Ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD để đánh giá sự đa dạng din truyền của một số giống lúa (Oryza sativa L.)

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 4(48) Tập 1/N¨m 2008 Khoa häc Sù sèng 53 Sö dông chØ thÞ ph©n tö RAPD ®Ó ®¸nh gi¸ sù ®a d¹ng di truyÒn cña mét sè gièng lóa (Oryza sativa L .) Chu ThÞ Minh Ph−¬ng (Tr−êng §H S− ph¹m Hµ Néi) - Lß ThÞ Mai Thu (Tr−êng §H T©y B¾c), §ç ThÞ Thu H»ng - NguyÔn Vò Thanh Thanh - Chu Hoµng MËu (§H Th¸i Nguyªn) 1. Më ®Çu Lóa lµ c©y trång quan träng nhÊt, cung cÊp l−¬ng thùc cho h¬n mét nöa d©n sè trªn thÕ giíi. ViÖc nghiªn cøu chän t¹o c¸c gièng lóa cã n¨ng suÊt cao, chÊt l−îng tèt vµ chèng chÞu ®−îc víi ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña ngo¹i c¶nh ®ang ®−îc c¸c nhµ khoa häc quan t©m. §Ó cã c¬ së khoa häc cho viÖc chän t¹o c¸c gièng lóa theo ®Þnh h−íng n¨ng suÊt cao vµ kh¶ n¨ng chèng chÞu tèt ®ßi hái ph¶i ph©n tÝch c¸c chØ tiªu sinh lÝ, hãa sinh, x¸c ®Þnh quan hÖ di truyÒn vµ t×m c¸c chØ thÞ ë møc ®é ph©n tö. Mét trong c¸c ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh chØ thÞ ph©n tö vµ quan hÖ di truyÒn ë c©y trång dÔ sö dông vµ cã hiÖu qu¶ cao lµ chØ thÞ RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) [2], [3], [5], [6], [7]. Trong nghiªn cøu tr−íc [1], chóng t«i ®M ®¸nh gi¸ vµ x¸c ®Þnh møc ®é chÞu h¹n cña 7 gièng lóa do ViÖn C©y l−¬ng thùc vµ thùc phÈm vµ ViÖn B¶o vÖ thùc vËt cung cÊp. §Ó tiÕp tôc ph¸t triÓn h−íng nghiªn cøu nµy, chóng t«i quan t©m ®Õn c¸c chØ thÞ ph©n tö vµ x¸c ®Þnh quan hÖ di truyÒn cña 7 gièng lóa nµy, nh»m t¹o c¬ së cho viÖc tuyÓn chän c¸c gièng lóa cã chÊt l−îng tèt lµm vËt liÖu cho chän gièng. 2. VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu VËt liÖu nghiªn cøu 7 gièng lóa nghiªn cøu lµ KS, LC93-4, CH207, CH5, LC93-1, CH7, C70 do ViÖn C©y l−¬ng thùc vµ thùc phÈm vµ ViÖn B¶o vÖ thùc vËt cung cÊp. Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch RAPD T¸ch chiÕt ADN tæng sè theo ph−¬ng ph¸p cña Gawel vµ cs (1991) [4]. Ph−¬ng ph¸p RAPD ®−îc thùc hiÖn theo m« t¶ cña Foolad vµ cs (1995). Ph¶n øng RAPD ®−îc thùc hiÖn trong 20 µl dung dÞch chøa 11,7 µl H2O + 2,0 µl buffer PCR + 2,0 µl MgCl2 (25mM) + 1,2 µl dNTP (2,5mM) + 1,6 µl primer (10mM) + 0,5 µl Taq-polymerase (5 unit/µl) + 1,0 µl ADN mÉu (10 ng/µl). Chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng RAPD lµ 940C trong 1 phót; 45 chu k× víi nhiÖt ®é: 920C trong 1 phót, 360C trong 1 phót, 720C trong 1 phót; sau ®ã 720C trong 10 phót vµ l−u gi÷ ë 40C. §iÖn di s¶n phÈm RAPD trªn gel agarose 2% trong ®Öm TAE 1X ë hiÖu ®iÖn thÕ 100V trong 2 giê. Nhuém gel b»ng ethidium bromide, röa b»ng n−íc, soi vµ chôp ¶nh d−íi ¸nh s¸ng ®Ìn cùc tÝm. Chóng t«i sö dông chØ thÞ RAPD víi 10 måi ngÉu nhiªn: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M10, M11, M13, M17 ®−îc tæng hîp t¹i HMng Invitrogen. Ph©n tÝch sè liÖu dùa trªn h×nh ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña 7 gièng lóa nghiªn cøu víi 10 måi ë trªn. Sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn c¸c b¨ng ®iÖn di ®−îc tËp hîp ®Ó ph©n tÝch sè liÖu theo nguyªn t¾c: Sè 1- xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN vµ sè 0- kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. C¸c sè liÖu nµy ®−îc xö lÝ trªn m¸y tÝnh theo phÇn mÒm NTSYSpc (USA, 1998) ®Ó x¸c ®Þnh quan hÖ di truyÒn cña c¸c gièng lóa. 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Ph©n tÝch sù ®a d¹ng di truyÒn cña c¸c gièng lóa nghiªn cøu T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 4(48) Tập 1/N¨m 2008 Khoa häc Sù sèng 54 L¸ non cña 7 gièng lóa nghiªn cøu ®−îc sö dông ®Ó t¸ch chiÕt ADN tæng sè. KÕt qu¶ kiÓm tra ®é hÊp phô ë m¸y quang phæ cho thÊy, ADN s¹ch, tØ lÖ A260/A280 = 1,8-2,0. H×nh ¶nh ®iÖn di ADN kh«ng bÞ ®øt gMy, cã chÊt l−îng tèt, cã thÓ sö dông ®−îc cho nghiªn cøu vÒ ®a d¹ng di truyÒn ë møc ph©n tö. Chóng t«i ®M tiÕn hµnh sµng läc vµ chän ®−îc 10 måi ®Ó nghiªn cøu ®a d¹ng di truyÒn cho c¸c gièng lóa. KÕt qu¶ cho thÊy, 10 måi ®Òu thÓ hiÖn sù ®a h×nh, víi tæng sè 94 ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n trong ®ã cã 77 ph©n ®o¹n ®a h×nh (chiÕm 81,9%). Sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n ë mçi måi cã kÝch th−íc tõ 0,2 kb-3,0 kb. Trong sè 10 måi dïng ®Ó ph©n tÝch, måi M8 vµ M13 cã sè ph©n ®o¹n ®a h×nh cao nhÊt (100% ph©n ®o¹n ADN ®a h×nh), måi M6 cã sè ph©n ®o¹n ®a h×nh thÊp nhÊt (50% ph©n ®o¹n ADN ®a h×nh), kÕt qu¶ ®−îc thÓ hiÖn ë b¶ng 1. B¶ng 1. Thèng kª c¸c ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n víi 10 måi ngÉu nhiªn Måi Ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n Sè ph©n ®o¹n ADN ®a h×nh TØ lÖ % ph©n ®o¹n ADN ®a h×nh M2 9 8 88,89% M3 13 12 92,31% M4 12 9 75,00% M6 8 4 50,00% M7 10 8 80,00% M8 6 6 100,00% M10 7 5 71,43% M11 10 8 80,00% M13 12 12 100,00% M17 7 5 71,43% H×nh 1. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi måi M4 M: marker 1kb;1- KS; 2- LC93-4; 3- CH207; 4-CH5; 5- LC93-1; 6- CH7; 7- C70. B¶ng 2. Tæng sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn khi nh©n b¶n víi 10 måi RAPD Måi KS LC93-4 CH207 CH5 LC93-1 CH7 C70 Tæng M2 7 8 9 4 8 7 7 50 M3 3 6 8 5 5 8 7 42 M4 11 4 5 8 8 5 11 52 M6 7 6 6 5 6 5 5 40 M7 8 5 5 2 7 4 9 40 M8 5 5 3 5 5 1 5 29 M10 2 2 2 7 7 3 7 30 M11 10 7 6 8 4 4 5 44 M13 2 4 4 4 5 2 6 27 M17 3 4 6 5 6 6 6 36 Tæng 58 51 54 53 61 45 68 390 7 6 5 4 3 2 1 M T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 4(48) Tập 1/N¨m 2008 Khoa häc Sù sèng 55 B¶ng 2 thèng kª sè b¨ng ADN ®−îc nh©n lªn ë tõng gièng lóa nghiªn cøu. Sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n ë c¸c gièng dao ®éng tõ 45 - 68 ph©n ®o¹n vµ tæng sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n tõ 7 gièng lóa víi 10 måi ngÉu nhiªn lµ 390. Gièng C70 cã sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n nhiÒu nhÊt (68 ph©n ®o¹n), cßn gièng CH7 cã sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n Ýt nhÊt (45 ph©n ®o¹n). Måi M4 cã tæng sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n nhiÒu nhÊt lµ 52 cßn måi M13 cã cã tæng sè ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n Ýt nhÊt (27 ph©n ®o¹n). KÕt qu¶ ph©n tÝch RAPD cho thÊy, 4 måi M2, M3, M7, M8 ®M xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN ®Æc tr−ng ë c¸c gièng KS (måi M7-2,0kb), CH207 (måi M2-2,5kb), LC93-1 (måi M3- 3,0kb), CH7 (xuÊt hiÖn tíi 4 b¨ng ADN ®Æc tr−ng ë kÝch th−íc 0,5kb; 0,73kb; 1,5kb vµ 3kb), C70 (måi M7-0,2kb) (B¶ng 3). B¶ng 3. C¸c ph©n ®o¹n ADN ®Æc tr−ng ®−îc nh©n b¶n Måi KÝch th−íc (kb) KS LC93-4 CH207 CH5 LC93-1 CH7 C70 M2 2,5 0 0 1 0 0 0 0 M3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 0,71 0 0 0 0 1 0 0 1,5 0 0 0 0 0 1 0 3,0 0 0 0 0 0 1 0 M7 0,2 0 0 0 0 0 0 1 2,0 1 0 0 0 0 0 0 M8 0,73 0 0 0 0 0 1 0 Tæng 1 0 1 0 1 4 1 3.2. So s¸nh hÖ sè t−¬ng ®ång vµ ph©n tÝch s¬ ®å h×nh c©y cña 7 gièng lóa Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch ®iÖn di vµ thèng kª c¸c ph©n ®o¹n ®−îc nh©n b¶n qua ph¶n øng RAPD, d÷ liÖu thu ®−îc ®em xö lÝ b»ng phÇn mÒm NTSYS ®M x¸c ®Þnh ®−îc biÓu ®å h×nh c©y vµ hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn cña 7 gièng lóa nghiªn cøu. C¸c gièng lóa cã hÖ sè t−¬ng ®ång gÇn 1,00 th× quan hÖ di truyÒn ë møc ®é ph©n tö cµng gÇn nhau vµ ng−îc l¹i nÕu hÖ sè nµy cµng gÇn 0 th× quan hÖ di truyÒn cña chóng cµng xa nhau. Th«ng tin vÒ hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn ®−îc thÓ hiÖn qua b¶ng 4. B¶ng 4. HÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn cña 7 gièng lóa nghiªn cøu (0,00) Tªn gièng KS LC93-4 CH207 CH5 LC93-1 CH7 C70 KS 1,0000 LC93-4 0,6881 1,0000 CH207 0,6989 0,7526 1,0000 CH5 0,5591 0,6989 0,6021 1,0000 LC93-1 0,6236 0,6559 0,6236 0,7204 1,0000 CH7 0,5376 0,6129 0,6666 0,6129 0,6559 1,0000 C70 0,6021 0,6129 0,6236 0,6774 0,7419 0,5913 1,0000 B¶ng 4 cho thÊy, hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn gi÷a c¸c cÆp gièng lóa nghiªn cøu dao ®éng tõ 0,5376 - 0,7526, tøc lµ hÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn cña 7 gièng ®Òu lín h¬n 50%. Gièng KS vµ gièng CH7 cã møc ®é t−¬ng ®ång di truyÒn thÊp nhÊt, cßn cao nhÊt lµ gièng CH207 vµ LC93-4. Tõ sè liÖu ph©n tÝch ë trªn chóng t«i tiÕp tôc thiÕt lËp mèi quan hÖ di truyÒn cña 7 gièng lóa trªn biÓu ®å h×nh c©y (H×nh 2). BiÓu ®å h×nh c©y ë h×nh 2 cho thÊy 7 gièng lóa ®−îc chia thµnh 2 nh¸nh chÝnh: (i) Nh¸nh thø nhÊt gåm 6 gièng KS, LC93-4, CH207, CH5, LC93-1, C70, chia lµm T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 4(48) Tập 1/N¨m 2008 Khoa häc Sù sèng 56 2 nhãm; nhãm I gåm 3 gièng KS, LC93-4, CH207vµ nhãm II gåm 3 gièng CH5, LC93-1, C70; (ii) Nh¸nh thø hai chØ cã 1 gièng CH7. HÖ sè sai kh¸c di truyÒn cña 7 gièng lóa dao ®éng tõ 25% ®Õn 39%. §Æc biÖt, gièng CH7 cã kho¶ng c¸ch di truyÒn so víi c¸c gièng kh¸c lín nhÊt lµ 39%. H×nh 2. S¬ ®å h×nh c©y biÓu diÔn quan hÖ di truyÒn cña 7 gièng lóa nghiªn cøu Trong kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng chÞu h¹n trªn ph−¬ng diÖn sinh lÝ, hãa sinh ë c¸c møc ®é m« sÑo, h¹t n¶y mÇm vµ c©y m¹ ®M c«ng bè cho thÊy ba gièng lóa LC93-4, KS vµ LC93-1 cã kh¶ n¨ng chÞu h¹n tèt nhÊt, cã kh¶ n¨ng ph¶n øng gÇn nhau vµ ®−îc xÕp trong cïng mét nhãm ph©n bè [1]; ë biÓu ®å h×nh c©y dùa trªn ph©n tÝch RAPD (H×nh 2) 7 gièng lóa ®−îc ph©n bè trong 3 nhãm: Nhãm I gåm ba gièng KS, LC93-4, CH207; nhãm II gåm 3 gièng CH5, LC93-1, C70; nhãm III gåm 1 gièng CH7. Nh− vËy, cÇn cã nghiªn cøu s©u h¬n ®Ó x¸c ®Þnh sù tån t¹i mèi liªn quan gi÷a sù ph©n nhãm kiÓu gen vµ ph©n nhãm kiÓu h×nh cña c¸c gièng lóa trªn. 4. KÕt luËn Sµng läc c¸c måi ngÇu nhiªn kÝch th−íc 10bp trong ph¶n øng RAPD víi 7 gièng lóa chÞu h¹n kh¸c nhau ®M x¸c ®Þnh ®−îc 10 måi cã ký hiÖu M2, M3, M4, M6, M7, M8, M10, M11, M13, M17 cho kÕt qu¶ ®a h×nh, trong ®ã måi M8 vµ M13 cã sè ph©n ®o¹n ®a h×nh cao nhÊt (100% ph©n ®o¹n ADN ®a h×nh), måi M6 cã sè ph©n ®o¹n ®a h×nh thÊp nhÊt (50% ph©n ®o¹n ADN ®a h×nh). Sö dông kü thuËt RAPD víi 10 måi ngÉu nhiªn trªn 7 gièng lóa ®M nh©n b¶n ®−îc 390 ph©n ®o¹n ADN. §M nhËn ®−îc c¸c ph©n ®o¹n ADN ®Æc tr−ng tõ 5 gièng lóa (KS, CH207, LC93-1, CH7 vµ C70) víi 4 måi M2, M3, M7, M8. §M x¸c ®Þnh ®−îc quan hÖ di truyÒn cña 7 gièng lóa nghiªn cøu dùa trªn chØ thÞ RAPD. HÖ sè t−¬ng ®ång di truyÒn gi÷a c¸c cÆp gièng lóa dao ®éng tõ 53,76%-75,26%. C¸c gièng lóa ph©n bè ë 3 nhãm cã kho¶ng c¸ch di truyÒn lµ 38% - 39%. Tãm t¾t Nghiªn cøu sù ®a d¹ng di truyÒn cña lóa nh»m phôc vô cho c«ng t¸c chän t¹o gièng lóa cã chÊt l−îng lµ rÊt quan träng. Trong nghiªn cøu nµy, 7 gièng lóa cña ViÖt Nam ®M ®−îc sö Nhãm I Nhãm II Nhãm III T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 4(48) Tập 1/N¨m 2008 Khoa häc Sù sèng 57 dông chØ thÞ RAPD ®Ó x¸c ®Þnh quan hÖ di truyÒn víi 10 måi ngÉu nhiªn. Víi c¸c måi nµy, 94 ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n, trong ®ã cã 77 ph©n ®o¹n ®a h×nh chiÕm 81,9%. C¸c ph©n ®o¹n ADN ®−îc nh©n b¶n cã kÝch th−íc tõ 0,2 kb-3,0 kb. S¬ ®å h×nh c©y biÓu diÔn mèi quan hÖ di truyÒn cho thÊy, 7 gièng lóa nghiªn cøu ®−îc chia thµnh 2 nhãm chÝnh. §Æc biÖt, gièng CH7 sai kh¸c so víi c¸c gièng kh¸c nhiÒu nhÊt lµ 39%. Summary THE USE OF RAPD MARKERS FOR THE ASSESSMENT OF GENETIC DIVERSITY OF SOME RICE CULTIVARS (Oryza sativa L.) It is of great importance to study genetic diversity of rice for quality breeding. In this study, seven rice cultivars from Vietnam were subjected to random amplified polymorphic DNA (RAPD) using polymerase chain reaction with 10 decamer primer. With these primers, 94 discernible DNA fragments were produced and 77 (81.9%) were polymorphic and from seven rice cultivars 390 DNA fragments have been amplified. The size of amplified fragments was ranged from 0.2 kb to 3.0 kb. The phylogenetic tree generated from RAPD data indicates that the 7 analyzed varieties have been clustered in to 2 main groups. Especially, CH7 cultivar is significantly distant from the others with genetic relative coefficient of 39% respectively. Tµi liÖu tham kh¶o [1]. Ng« M¹nh Dòng, Chu Hoµng MËu, NguyÔn Vò Thanh Thanh, Chu ThÞ Minh Ph−¬ng (2008), “So s¸nh kh¶ n¨ng chÞu h¹n vµ ph©n lËp gen cystatin liªn quan ®Õn tÝnh chÞu h¹n cña mét sè gièng lóa (Oryza sativa L.)”, T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ-§H Th¸i Nguyªn, 3 (2), tr: 157-162. [2]. Lª Xu©n §¾c, Bïi V¨n Th¾ng, Lª TrÇn B×nh, Lª Duy Thanh, Lª ThÞ Muéi (2003), “§¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn cña mét sè gièng lóa T¸m ë ViÖt Nam”, T¹p chÝ c«ng nghÖ sinh häc, 1(4), tr: 493-501. [3]. §inh ThÞ Phßng, Lª TrÇn B×nh, Lª ThÞ Muéi, NguyÔn ThÞ H¶i Hµ, Lª Duy Thµnh, NguyÔn V¨n ViÕt (2003), “Nghiªn cøu ®a d¹ng tËp ®oµn gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn Xanthomonas oryzae b»ng kü thuËt RAPD”, Nh÷ng vÊn ®Ò nghiªn cøu c¬ b¶n trong khoa häc sù sèng, tr:571-574. [4]. Gawel N.J., Jarret R.H. (1991), “Genomic DNA isolation”, http:// www.weihenstephan.de/pbpz/bambra/ html/dna.htmn. [5]. Ge S., Oliveira X.C.G., Schaal A.B., Gao L.Z., Hong D.Y., (1999), “RAPD variation within and between natural populations of the wild rice Oryza rufipogon from China and Brrazil”, Heredity, 82, pp: 638-644. [6]. Rabbani A.M., Pervaiz H.Z., Masood S.M. (2008), “Genetic diversity analysis of traditional and improved cultivars of Pakistani rice (Oryza sativa L.) using RAPD markers”, Electronic Journal of bionology, 11(3). [7]. Singh D., Sirohi A., Sharma S., Kumar V., Gaur A., Chaudhary R., Chaudhary N., (2006), “RAPD based identification of farmers’ collections of Kalanamak and traditional varieties of basmati rice”, Indian J.crop Science, 1 (1-2), pp: 102-105.