước vừa đủ 111ml. Dung dich vừa mới chế này đem trộn với dung dịch chế ở điểm a. c. Hòa tan riêng biệt 10g Glucoza (Dextrozơ không ngậm nước) trong 55 ml nước cất 2 lần, cho thêm vào đấy 20ml dung dịch 1% đỏ phenol và trộn với hỗn hợp vừa chế bên kia. d. Trong 1 bình riêng hòa tan hòa tan 1,4g CaCl2 không ngậm H2O trong 60ml 2 lần dung dịch này đem rót từ từ vào hỗn hợp trên, vừa rót vừa lắc mạnh để đề phòng kết tủa Ca3(PO4)2 không tan. e. Cho hỗn hợp vừa chế vào những dung dịch đã chế sẵn dưới đây : Dung dịch 3 2ml Dung dịch 5 1ml Dung dịch 6 1ml Dung dịch 7 5ml Dung dịch 8 1ml Dung dịch 9 1ml Dung dịch 13 5ml Dung dịch 14 5ml Dung dịch 15 2ml Nếu những dung dịch này đã rót sẵn vào ống với những khối lượng nói trên thì sau khi rót vào hỗn hợp phải trán kĩ ống. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 20 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 f. Cho dung dịch 10 vào hỗn hợp và cho thêm nước cất vừa đủ 945ml g. Cho vào hỗn hợp này những axit amin và Natri axetat với khối lượng đã nói trong đơn của dung dịch 1 trộn cẫn thận cho đến khi các tinh thể tan gần hết. h. Cho thêm 5ml hỗn hợp Penixillin và Streptomixin chứa mỗi thứ 20000 đơn vị trong 1ml i. Hỗn hợp vừa chế trên để ở tủ lạnh 1 đêm. j. Cho thêm 10ml dung dịch 4 và nước cất 2 lần vừa đủ 1000ml và trộn cẩn thận. Môi trường đặc 10 lần vừa chế trên đem lọc Seits với áp suất dương, thử vô trùng, rót vào chai và bảo quản ở 4 độ C. • Khi sử dụng pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần. Môi trường Eagle (Igơn) Sau khi nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tế bào động vật bú sữa Eagle đi đến kết luận là đa số loại tế bào cần 13 axit amin, 8 sinh tố (vitamin) Glucozơ và 5 ion (Na, K, Ca, Mg, Fotfat, Clorat )và đề nghị 1 môi trường ít phức tạp hơn so với môi trường 199. Cách chế : thường chế riêng từng dung dịch và chỉ kết hợp lại trước khi dùng. • Dung dịch 1 : Dùng dung dịch hanks không chứa Glucozơ và Bicacbonat Natri thiếu 2 chất này có thể làm vô trùng bằng Sấy. • Để chế 1000 ml môi trường nuôi cấy chứa 10% huyết thanh ngựa. Trước khi dùng người ta trộn 84ml dung dịch 1 với 6,1 ml dung dịch mẹ và 10 ml huyết thanh ngựa sau đó cho thêm dung dịch 7 (Natri Bicacbonat) để đưa PH = 7,2 – 7,4, Môi trường chế xong có thể bảo quản mấy ngày trong tủ lạnh, tuy nhiên 1 số liên kết không bền có thể bị phá hủy nhanh hơn. Nuôi cấy tế bào lưỡng bội Môi trường : Eagle chứa 0,5% Lactoalbumin ủ ở độ, khi tế bào bắt đầu mọc thì thay môi trường mới. Phương pháp tách ADN Cấy tế bào lên môi trường thạch Hottinger. Sau 18 giờ chuyển sang bình cầu chứa 200ml môi trường Spizizen và canh thang Hottiger với tỉ lệ 2:1 . Ủ bình này trong buồng ấm 37 độ C là lắc liên tục, sau 18 giờ tuổi cấy truyền sang 16 bình cầu khác có chứa 200ml môi trường trên. Những bình này cũng nuôi trong 19h. Sau đó có cô tế bào bằng cách li tâm 2,5 – 300 vòng / phút trong 30 phút và rửa 2 lần bằng dung dịch sinh lí (0,14M NaCl + 0,014 Xitrat Na). Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 21 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Bắt đầu tách ADN bằng sự phá hủy tế bào bằng lizozim nguyên sinh chất phá hủy bằng Dodesysunfat 1%, dùng phenol để tách Protein, lắc mạnh và để đó trong 1,5 giờ, sau đó đem li tâm và dùng Pipet hút lấy lớp trên. Cho thêm và đó ete với thể tích tương đương. Lắc mạnh và li tâm 5 phút tốc độ 2000 vòng / phút, ADN nằm ở lớp dưới bằng cách ấy ta đã tách ADN khỏi phenol và Protein lớp trên bỏ đi và cho vào đó cồn Etylic để kết tủa ADN dùng đũa thủy tinh để trộn ADN. Phá hủy ARN bằng ARN – AZA (50 γ/ml) trước đó đem đun ARN aza trong nồi cách thủy 90 độ C để phá hủy ADN- aza hòa tan trong 0,15 M NaCl, ủ với ARN- aza trong 30 phút ở nhiệt độ 37 độ C sau đó xử lí ADN bằng 80% Phenol ở nhiệt độ 37 độ C trong 30 phút và li tâm 10 phút. Hai lần xử lí bằng etylic, ADN bảo quản trong cồn 70 ở tủ lạnh. Nồng độ ADN ADN (γ/ml) = ((E270 – E290).10,1a )/0,19 E : quang học. a: độ loãng. Bảo quản sinh vật bằng phương pháp đông lạnh -15 độ C : – 20 độ C. -20 độ C : - 30 độ C ...... Để tăng khả năng sống sót của cần thêm những chất như hóa chất keo bảo vệ hỗn dịch như : sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, Pepton muxin hay các loại đường, chất làm nhủ hóa là dung dịch glyxerin 15% trong nước huyết thanh ngựa thanh ngựa bình thường không chứa chất bảo quản, dung dịch Saccaroza 10% với Gelatin 1% có PH 6,8 – 7 hoặc các dung dịch chứa Glucoza , Lactoza có 10 – 30% sữa... 13 axit amin : Glutamin, Lơxin, Izolơxin, Valin, Fenillamin, Alginin, Lizin, Hystidin, Triptophan, Metionin, Treonin, Xistin, Tirozin. Sinh tố B (Vitamin) Tiamin, Calci Umpatotenat, axit Nicotinic, Biotin, cholin, axit-folic, Piridoxal. Tế bào sẽ mọc tốt trong sinh tố B dưới dạng Coenzin : Adenozindifotfat (ADP), Adnozintrifotfat (ATP), Coenzim A..... Dung dịch bảo quản mô phôi Cho mẫu mô vào bình vô trùng đựng môi trường gồm 0,5% Hydrolisat lactoalbumin,, 5% huyết thanh bê các kháng sinh B (100 μg/ml, erytromixin 100 μg/ml), Tetraxilin (15 μg/ml Micostatin 100 μg/ml) nước muối đệm Hanks đưa đến phòng thí nghiệm để tách tế bào. Cách tính thông dụng Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 22 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 γ : khối lượng tế bào vi khuẩn khô tạo từ 100g Glucoza G : tốc độ phát triển tính bằng phút Milimol oxy/phút = ((3333)/ γ).41,8G Nếu muốn sản xuất được 40g/l tế bào khô của vi khuẩn hiếm khí chứa cacbon bằng 50% khối lượng của nó và có thể biến đổi được 50% cacbon có trong cơ chất thì cơ chất đó phải chứa ((40 x 50 )/100) x (100/50) = 40g (cacbon) Nếu dạng cacbon được cung cấp dưới dạng Glucoza  công thức môi trường là 40 x (180/72) = 100g (Glucoza). Bổ sung thêm 1 số thông t in còn thiếu trong các dung dịch : Tween : 40 Polyoxyetilen – socbitan – monopalmitat. Tween : 60 polyoxy etylen - socbitan – MonoStrearat. Ax amino axetic : còn gọi là Glyxin hay glycocol. Ion kim loại : Ca(HCO3)2 + 2NaR = CaR2 + 2NaHCO3 Formol : 2CnH2n+1OH + O2  2Cn-1H2n-1CHO + 2H2O Ax α amino glutaric (ax glutamic). Biotin : vitamin H. Lizin : Axit α, β – dimironic. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 23 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 CaSO4 + 2H2O : Thạch cao sống. CaSO4 : thạch cao khan. Hàn the (borax) : Na2B4O7 Rỉ đường nhiều sắt thêm K4[Fe(CN)6] 4Fe+++ + 3[Fe(CN)6]  Fe4[Fe(CN)6]3. Note : Để làm ống hút tế bào các bạn kiếm 1 ống hút nhỏ giống ruột viết bút bi, sau đó canh đốt ở giữ giữ nhiệt đột vừa đủ nóng và bạn từ từ kéo 2 đầu ra cho đến khi ta có 1 ống hút cỡ nhỏ thì có thể dùng để tách, hút tế bào. Về khoa học hiện nay con người đang đi vào điểm cụt và đi lẫn quẫn chưa có khám phá gì mới, các bạn học môn sinh chắc đã nghe qua phương pháp sinh sản vô tính nó cũng chả khác gì với nôi cấy mô phôi là ta có 2 tế bào(trứng) sau đó hút 2 nhân của 1 tế bào này chuyển qua nhân của tế bào kia và đem nuôi cấy cho đế khi phá triển. Khi tôi còn nhỏ có đã nghe qua 1 nhà khoa học phương tây đã khám phá ra 1 phương pháp nuôi tim gà vẫn giữ nhịp đập trong phòng thí nghiệm tới 12 năm, và khi ông ta chết người phụ tá của ông ta đã cố tính phá toàn bộ phòng thí nghiệm của ông ta toàn bộ công trình nghiên cứu và trái tim gà đó đã bị thiêu trụi.... làm cho cả giới khoa học luyến tiếc. Với khoa học hiện nay chỉ có thể giữ được 1 trái tim người hoặc động vật trong 6 -24 giờ thôi. Tôi rất mong các bạn yêu thích môn sinh ở VN có thể khám phá ra nhiều điều kì bí mà giới khoa học chưa khám phá ra, và hãy chia sẽ kiến thức để nước VN ta phát triển mạnh về mọi lĩnh vực công nghệ. Tổng kết: nội dung nuôi cấy tế bào : cần phải tiệt trùng tất cả các lọ đựng nếu không có máy móc hiện đại, đèn tia cực tím thì dùng phương pháp thủ công : ngâm các chai lọ chuẩn bị cho nuôi cấy trong dung dịch axit loãng đun sôi, sau đó cho vào dung nồi chứa nước cất đun sôi tiếp. Còn đối với dung dịch nuôi cấy tế bào thì không được quá chua hoặc quá kiềm giữ PH ổn định trong 7,2 – 7,4. Và phải lắc đều để trách các tế bào lắng xuống đáy mà chết. Lời Kết : tôi xin giới thiệu các bạn 1 phương pháp làm trong suốt(vô hình) vật thể(Xác động vật) gọi là tiêu bản Cách làm Tiêu bản (làm xác chết trong suốt trong dung dịch) có cùng chiết suất sau khi ngâm xác chết động vật vào ete-metylic và axit Salixilic thì vật chất đó sẽ trở nên trong suốt do Spantegonxer (Người Đức thí nghiệm), lưu ý là khi ta đem xác con vật ra nó vẫn y cũ mà không bị tan hay bị rữa nha, nó chỉ trong suốt khi ta đặt xác con vật vào 2 dung dịch trên. Và hiện nay người ta đã tạo ra được áo tàn hình nhờ công nghệ nano tán ánh sáng, tôi hy vọng những ai đọc ebook này sẽ trở thành người thành công và có nhiều thành tựu. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 24 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2011 Lê Hoàng Duy. Tài liệu được chia sẽ miễn phí tại diễn đàn Khotien.vn. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 25