Ứng dụng các hình thức lên men

Trường ĐẠI HỌC SÀI GÒNLỚP DSI 1081 BÀI THUYẾT TRÌNH MÔN VI SINH VẬT HỌC Ứng dụng các hình thức Lên men ---oOo--- GV HƯỚNG DẪN: Ths. Đặng Thị Ngọc Thanh TRÌNH BÀY: TỔ 1 ĐỖ NGUYỄN HỒNG HẠNH CAO THỊ THUỲ TRANG HUỲNH THỊ DIỄM THUÝ LÊ KIM YẾN NGUYỄN VĂN TÚ TÔ HOÀNG YẾN MAI THỊ TRÀ GIANG PHẠM THỊ MỸ HẠNH __________________ A/ KHÁI NIỆM 1. Lên men Là quá trình phân giải carbonhydrat trong điều kiện kỵ khí. Là quá trình oxy hóa khử cơ chất: Oxi phân tử không tham gia vào quá trình oxi hóa. Hidro được thải dưới dạng: khí hoặc liên kết với các sản phẩm phân giải. Năng lượng sinh ra: Một phần cho các phản ứng khử. Phần còn lại: tích lũy trong các liên kết cao năng. à Năng lượng sinh ra trong lên men không bằng năng lượng sinh ra từ hô hấp. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men: CO2 Các hợp chất carbon chưa được oxi hóa hoàn toàn: rượu, acid hữu cơ, aldehyd, keton,… 2. Lên men oxi hóa Phần lớn VSV hiếu khí oxi hóa triệt để cơ chất thành CO2 và H2O (hô hấp hiếu khí). Trong CO2, C đạt mức oxh cao nhất nên người ta gọi quá trình này là oxy hóa hoàn toàn. Lên men oxi hóa KHÔNG hoàn toàn: Một số VSV oxi hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí nhưng sinh ra những sản phẩm chưa được oxh hoàn toàn như: a.acetic, a.limonic, a.fumaric, a.gluconic,… Ví dụ: Lên men giấm là quá trình oxh rượu thành giấm do một nhóm vi khuẩn acetic (Acetobacter) thực hiện: C2H5OH + O2 à CH3COOH + H2O B. LÊN MEN RƯỢU 1. Vi sinh vật gây lên men Rượu ethylic là sản phẩm lên men đường khá phổ biến của nhiều nhóm vi sinh vật , chủ yếu là các loài nấm men đường ( Saccharomyces ) . Các loài nấm men thường dung trong sản xuất bia rượu là Sac. Cerevisiae , Sac. Ellipsoids , Sac. Carlsbergensis Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc và vi khuẩn kỵ khí cũng tạo thành rượu như là một sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ trong quá trình lên men hexose hoặc pentose 2. Cơ chếa/ Phương trình tổng quát : C6H12O6 à 2 C2H5OH + 2 CO2 + 113,4 kJ b/ Các phương trình lên men rượu Đường ------con đường EMP--------> acid pyruvic 3. Điều kiện của quá trình lên men rượu ( theo Custeurs ) Kỵ khí Loại đường có thể lên men pH : 4,5 – 5,5 Nhiệt độ : 25 – 33 oC Lượng nấm men giống : 0,26 % khối lượng cơ chất * Sản xuất ethanol từ đường và tinh bột Ethanol được sản xuất từ cây mía, bã mía, bắp, thân và hạt lúa miến, củ cải đường, lúa mạch, đai, bố, khoai tây, khoai lang, trái quả, hoa hướng dương, rơm rạ và các loại sinh khối khác. Phương trình tổng quát : C6H12O6 → 2C2H6O + 2CO2 I . Các bước cơ bản Xử lý nguyên liệu để nhận được đường hoà tan. Sử dụng men hoặc vi khuẩn để biến đổi đường thành ethanol và CO2 . Chưng cất ethanol từ fermented mash.Nếu cần thiết, khử nước để thu đựơc ethanol khan. II . Một số quy trình sản xuất ethanol 1 . SẢN XUẤT ETHANOL TỪ MÍA ĐƯỜNG Ethanol thu được từ nước mía sau quá trình lên men nhưng các quy trình thực tế liên quan lại phụ thuộc vào loại chưng cất. Qúa trình lên men diễn ra ở nhiệt độ từ 33-35oC và mật độ cell khoảng 8-17%v/v và được dừng lại khi lượng ethanol trong chất lỏng đạt tới khoảng 10% vì nếu vượt quá mức độ đó, ethanol sẽ bắt đầu giết chết men. 2 . SẢN XUẤT ETHANOL TỪ TINH BỘT * Sản xuất ethanol từ ngô -Nghiền: ngô được xay thành bột mịn. -Hoá lỏng và đun nóng bột mịn: Bổ sung chất lỏng vào bột mịn để làm hỗn hợp nghiền nhừ, sau đó dùng nhiệt để chuyển tinh bột thành dạng lỏng và loại bỏ vi khuẩn. -Thuỷ phân enzyme: Enzyme được bổ sung để phá vỡ chuỗi carbonhydrate để chuyển tinh bột thành chuỗi đường ngắn và thậm chí phân tử đường glucose. -Lên men: Hỗn hợp nghiền nhừ sau thuỷ phân được chuyển vào bồn lên men nơi men được bổ sung để chuyển hoá glucose thành ethanol. -Chưng cất: Nước súp tạo ra trong quá trình lên men là dung dịch ethanol hoà tan (10-12%). Dịch được bơm qua nhiều tháp trong khoang chưng cất để tách ethanol khỏi chất lỏng và nước. Sau khi chưng cất, ethanol có độ tinh khiết 96%. - Chất rắn được bơm ra khỏi đáy thùng và được chế biến thành sản phẩm phụ giàu protein cho sản xuất thức ăn chăn nuôi DDGs. -Tách nước: Lượng nước rất nhỏ trong ethanol vừa chưng cất được tách ra bằng vi lưới lọc để cho ethanol tinh khiết 3 . SẢN XUẤT ETHANOL TỪ CỦ CẢI ĐƯỜNG - Cũng giống như mía đường, củ cải đường có thể dùng để sản xuất ethanol từ nước mật được lên men của nó qua quá trình lên men và quá trình chưng cất có thể sản sinh ra cả đường và ethanol. * Sản xuất bia rượu bằng phương pháp lên men I . Định nghĩa Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí, trong đó vi sinh vật chủ yếu là nấm men chuyển hoá đường thành rượu etylic. II . Quy trình a/ Phương trình tổng quát C6H12O6 à 2 C2H5OH + 2 CO2 b/ Phương trình cụ thể (C6H10O5)n à C12H22O11 C12H22O11 à C6H12O6 C6H12O6 à 2 C2H5OH + 2 CO2 III. Ứng dụng Rượu lên men với nồng độ thấp (chỉ khoảng 8-12% rượu) sẽ được chưng cất để cho ra rượu đế với nồng độ cao hơn Lên men cổ điển là ngành sản xuất lên men qua đó ta thu được những sản phẩm có phân tử lượng nhỏ hơn nguyên liệu ban đầu, điều lưu ý là phương pháp lên men cổ điển có thể thay thế bằng phương pháp hoá học. Ví dụ như quá trình sản xuất rượu (là một phản ứng dị hóa). * Ứng dụng nấm men làm nở bột bánh mì I. NGUYÊN LIỆU VÀ TÁC DỤNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN LÀM BÁNH MÌ : BỘT MÌ. THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG: PROTIT. Globulin. Protalamin. Albumin. Glutelin. => Các pro này se tao thành khung gluten ( ruột bánh mì ). GLUXIT. LIPIT. CÁC THÀNH PHẦN KHÁC: NƯỚC: TIÊU CHUẨN CỨNG CỦA BÁNH. MUỐI: TẠO VỊ ( NGĂN LÊN MEN KHI HÀM LƯỢNG NHIỀU ). ĐƯỜNG: CẦN CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN ( LEN MEN BỊ ỨC CHẾ KHI HÀM LƯỢNG NHIỀU ) CÁC NGUYÊN LIỆU TẠO VỊ KHÁC NHƯ: TRỨNG GÀ, MẬT ONG, CHẤT THƠM. II. QUI TRÌNH SẢN XUẤT BÁNH MÌ: QUY TRÌNH 1: NGUYÊN LIỆU => NHÀO BỘT => LÊN MEN => ĐỊNH HÌNH => NUỚNG BÁNH => Ổ BÁNH MÌ. QUY TRÌNH 2: NGUYÊN LIỆU => NHÀO BỘT => ĐỊNH HÌNH => LÊN MEN => NƯỚNG BÁNH => Ổ BÁNH MÌ. III. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MEN TRONG SẢN XUẤT BANH MÌ : Tên gọi: Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn. Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất đuợc sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới. Phân loại: Giống (chi) Saccharomyces có khoảng 40 loài (van der Walt, 1970) và các loài trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu,… chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn hoa,… Trong đó: loại được con người sử dụng phổ biến nhất là Saccharomyces cerevisiae, nó được dùng để sản xuất rượu vang, bánh mì và bia từ hàng nghìn năm trước. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-14 mircomet.Saccharomyces là loại nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào. Nguyên liệu chính dùng để sản xuất men là mật rỉ đường, ngoài ra một số hóa chất khác sẽ được cung cấp trong quá trình nuôi cấy men để bổ sung các chất dinh dưỡng mà mật rỉ không đủ. Quá trình nuôi dưỡng men Saccharomyces là quá trình hiếu khí vì vậy người ta phải thổi vào bồn lên men một lượng khí rất lớn.Trong quá trình nuôi cấy nấm men người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồn lên men theo lượng cồn có trong môi trường lên men. Nếu lượng mật nạp vào nhiều quá nấm men sẽ không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khiến nồng độ cồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu lượng mật nạp vào quá ít nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng cho sinh trưởng. => Lên men là kỵ khí, nuôi nấm men là hiếu khí. 3. Đặc điểm nấm men dùng trong sản xuất: Không thể đơn thuần dựa vào hình thái kích thước, hay khả năng lên men của nấm men để xác định nấm men tốt hay xấu, cần có sự phối hợp giữa các thông số này. Kết quả phân tích nấm men bánh mì hiện được sản xuất ở Liên Xô và một số nước khác, người ta đã đưa ra các tiêu chuẩn nấm men Saccharomyces cerevisiae được chọn để sản xuất men bánh mì như sau: - Tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng, đường kính ít nhất 7×11 mm. - Hoạt tính maltase:biểu thị thời gian để 1g nấm men ép phóng thích ra 10ml CO2 khi lên men 20 ml dung dịch đường maltose 5%≤70 phút. - Hoạt lực làm dậy bột: biểu thị thời gian 5g nấm men ép làm nở khối bột 280g đến chiều cao 1,5cm theo khuôn có kích th ước xác định, không quá 45 phút. - 100% bền vững với rỉ đường : chỉ tiêu này được đưa ra sau nhiều năm nghiên cứu, cho thấy nấm men càng nhạy cảm với nồng độ rỉ đường thì khả năng sinh sản qua các thế hệ càng nhanh. Chủng nấm men được đánh giá là bền vững 100% đối với rỉ đường, nếu chúng tồn tại 6-7 thế hệ mà không bị chết trong môi trường có nồng độ rỉ đường cao. - Khả năng sinh sản nhanh và ít bị thay đổi trong quá trình bảo quản. - Có khả năng lên men được đường saccharose , glucose và maltose. - Có enzime zimaza và maltaza cao. - Khả năng tích lũy sinh khối nấm men là 0,2/h, trong điều kiện nuôi nấm men có sục khí, môi trường có nồng độ chất khô là 8% ở 30ºc trong 6h.Thường lên men tốt nhất ở nồng độ đường 30% với PH = 5. IV. QUI TRÌNH LÀM BÁNH MÌ : 1. Nhào bột: Khâu này rất quan trọng nếu muốn bánh thật bông và mềm. Bột nhào chưa đủ hoặc nhào kĩ quá đều giảm khả năng nở của bột. 2.Lên men bột nhào: Muốn có bánh mỳ ngon, xốp, ruột nở thì phải làm nở bột nhào. Bột nhào được làm nở bằng các phương pháp khác nhau: vật lý, hóa học và hóa sinh học. Phương pháp sinh hóa học : được coi là phương pháp chủ yếu để làm nở bột nhào. Đó là sự lên men rượu. Trong quá trình hoạt hóa các nấm men đã chuyển đường và tinh bột trong bột mỳ qua nhiều giai đoạn biến đổi trung gian và cuối cùng tạo thành khí cacbonic. Chính khí cacbonic này làm nở bột nhào. Một phần nhỏ khí cacbonic được tạo thành do sự lên men lactic. 3.Định hình : nắn bột tuỳ theo nhu cầu. 4.Nướng bánh : Các quá trình vi sinh, hóa sinh và keo xảy ra trong bột nhào khi nướng: Trong những phút đầu tiên của quá trình nướng, hoạt động của nấm men và vi khuẩn lên men acid được tăng cường, còn sau đó thì giảm dần và đình chỉ hẳn. Quá trình lên men rượu đạt cực đại khi bột nhào được làm nóng đến 350C, khi nhiệt độ tăng lên đến 450C thì sự tạo thành bọt khí giảm xuống rõ rệt, còn khi nhiệt độ đạt đến 500C thì thực tế các quá trình vi sinh đều ngừng hẳn. Sự lên men lactic cũng được đẩy mạnh trong thời gian đầu và sau đó giảm xuống, lúc đầu hoạt động của vi sinh vật bị ức chế, còn sau khi nhiệt độ đạt 700C thì chúng bị tiêu diệt. Do hoạt động của vi sinh vật mà trong những phút đầu tiên của quá trình nướng bánh, hàm lượng rượu, CO2 và acid tăng lên đôi chút, làm cho thể tích của bánh tăng lên, mùi vị bánh được cải thiện.Trong thời gian nướng, quá trình thủy phân tinh bột bằng men (fecmen) và acid (không đáng kể) xảy ra trong cục bột nhào. Cường độ màu của vỏ bánh phụ thuộc vào hàm lượng các acid amin và các đường khử trong bột nhào, nhiệt độ buồng nướng, độ xốp thưa dày của bánh trong sàn nướng, thời gian nướng. Các quá trình keo xảy ra chủ yếu trong khối bột nhào khi nướng là sự hồ hóa tinh bột và sự đông tụ protit. Sự thay đổi này diễn ra khi mỗi lớp cục bột nhào nóng đến nhiệt độ 55- 600C. Thời gian nướng bánh tinh bột chỉ được hồ hóa một phần.Quá trình biến tính của protit do tác dụng của nhiệt xảy ra ở nhiệt độ 50- 700C. Khi bị đông tụ, protit nhả nước và chặt lại, mất tính đàn hồi. Protit bị biến tính tạo thành bộ khung cho bánh mỳ, cố định hình dáng của bánh. Bánh nướng ra lò phải đạt yêu cầu: Màu sắc phải có màu vàng nhạt. Hình dáng bên ngoài: Bánh sau khi đã ra khỏi lò nướng thì có kích thước đồng đều, bề mặt bánh phẳng, nhẵn và bóng. Lớp vỏ bên ngoài có độ giòn, cứng và dày hơn. Phần ruột hơi đặc và có mùi thơm nhẹ, dễ chịu. * Ứng dụng nấm men sản xuất sinh khối. Nấm men có nhiều ưu điểm trong việc sản xuất sinh khối: Sinh trưởng, phát triển nhanh ( 30 – 60 phút / thế hệ ). Lên men nhanh, tận dụng được các phế liệu rẻ tiền,giá trị dinh dưỡng cao ( chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống, giàu vitamin đặc biệt là nhóm B. Trong công nghệ sinh học người ta sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào. I. PROTEIN ĐƠN BÀO: - Là những protein được sản xuất từ vi sinh vật.Trên cơ sở AND tái tổ hợp các protein nguyên thể ( thế hệ thứ nhất ) hoặc protein đã được sửa đổi hay mới ( thế hệ thứ hai ) đã được sản xuất ra. - Do có tốc độ sinh sản nhanh nên vi sinh vật có thể sản xuất protein với số lượng lớn trong một thời gian ngắn, sản phẩm được tinh sạch không có nguy cơ nhiễm virus như các trường hợp được tách chiết từ người. II. ƯU ĐIỂM SẢN XUẤT PROTEIN ĐƠN BÀO TRÊN QUI MÔ LỚN Sử dụng môi trường đơn giản, rẻ tiền. Các chu kỳ lên men ngắn ngày. Có thể kiểm soát được quá trình sinh lý của VSV trong quá trình lên men. Có thể kế họach hóa việc thu hoạch pro một cách hợp lí. Hiệu suất pro có thể tăng lên nhiều lần bằng cách cải thiện các chủng truyền thống và phát triển quá trình lên men cùng với việc sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp. Các kĩ thuật AND tái tổ hợp cũng mở ra cơ hội cho việc sản xuất sinh khối enzim của các VSV có điều kiện sống khắc nghiệt ( t0 ) nay có thể sinh trưởng thuận lợi trong môi trường (ưa nhiệt trung bình 20 – 400 C ) và có thể sản xuất enzim với các đặc điểm chịu nhiệt cao. Enzim VSV có thể thay thế enzim động - thực vật: Một số enzim công nghiệp được tách chiết từ Bò vẫn có thể tiềm ẩn nguy cơ bệnh não dạng xốp. Vd: Renin được thu từ dạ dày của bê con mới sinh sẽ được sử dụng làm phomát. Tuy nhiên, nó vẫn chưa đảm bảo có gây hại đến sức khỏe con người hay không. Trong khi đó, renin tái tổ hợp của bê con hiện nay có thể được sản xuất từ VSV hoàn toàn an toàn. III. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO SINH KHỐI PROTEIN ĐƠN BÀO Enzim protease của Mucor ( nấm mốc ) trong nhiều trường hợp đã thay thế renin từ dạ dày của bê. Protease của Aspergillus ( nấm mốc ) và Bacillus đã thay thế cho các enzim dùng trong thuộc da. Rất nhiều loại amylase VSV được phát triển để thay thế hoặc bổ sung cho các amylaes trong thực vật để tạo malat của lúa mạch hoặc lúa mì. Saccharomyces vá Aspergillus tái tổ hợp enzim glycosyl hóa ở ĐV có vú. Ở đây, vật chủ sẽ glycosyl hóa enzim để cung cấp hoạt tính đầy đủ cho dù các đường glycosyl hóa ở đây có khác so với ĐV có vú. Các enzim cũng có thể được sản xuất trực tiếp bằng cách nuôi cấy trong tế bào ĐV có vú. Tuy nhiên, giá thành rất cao 1000 – 5000 USD / năm - Mức giá chỉ thích hợp để sản xuất enzim trị liệu đặc biệt: Plasminogen của mô hoặc các loại pro liên quan. CẦN LƯU Ý: Chọn giống thích hợp - phải có khả năng sinh trưởng nhanh, không khuyết dưỡng, không có hệ thống enzim không mong muốn trong sản phẩm cuối cùng. Sự biểu hiện của các pro tái tổ hợp trong nấm men ( Vd: Asper.niger ) đòi hỏi có sự hợp nhất của gene và promoter của nấm. IV. CÁC BƯỚC TÁI TỔ HỢP PROTEIN Nhận dạng trình tự. Xác định cấu trúc và mô hình hóa. Biến đổi trình tự. Phát triển phân tử. Biểu hiện: Khi một trình tự mới được xác định, cần phải cho nó biểu hiện để chứng minh chức năng của protein. Phân tích: Bước phân tích đặc điểm của protein rất quan trọng để tìm ra chức năng mới của protein hoặc thực hiện việc sửa đổi. V. QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN Một số protein chỉ được sản xuất một lượng nhỏ ở người bây giờ có thể sản xuất theo một sản lượng lớn: Hoocmon tăng trưởng. Interferon g. Hoocmon của bò b - endocphin. Interleukin – 2 của người. Globulin miễn dịch của chuột. Interleukin – 3 của chuột. b - galactosidase. Các protein sản xuất qui mô công nghiệp là các protein ngoại bào từ các cơ thể như: - Aspergillus sp. - Bacillus sp. => Bao gồm: a- amylase, B- glucanase, cellulase, dextranase, protease, glucoamylase. IV. THU HỒI PROTEIN ĐƠN BÀO Các protein đơn bào hiện diện bên ngoài tế bào trong các chất gian bào ( Protein ngoại bào )hoặc trong nội bào. Việc thu nhận các protein này khá dễ dàng và tinh sạch. Tế bào và nồng độ của dung dịch hoạt động được loại bỏ đơn giản, có thể cung cấp protein thô cho một số ứng dụng. Làm khô mô ( trong MT chân không, trong không khí hoặc kết tủa dung môi với nước). Sau đó chiết protein bằng cách hydrat hóa. Các bước thu hồi và tinh sạch protein ngoại bào giống như prtein nội bào sau khi tinh sạch. Việc phá vỡ tế bào ở VSV tương đối khó vì các tế bào VSV dai hơn và có kích thước nhỏ hơn Đ – TV. Nhiều enzim từ nấm men có thể được tách chiết từ dung môi không trộn nước như: toluen, chlorofom. Các dung môi hòa tan nước như: ethanol, 2- propanol được dùng để tách chiết enzim từ khoảng gian bào. Một số trường hợp có thể dùng enzim để phá vỡ màng tế bào. Ví dụ như: Ở nấm men có thể bị phân giải bởi b - glucanase. 3 phương pháp chính để giải phóng protein khỏi tế bào VSV: Phương pháp enzim: Lysozyme được sản xuất từ lòng trắng trứng gà thủy phân các liên kết b - 1,4 – glycosidic trong mucopeptide của thành tế bào vi khuẩn. Do giá thành tương đối cao và dễ gây nhiễm bẩn nên lysozyme chỉ được dùng để giải phóng acylamidase khỏi Pseudomonas fluorescens ( vi khuẩn ). Các phương pháp hóa học: Xử lý kiềm: enzim trị liệu L – asparaginase có thể được giải phóng khỏi Erwinia chrysanthemi bằng cách ủ tế bào ở pH 11 – 12,5 trong 20 phút. Chất tẩy rửa: Ion: sodium cholate ( anion ), cetyl trimehtyl ammonium bromide ( cation). Không phải ion: Trixton X – 100, X – 450, Tween. Phương pháp vật lý: Shock thẩm thấu: dùng để giải phóng protein ra khỏi khoảng gian bào. Đó là sự tương tác giữa môi trường ưu trương và môi trường trong tế bào gây phá vỡ tế bào. Nghiền: bao gồm một buồng chứa các hạt thủy tinh và đĩa khuấy quay tròn. Một số phương pháp khác nhu: trượt rắn, trượt lỏng. Một số phương pháp thu hồi protein sau khi loại bỏ các mảnh vỡ tế bào: Phương pháp li tâm. Lọc màng. Phương pháp sắc kí. Hệ phân tách hai pha nước: Nhờ vào khả năng hòa tan khác nhau vào hai pha của các protein và các mảnh vỡ tế bào. Ví dụ: Tinh sạch formate dehydrogenase khỏi nấm men Candida bodinii C/ LÊN MEN LACTIC Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. 1. Vi khuẩn lactic Thuộc họ Lactobacteriaceae như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium. Đây là những cầu khuẩn, trực khuẩn, G+, không tạo bào tử, hầu hết không di động, catalase (-), oxydase (-), nitrate reductase (-). Có nhu cầu dinh dưỡng cao : giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. pH phù hợp : 5,5 – 6, pH < 5,5 quá trình lên men dừng lại. to thích hợp : 15 – 500 C. t0 > 800 C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt. Có 2 loại : + VK lactic đồng hình : Lactobacteriumcasei, Streptococcus cremoris… + VK lactic dị hình : Streptobacterium hassice fermentatae, Lactobacterium lycopersici… 2. Cơ chế lên men lactic Có 2 kiểu lên men lactic : lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. a/ Lên men lactic đồng hình : sản phẩm 90% là acid lactic, 1 ít acid acetic, ethanol, không có CO2. Phương trình tóm tắt quá trình lên men lactic đồng hình : C6H12O6 Ò 2C3H6O3 + 136 kJ ( 32,4 kcal) Glucose (Con đường EMP )Ò acid pyruvic (khử) Ò acid lactic ( CH3CHOH – COOH) Đầu tiên hoạt hóa hexose thành hexose diphosphate ( có mặt acid phosphoric)Òcắt mạch tạo nên triophosphateÒ pyruvate (nhận H từ NAD.H2 ) Ò ACID LACTIC. b/ Lên men lactic dị hình : sản phẩm cuối cùng khá đa dạng : acid lactic, etanol, acid acetic,glycerin và CO2 Phương trình cơ bản : C6H12O6 Ò CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + COOH(CH2)2COOH + CO2 Vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzim chủ yếu của con đường EMP như aldolase và triophosphatisomerase nên phân giải glucose theo con đường Pentoso – phosphate ( PP). Sản phẩm trung gian của con đường PP như glucose – 6 – phosphate (loại đi 1 phân tử CO2 ) Ò ribulose – 5 – phosphate Ò glyceraldehyde – 3 – phosphate và acetyl – phosphate. Acetyl phosphate chuyển hóa thành ethanol hoặc acid acetic, glyceraldehyde – 3 – phosphate biến đổi thành acid lactic. 3. Ứng dụng a/ Sản xuất acid lactic - Nguyên liệu dùng sản xuất acid lactic là : rỉ mật, đường, tinh bột đã được đường hóa. Nồng độ đường từ 8 Ò 20%. - Nồng độ pH phù hợp từ 6,3 Ò 6,5. - Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 50 C. - Trong công nghiệp nhẹ, acid lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da. - Trong công nghiệp rượu, acid lactic được dùng dưới dạng muối của canxi. Công nghệ sản xuất acid lactic phải qua 3 giai đoạn chính: Giai đoạn 1: Chuẩn bị môi trường lên men. Giai đoạn 2: Điều khiển quá trình lên men. Giai đoạn 3: Tạo lactate canxi và thu nhận acid lactic. 1. Chuẩn bị môi trường lên men: Nguyên liệu thường được sử dụng là mật rỉ đường. Pha loãng theo tỉ lệ nước: rỉ = 3:1, sau đó cho dung dịch này chảy qua than hoạt tính để hấp thụ các chất màu và tạo các chất keo có trong mật rỉ (mật rĩ sẽ sáng mau hơn). Làm loãng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% và acid hóa môi trường bằng acid sulfuric 0,5% so với lượng rỉ đường. Tiếp tục pha loãng dung dịch đường xuống còn 5-10% và điều chỉnh pH ngược lại đến 6,3-6,5. Làm nguội dung dịch đường xuống 50oC và bơm chúng vào thùng lên men. 2. Điều khiển quá trình lên men: Vi khuẩn lactic đã được nuôi cấy riêng lượng men giống chiếm 3-5% thể tích thùng lên men (được trang bị cánh khuấy và ruột rà để cấp nhiệt độ. Sử dụng vi khuẩn Lactobaccillus denbruckii. Lên men lactic được tiến hành ở nhiệt độ 50oC. pH duy trì 5-6. Thời gian lên men 7-10 ngày. Quá trình lên men lactic sẽ tiến hành thuận lợi khi môi trường có phản ứng acid. Vì vậy, phải trung hòa lượng acid lactic thừa đến pH 6,3-6,5. Sử dụng vôi mịn để trung hòa lượng acid tạo thành nhằm tránh hiện tượng acid hóa dung dịch lên men và tạo ra lactate canxi. Số lượng CaCO3 cho vào tùy thuộc vào lượng acid lactic tạo thành và đủ để trung hòa lượng acid lactic trong dung dịch lên men. 3. Giai đoạn tạo lactate canxi và thu nhận acid lactic: Dung dịch sau khi lên men được đun nóng đến 80-90oC. Dùng CaCO3 điều chỉnh độ pH dung dịch lên men đến 10-11 và giữ yên pH này trong 3-5 giờ. Đem lọc dịch trong bằng máy lọc khung bản ở nhiệt độ 70-80oC. Toàn bộ dịch lên men chuyển qua thiết bị tạo tủa lactate canxi (10-16h). Sau đó đem lọc bằng máy lọc khung bản. Lọc xong để riêng kết tủa và dịch lọc. Dịch lọc được đem đi cô đặc lại và đem kết tủa lại lần nữa để thu hồi toàn bộ acid lactic có trong dịch lên men. Phần kết tủa này được trộn chung với phần trước và đem sang thiết bị thu nhận acid lactic. *Thu nhận acid lactic: Cho acid sulfuric vào phần kết tủa khi đó phản ứng sẽ xảy ra và tạo thành CaSO4 kết tủa, loại bỏ phần kết tủa này thì thu được acid lactic. Acid lactic được tạo thành theo phương trình sau: Ca(C3H5O3) + H2SO4→CaSO4↓+ C3H6O3 Dung dịch acid lactic đệm khử màu bằng than hoạt tính và đem cô chân không để thu nhận acid lactic tinh khiết. b/ Sản xuất sữa chua Sữa chua là loại sản phẩm lên men của sữa tươi. Trong sữa chứa đường, casein và các loại muối khoáng khác nên là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Trong sữa tươi bao giờ cũng nhiễm ít nhiều vi khuẩn. + Nhóm vi khuẩn gây thối sẽ phân hủy một ít protein của sữa đồng thời tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển.+ Vi khuẩn lactic sẽ tích lũy dần axit lactic cho nên sẽ ngăn cản sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây thối. QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỮA CHUA Sữa nguyên liệu Lên men Chuẩn hóa Phối trộn Điều chỉnh SNF Rót sản phẩm Bài khí Đồng hóa Bảo quản lạnh Sữa chua Thanh trùng Cấy giống c/ Muối chua rau quả Muối chua rau quả là hình thức lên men tự nhiên. QUY TRÌNH MUỐI CHUA RAU QUẢ: 3 giai đoạn Giai đoạn 1: Dùng muối ăn (NaCl) có nồng độ 2,5 – 3%. Áp suất thẩm thấu cao do muối sinh ra sẽ rút chất dịch tế bào trong dưa ra. Lúc đó vi khuẩn lactic và vi khuẩn gây thối lúc đầu có thể cùng phát triển. Giai đoạn 2: Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, tích lũy nhiều axit lactic nên ức chế sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây thối, rau quả trở nên chua, ngon.Đây là giai đoạn quyết định, nếu không tạo được ưu thế của vi khuẩn lactic, thì các vi khuẩn khác sẽ phát triển làm rau, dưa khú . Giai đoạn 3: Khi rau quả đã chua dần và đến 1 độ chua nhất định thì sẽ làm ức chế hoạt động của nhóm vi khuẩn lactic. Khi đó trên bề mặt dung dịch sẽ xuất hiện những lớp váng trắng. Nếu cứ để tự nhiên như vậy thì các nấm men Geotrichum candidum sẽ bắt đầu phát triển và có khả năng oxi hóa axit lactic thành CO2 và H2O, do đó làm cho dưa giảm dần độ chua. Khi đó vi khuẩn gây thối lại phát triển gây khú dưa. d/ Ủ chua thức ăn gia súc Nhờ ủ chua mà thức ăn mà thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi và vẫn không hao hụt về mặt chất lượng dinh dưỡng. Đặc biệt thức ăn sau khi ủ chua có lượng vitamin nhiều hơn trước khi ủ. QUY TRÌNH Ủ CHUA THỨC ĂN GIA SÚC a) Phương pháp ủ b) Giai đoạn chuyển hóa: Các vi sinh vật có sẵn trên nguyên liệu sẽ phát triển dần lên. Đầu tiên nhóm vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh, chúng sử dụng O2 có trong nguyên liệu ủ và phân giải dần protein của nguyên liệu. Kết quả là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển và tích lũy dần axit lactic. Ngoài việc tạo ra axit lactic còn có axit axetic và protein được thủy phân thành peptid, amino acid, amin… Sau 3 tuần ủ, cho gia súc ăn, cho ăn liên tục đến hết tránh bị hỏng. Lúc lấy cỏ hạn chế không khí vào trong túi nilon hoặc hố có thể làm hỏng cỏ. Cỏ ủ tốt có mùi thơm acid dễ chịu, không đắng, không chua gắt. màu vàng xanh đồng đều và không có hiện tượng mốc. D/ LÊN MEN METHANE 1. Vi sinh vật lên men methane Vi khuẩn lên men methane là tập hợp nhiều loài khó phân lập riêng nên còn gọi là khu hệ vi sinh vật sinh methane. Vi khuẩn sinh methane cũng là những loài vi khuẩn kị khí bắt buộc. Chúng chuyển hóa rượu và axit hữu cơ thành CH4, CO2 và có thể còn sinh ra một số axit hữu cơ oxi hóa triệt để. Nguồn C của CH4 là CO2, nhóm –CH3, cơ chất ( chất cho H) là H2, rượu. 2. Cơ chế lên men methane Quá trình phân hủy yếm khí được chia thành giai 3 đoạn chính như sau: Phân hủy các chất hữu cơ cao phân tử. Tạo nên các axít. Tạo methane. 3. Ứng dụng Lên men sinh khối làm thức ăn gia súc. Tạo sinh khối giàu protein và vitamin. Làm sạch nước thải. Xử lí rác, tạo methane làm nhiên liệu. E/ CÁC QUÁ TRÌNH LÊN MEN KHÁC 1. Lên men propionic : a/ Khái niệm : - Lên men propionic là quá trình chuyển hoá axit lactic và muối lactate thành axit propionic dưới tác dụng của vi sinh vật. - Ngoài axit propionic còn có các sản phẩm khác như: axit axetic, khí cacbonic và nước. b/ Vi sinh lên men propionic: Bacterium acidipropionic c/ Ứng dụng : Sản xuất phomat : - Sản xuất phomat khối - Tách đường - Ủ chín phomat Muối phomat Sản xuất vitamin 2. Lên men butyric :a/ Khái niệm : Quá trình lên men butyric là quá trình phân giải yếm khí đường cho axit butyric và một số sản phẩm phụ dưới tác dụng của vi sinh vật. b/ Vi sinh vật lên men butyric : - Clostridium saccharobutyricum - Clostridium pasteurianum - Clostridium butyricum. c/ Ứng dụng để sản xuất axit butyric Ưu điểm : +Trong công nghiệp được dùng làm hương liệu ở dạng ester như butyrat metan có mùi táo, butyrat etan có mùi lê, butyrat amin có mùi dứa… đây là những chất thơm dùng để sản xuất bánh kẹo, nước hoa, nước giải khát… Nhược điểm : + Cản trở sự hoạt động của nấm men, gây mùi khó chịu và cay trong sản phẩm sữa, làm hư hỏng đồ hộp rau quả và thịt cá. +Trong thực tế muốn tiêu diệt vi khuẩn này rất khó vì nó có mặt ở bất kỳ nguyên liệu thực phẩm nào bào tử của nó lại rất bền. 3. Lên men acetone – butanol : a/ Khái niệm : Sự lên men axeton-butanol là quá trình lên men phức tạp, thực hiện trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt. b/ Vi sinh vật lên men : Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharobutylicum,… c/ Ứng dụng của sự lên men axeton - butanol Axeton được làm dung môi trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là sản xuất thuốc nổ. Butanol dùng để sản xuất sơn các loại trong công nghiệp xe hơi, máy bay, điều chế butadien để sản xuất cao su tổng hợp… 2. Lên men axetat a/ Định nghĩa 1.Qua hình thức lên men kị khí: Quá trình lên men axetat là quá trình lên men kị khí của một số Clostridium (như C.acetium, C.thermoaceticum, C.aceti,…) có khả năng chuyển hidro của cơ chất không những đến các chất nhận hidro hữu cơ mà đến cả CO2 và làm tạo thành axit axetic. Ví dụ: Vi khuẩn ưa ẩm C.aceti có khả năng tổng hợp axetat từ CO2 và H2 : 4H2 + 2CO2 à CH3COOH + 2H2O 2.Qua hình thức lên men hiếu khí: Quá trình lên men axetat là quá trình chuyển hóa rượu thành axit axetic nhờ các vi khuẩn axetic hiếu khí thuộc họ Acetobacter b/ Ứng dụng 1.Sản xuất giấm: hiện nay theo 3 phương pháp khác nhau: ¯Phương pháp lên men chậm: - Phương pháp này chủ yếu sản xuất từ rượu vang, nguyên liệu gồm khoảng 3÷4% rượu và từ 2÷3% axit axetic. - Cách làm : Người ta cho axit axetic trước để tạo điều kiện cho vi khuẩn axetic phát triển, mặt khác ngăn ngừa bị nhiễm các loài vi khuẩn khác. Dịch sau khi được chuẩn bị xong được đổ vào các thùng bằng gỗ và để ngoài không khí. Sau một thời gian trên bề mặt sẽ tạo thành váng chứa nhiều axit axetic. Vì thế quá trình oxi hoá chậm và chỉ kết thúc sau vài tuần. Sau khi kiểm tra nồng độ rượu còn từ 0,3÷0,5 thì lấy giấm ra và cho dịch mới vào. Không nên để quá lâu chất lượng giấm sẽ giảm nhanh do quá trình oxi hoá axit axetic thành CO2 và H2O. Bằng phương pháp này giấm thu được có nồng độ axit axetic từ 5 đến 6%. Nếu muốn bảo quản giấm được lâu phải thanh trùng. ¯ Phương pháp lên men nhanh: - Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là làm tăng tiết diện tiếp xúc với không khí làm cho quá trình lên men xảy ra nhanh hơn. - Cách làm: Dịch được pha chế như sau: Trong 100 lít rượu 10% cồn cần 500g đường glucose hay tinh bột đã thuỷ phân, 25g superphotphat, 25g sunfat amon, 0,9g K2CO3, axit axetic 3kg. Dịch được đổ từ trên xuống và chảy đều trên các màng xốp đã cấy sẵn vi sinh vật. Ở đây sẽ xảy ra quá trình oxy hoá rượu thành axit axetic nhờ oxi không khí đi từ dưới lên. Có thể tiến hành lên men lại bằng cách cho dịch giấm thu được qua màng xốp nhiều lần để nồng độ rượu còn khoảng 0,3 đến 0,5% là được. Dịch giấm thu được thường có nồng độ khoảng 9% axit axetic, sau đó đem lọc và thanh trùng. ¯ Phương pháp chìm: - Người ta tạo ra các nồi lên men đặc biệt ( gọi là acetato) và cho lên men có thổi khí nhỏ một dịch lên men( chứa 6-12% etanol và 1-3% axit acetic). Qúa trình oxi hóa hoàn thành sau 40-96 giờ,sản phẩm chứa 7-13% axit axetic. 2. Một số ứng dụng khác của vi khuẩn axetic: - Ngoài khả năng chuyển hoá cồn thành axit axetic, một số vi khuẩn axetic còn có khả năng oxy hoá một số chất khác. Một số sản phẩm quan trọng như: axit gluconic, sorbose… 3. Lên men xenlulozo a/ Định nghĩa 1. Theo hình thức lên men kị khí: - Lên men xenluloxơ là quá trình phân giải xenlulozơ kị khí nhờ các vi khuẩn kị khí ( như C.thermocellum, C.omelianskii…).Ngoài ra , trong dạ dày cỏ của trâu bò và các động vật nhai lại khác còn có một nhóm vi sinh vật đặc biệt có khả năng phân giải xenlulozơ mạnh mẽ trong điều kiện kị khí đủ như: + Về khu hệ vi khuẩn: Ÿ Cầu khuẩn :Ruminococcus flavefeciens, R.albus… Ÿ Trực khuẩn : kị khí không sinh bào tử (Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens ,Cillobacterium cellulosovens), kị khí sinh bào tử( Clostridium cellobioparum, C.locheadii và C.longisporum). + Động vật nguyên sinh :các loài trong các chi Ophryoscolex, Isotrich, Dasytricha… 2. Theo hình thức lên men hiếu khí: - Là quá trình phân hủy cenlulose ở điều kiện hiếu khí dưới tác dụng của những vi sinh vật có hoạt tính enzyme cenlulase( như vi khuẩn nhầy Mixococcus Hutchínonii) . Đầu tiên, chúng thủy phân những chất này thành đường và axit, sau đó oxy hóa tiếp thành những sản phẩm thủy phân. b/ Ứng dụng - Qúa trình phân giải cenlulose rất phổ biến trong tự nhiên và có một ý nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc nâng cao độ phì nhiêu của đất cũng như vào việc tiêu hóa thức ăn ở các loài động vật nhai lại. - Tuy nhiên,Vi sinh vật phân giải cenlulose có thể làm giảm chất lượng đáng kể các nguồn nguyên liệu thực phẩm là thực vật (rau quả). Thủy phân xenlulozơ dẫn tới phá hỏng thành tế bào của thịt quả và làm cho vi sinh vật lọt vào bên trong các tổ chức mô thực vật.