Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng alcalase theo phương pháp mặt đáp ứng

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 129 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) BẰNG ALCALASE THEO PHƯƠNG PHÁP MẶT ĐÁP ỨNG OPTIMIZATION OF PROTEIN HYDROLYSIS FROM WHITE SHRIMP HEAD (Penaeus vannamei) BY ALCALASE ADOPTING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY Nguyễn Thị Ngọc Hoài1, Ngô Thị Hoài Dương2, Ngô Đăng Nghĩa3 Ngày nhận bài: 25/12/2012; Ngày phản biện thông qua: 06/5/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013 TÓM TẮT Nghiên cứu thu hồi protein từ đầu tôm bằng enzyme nhằ m nâng cao hiệ u quả sử dụ ng nguyên liệ u tôm, gó p phầ n hạ n chế thấ t thoá t tà i nguyên và giả m thiể u ô nhiễ m môi trườ ng. Thực hiện tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ đầu tôm bằng Alcalase theo phương pháp mặt đáp ứng, sử dụng mô hình composit. Tối ưu 3 nhân tố tỉ lệ alcalase (0,1-0,5%), nhiệt độ thủy phân (50-70oC), thời gian thủy phân (2-8 giờ), với hai hàm mục tiêu là hàm lượng protein hòa tan và nồng độ DPPH. bị khử. Kết quả thu được thông số tối ưu ở nồng độ Alcalase là 0,382%, nhiệt độ thủy phân là 62oC, thời gian thủy phân là 2 giờ. Dịch protein thu được có hàm lượng protein hòa tan là 2401,4±0,75mg/130ml, khả năng khử gốc tự do 45,7±3,09 µM/mg protein hòa tan. Dịch protein thu được có chất lượng tốt, hàm lượng protein hòa tan cao, đặc biệt là có khả năng chống oxy hóa tốt, trong dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng có chứa hầu hết các loại axit amin không thay thế và chứa các loại acid béo không no nên có thể ứng dụng vào các mục đích như làm thực phẩm chức năng cho người. Từ khóa: đầu tôm, alcalase, chống oxy hóa ABSTRACT Study on recovery of protein from shrimp waste by enzyme aimed to improve the effi ciency of using the raw material, to reduce the loss in processing and to limit the environment pollution. The process of hydrolysis of protein from the shrimp head by alcalase enzyme was optimized according to method of response surface, using composite model. Three factors chosen were alcalase:subtrate ratio (0.1-0.5%), hydrolysis temperature (50-700C), incubation time (2-4h) with the two response variables that were solube protein concentration and reduced DPPH concentration. The results shown that the optimal area was correspond to alcalase:subtrate ratio of 0.38%, temperature of 620C and incubation time of 2 hours, according to solube protein concentration of 2401.4 ± 0.75 mg/130ml hydrolysate and reducing ability of 45.7 ± 3.09mM/mg of solube protein. The product obtained had good quality, rich of solube protein, especially high antioxidant ability. Besides, with the essential amino acids and unsaturated fatty acids included, the protein hydrolysate could be used as functional food for human. Key word: shrimp head, alcalase, antioxidant 1 Nguyễn Thị Ngọc Hoài: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang 2 ThS. Ngô Thị Hoài Dương: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang 3 PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa: Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Phế liệu tôm là những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tôm bao gồm: đầu, vỏ và đuôi tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến màu. Tùy thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể chiếm 60% khối lượng tôm nguyên liệu. Đối với tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9% khối lượng tôm nguyên liệu, như vậy tổng lượng phế liệu đầu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 130 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG vỏ tôm thẻ chiếm 37% khối lượng tôm nguyên liệu. Theo Shahidi et al,1999, phế liệu tôm chiếm 35-40% so với lượng nguyên liệu ban đầu còn trong phần phế liệu thì đầu tôm chiếm 71,4%, vỏ chiếm 28,6% và có thể đặt ra vấn đề là chúng sẽ hư hỏng và gây vấn nạn về môi trường. Do đó việc giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng chính là một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thủy sản đồng thời làm giảm ô nhiễm môi trường. Trong phế liệu tôm có rất nhiều thành phần có giá trị như chitin, protein, astaxanthin và khoáng hữu cơ. Tuy nhiên, hiện nay lượng phế liệu này chủ yếu được sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất chitin. Các qui trình sản xuất chitin đang sử dụng là các qui trình hóa học và chỉ tập trung thu hồi chitin mà không thu hồi các thành phần có giá trị khác là protein. Do đó, việc nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân đầu tôm bằng enzyme thương mại Alcalase là cần thiết, tận dụng được nguồn protein lớn vào một số ứng dụng hữu ích như làm thực phẩm chức năng cho con người, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dụng là phương pháp hàm đáp ứng bề mặt - thiết kế có cấu trúc tâm (RSM-CCD). Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích nhiều biến phương trình. RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng. Người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian - thời gian ngẫu nhiên cho những biến kích thích. Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi). Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của hàm mục tiêu. Những mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn các biến kích thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số. Những biến đầu vào Xi (i = 1, ,n) cũng được gọi là những biến cơ sở. Chúng được đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê µj (j = 1,,p) (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, cơ hội chuẩn hóa). Trong trường hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian - thời gian. Việc điều chỉnh mục tiêu phải dựa trên một cơ sở của những số liệu thí nghiệm (thí nghiệm vật lý hay số học) và một hệ mét cho việc tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra được các thông số Xk. Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong, một mặt phẳng hoặc một mặt phẳng gia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng. II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên vật liệu Đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu. Đầu tôm được lấy từ nguyên liệu tôm thẻ chân trắng chế biến tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa. Nguyên liệu sau khi lấy được vận chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt có bảo quản nước đá, nhiệt độ < 50C về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo trong thời gian 5 phút. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, được bao gói và mang đi bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -200C tại phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường. Chế phẩm enzyme protease Alcalase thương mại của hãng Novozyme, được chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷100C, điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase là AF 2,4 L, pH = 8, nhiệt độ: 50 ÷ 60oC (122 ÷ 140oF). Các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA). 2. Phương pháp nghiên cứu Đầu tôm đã được bảo quản đông ở -200C, được rã đông qua đêm ở 40C, bổ sung thêm nước với tỷ lệ 1:1, gia nhiệt ở 900C trong 15 phút, sau đó làm nguội nhanh và bổ sung enzyme, được đưa đi thủy phân, sau khi thủy phân xong, lấy mẫu ra bất hoạt enzym ở 900C trong 10 phút. Tách lấy riêng phần dịch và bã, phần dịch thu được mang đi ly tâm ở 6000 vòng/phút, 40C, 15 phút. Xác định hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân và khả năng khử gốc tự do của dịch thủy phân. Chọn được chế độ xử lý nguyên liệu thích hợp nhờ tối ưu hóa quá trình thủy phân đầu tôm theo mô hình Composit. - Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu: phương pháp Biuret theo Gornall và cộng sự (1948). - Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thuỷ phân thu được bằng test kiểm tra khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH theo quy trình của Huynh và cộng sự (2010). - Phân tích thành phần acid amin và acid béo theo phương pháp GC (gas chromatography). Thiết kế thí nghiệm: Bố trí thí nghiệm theo Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 131 phương pháp mặt đáp ứng (Central Composite Design (CCD)), bao gồm 20 thí nghiệm, trong đó có 8 thí nghiệm nhân tố, 6 thí nghiệm ở tâm, và 6 thí nghiệm xung quanh trục. Kết quả của 20 thí nghiệm này là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các giá trị biên và giá trị trung tâm của các biến độc lập được biểu diễn ở bảng 1. Bảng 1. Giá trị các yếu tố và mức yếu tố cho phân thích mặt đáp ứng Mức yếu tố Biến độc lập Tỉ lệ enzyme (%)(A) Nhiệt độ (oC)(B) Thời gian (giờ)(C) -1 0,1 50 2 0 0,3 60 5 +1 0,5 70 8 Các yếu tố cố định: Tỷ lệ nước/ nguyên liệu= 1/1, pH tự nhiên = 6,5 Hàm mục tiêu: Hàm lượng protein hòa tan (mg protein hòa tan/ 130ml dịch) (Y1) càng cao càng tốt, tìm giá trị cực đại cho Y1 Nồng độ DPPH bị khử (µM/ mg protein hòa tan) (Y2) càng nhiều càng tốt, tìm giá trị cực đại cho Y2, A, B, C là biến thực. Kết quả thu được ở Bảng 2 được xử lý bằng phần mềm Design Expert 7.01 (DX7), thu được mặt đáp ứng của các biến độc lập. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Kết quả thủy phân đầu tôm bằng Alcalase khi thực hiện thí nghiệm theo thiết kế RSM-CCD được thể hiện ở bảng 2, kết quả này được nhập vào phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành phân tích thu được mô hình hồi quy. Bảng 2. Kết quả thí nghiệm theo quy hoạch bậc hai composite N Tỉ lệ en-zyme (%) Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Hàm lượng protein hòa tan(mg/130ml dịch thủy phân) Nồng độ DPPD bị khử (µM/mg protein hòa tan) 1 0,1 50 2 1779,52 36,77141 2 0,5 50 2 2043,053 40,46754 3 0,1 70 2 2160,828 40,97218 4 0,5 70 2 2019,116 44,2455 5 0,1 50 8 1658,287 35,6765 6 0,5 50 8 2061,043 40,4495 7 0,1 70 8 1944,834 36,6672 8 0,5 70 8 2047,932 39,1086 9 0,3 60 5 2412,454 42,6634 10 0,3 60 5 2455,766 40,8816 11 0,3 60 5 2465,075 42,1588 12 0,3 60 5 2611,056 40,3549 13 0,04 60 5 1805,1 26,3319 14 0,56 60 5 2317,842 34,3788 15 0,3 46,84 5 2135,515 21,9675 16 0,3 73,16 5 2326,128 25,78636 17 0,3 60 1,05 2758,93 36,0591 18 0,3 60 8,95 2736,98 33,28773 19 0,3 60 5 2597,343 33,7869 20 0,3 60 5 2703,524 31,1505 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 132 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 1. Ảnh hưởng của nhân tố tỉ lệ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan Hàm hồi quy: Hàm lượng protein hòa tan = 2590,47+113,61A+ 76,91B−88,11*A*B−338,80A2 −233,03B2(1) Phương trình (1) có p< 0,001 cho thấy mô hình tương thích với thực nghiệm. Có R2=96,32% có nghĩa là nó áp dụng đúng 96,32% trường hợp thực nghiệm, mô hình này phản ánh quan hệ giữa các biến số ở mức độ tin cậy là 99% vì giá trị p của phương trình < 0,0001. Giá trị p của các biến cũng nhỏ pA= 0,0014, pB= 0,013, pA*B= 0,0162, p của A 2, B2 < 0,0001. Như vậy sự có mặt của các yếu tố tỉ lệ enzyme A, nhiệt độ B, A*B. A2, B2 đều có ý nghĩa. Khi xem xét phân tích đơn giản hơn với các biến số bậc một và hai nhưng vắng mặt tương tác giữa chúng, kết quả cũng thu được các phương trình hồi qui không tương thích thực nghiệm. Vì vậy phương trình được chấp nhận. Thu được đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổi của tỷ lệ enzyme và nhiệt độ thủy phân như sau: Hình 1. Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổi của tỉ lệ Alcalase và nhiệt độ thủy phân Nhìn vào phương trình hồi qui (1) có thể thấy rằng đây là mặt elliptic paraboloic với đỉnh quay lên nên có giá trị cực đại. Vì các số liệu thực nghiệm sử dụng thiết lập phương trình của mặt cong này cho thấy rằng, nếu tăng tỉ lệ enzyme, tăng nhiệt độ thì hàm lượng protein hòa tan sẽ tăng dần, đạt cực đại, sau đó giảm xuống, nên chắc chắn mặt đáp ứng của (1) sẽ có điểm cực đại, đó cũng chính là điểm tối ưu mà chúng ta đang quan tâm. Nhìn vào giá trị các hệ số của phương trình hồi quy ta dễ nhận ra một điều là hệ số của A2, B2 là lớn hơn so với các hệ số khác và mang dấu âm thể hiện ảnh hưởng đáng kể của chúng đến quá trình thủy phân. Hệ số của tỉ lệ enzyme và nhiệt độ thủy phân mang dấu dương chứng tỏ việc tăng tỉ lệ enzyme hoặc nhiệt độ thủy phân thì hàm lượng protein hòa tan thu được là tỷ lệ thuận. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là hệ số của A*B mang dấu âm, điều này có nghĩa là, khi tăng hoặc giảm đồng thời tỉ lệ enzyme và nhiệt độ thủy phân thì tương tác giữa hai yếu tố này tỷ lệ nghịch với hàm lượng protein hòa tan tạo thành. Trên cơ sở số liệu thực nghiệm, khi tăng tỉ lệ enzyme thì hàm lượng protein hòa tan tạo thành sẽ tăng, tuy nhiên mức độ tăng của hàm lượng protein tạo thành chậm dần khi tỉ lệ enzyme tăng lên cao, hệ số tỷ lệ giữa hàm lượng protein hòa tan và tỉ lệ enzyme A chỉ thỏa mãn trong khoảng ta đã chọn. Khi tăng A, B đến một mức nào đó, hàm lượng protein hòa tan sẽ không tăng nữa mặc dù điều kiện thủy phân không thay đổi. Phần mềm đã đề nghị cho ta điểm tối ưu cho hàm mục tiêu như hình 1, hàm lượng protein hòa tan có giá trị cao nhất ở tỉ lệ enzyme trong khoảng 0,25 - 0,4%, nhiệt độ thủy phân trong khoảng 58 - 650C, thời gian thủy phân khoảng 2 giờ. 2. Ảnh hưởng của nhân tố tỉ lệ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân đến khả năng khử gốc tự do Hàm hồi quy: Khả năng khử gốc tự do DPPH (Y2) = 364,59+21,61A +11,04*B −12,39*C − 10,41*B*C − 42,71B2 + 19,62C2(2) Phương trình (2) có p<0,0001 cho thấy mô hình tương thích với thực nghiệm. Có R2=93,92% có nghĩa là nó áp dụng đúng 93,92% trường hợp thực nghiệm, mô hình này phản ánh quan hệ giữa các biến số ở mức độ tin cậy là 99% vì giá trị p của phương trình < 0,0001. Giá trị p của các biến cũng nhỏ pA=0,0003, pB=0,0183, pC= 0,0047, pB*C=0,0104, p của B2<0,0001, C2 =0,0028. Như vậy sự có mặt của các yếu tố tỉ lệ enzyme A, nhiệt độ B, thời gian C, B*C. B2, C2 đều có ý nghĩa. Khi xem xét phân tích đơn giản hơn với các biến số bậc một và hai nhưng vắng mặt tương tác giữa chúng, kết quả cũng thu được các phương trình hồi quy nhưng không tương Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 133 thích thực nghiệm (p>0,05). Vì vậy phương trình được chấp nhận là phương trình (2). Nhìn vào giá trị các hệ số của phương trình hồi quy ta dễ nhận ra một điều là hệ số của B2 là lớn nhất so với các hệ số khác và mang dấu âm thể hiện ảnh hưởng đáng kể của nhiệt độ thủy phân đến quá trình thủy phân. Hệ số của tỷ lệ enzyme và hệ số nhiệt độ thủy phân cũng khá lớn và mang dấu dương chứng tỏ việc tăng tỉ lệ enzyme hoặc nhiệt độ thủy phân thì khả năng khử gốc tự do DPPH. của dịch thủy phân là tỷ lệ thuận. Trong khi đó, hệ số thời gian thủy phân là 12,39, mang dấu âm chứng tỏ khi kéo dài thời gian thủy phân thì khả băng bắt gốc tự do của dịch thủy phân có xu hướng giảm. Điều đáng lưu ý là hệ số của B*C mang dấu âm, điều này có nghĩa là, khi tăng hoặc giảm đồng thời nhiệt độ và thời gian thủy phân thì tương tác giữa hai yếu tố này tỷ lệ nghịch với khả năng khử gốc tự do của dịch thủy phân, mô hình biểu diễn mối quan hệ này là hình yên ngựa. Hình 2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ Alcalase và nhiệt độ thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân Đồ thị trên có dạng yên ngựa, có miền giá trị cực đại, nhìn vào đồ thị contour và 3D, dễ dàng thấy rằng, khả năng khử gốc tự do của dịch thủy phân đạt giá trị cao trong khoảng tỉ lệ enzyme từ 0,3 - 0,4%, nhiệt độ thủy phân trong khoảng 60 - 650C, thời gian thủy phân là 2 giờ. Kết hợp cả hai hàm mục tiêu ta thu được thông số tối ưu là tỉ lệ enzyme là 0,382%, nhiệt độ thủy phân là 62oC, thời gian thủy phân là 2 giờ. Kết quả thu được dịch thủy phân có chứa hàm lượng protein hòa tan khá cao (18,472g/l), khả năng khử gốc tự do của dịch thủy phân thu được là 45,7µM/mg protein hòa tan. 3. Kết quả thành phần acid amin và acid béo Hình 3. Thành phần phần trăm các axit amin có trong dịch thủy phân ở điều kiện tối ưu Từ hình 3 cho thấy, trong dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng có chứa hầu hết các loại axit amin thiết yếu. Trong đó, axit glutamic chiếm tỷ lệ cao nhất với 11,07% so với tổng các axit amin. Tiếp đó là các axit amin khác cũng chiếm tỷ lệ khá cao như: leucine (8,28%), axit aspartic (8,19%), lysine (7,89%), alanine (7,11%), proline (6,75%), glycine (6,12%)... Như vậy, dịch thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng có thành phần dinh dưỡng khá cao và đầy đủ axit amin không thay thế. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 134 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hình 4. Thành phần phần trăm của các axit béo có trong dịch thủy phân ở điều kiện tối ưu Kết quả trong hình 4 cho thấy dịch thủy phân chứa nhiều axit béo không no quan trọng là axit alpha linoleic (ALA) 18:3n-3 (3.37%), axit eicosapentaenoic (EPA) 20:5n-3 (2.27%), axit docosahexaenoic (DHA) 22:6n-3 (2.88%). Tổng các omega 3 là 10.9% và tổng các omega 6 là 21.8% cho thấy tỷ lệ hai chất này là 1:2. Mặc dù hàm lượng acid béo trong dịch thủy phân không cao nhưng sự có mặt của các acid béo không bão hòa có vai trò quan trọng. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Sản phẩm protein thu được theo chế độ thủy phân tối ưu có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của dịch thủy phân cao, sản phẩm thu được có chứa nhiều các acid béo không no và đầy đủ các acid amin cần thiết cho cơ thể, thích hợp cho việc bổ sung vào thực phẩm con người. Kết quả thí nghiệm tối ưu theo mô hình composite cho được kết quả các thông số tỉ lệ enzyme, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân tối ưu là 0,368%, 62oC và 2 giờ. Sản phẩm thủy phân protein hòa tan có khả năng chống oxy hóa, do đó cần nghiên cứu sâu hơn khả năng chống oxy hóa của dịch protein hòa tan. Cũng cần có các nghiên cứu sâu hơn về xác định chiều dài của các đoạn peptid, peptid nào có khả năng chống oxy hóa, định danh peptid. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fereidoon, S., 1999. Food applications of chitin and chitosans. Trends in Food Science and Technology, 10, 37-51. 2. Gornall, A., G., Bardawill, C., T., David, M., 1948. Determination of serum proteins by means of the Biuret reaction, Department of Pathological Chemistry, University of Toronto, Toronto Canada. 3. Huynh, N., D., B., Toshiaki, O., Yoshihiro, O., 2010. Antioxidative activities of hydrophilic extracts prepared from the fruiting body and spent culture medium of Flammulina velutipes. Bioresour Technology 101, 15, 6248-6255. 4. Jens, A., 1979. Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzenesulfonic acid. Agric food Chemistry, 6, 1256-1262. 5. Lijun, Y., Mouming, Z., Chun, C., Haifeng, Z., Bao, Y., 2009. Effect of degree of hydrolysis on the antioxidant activity of loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein hydrolysates. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 10, 235-240. 6. Nielsen, P., M., Petersen, D., and Dambmann, C., 2001. Improve Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science, 66, 5, 642-646. 7. Satya, S., D., Krushna, C., D., 2011. Antioxidative activity of protein hydrolysate produced by alcalase hydrosis from shrimp waste (Penaeus monodon and Penaeus indicus). Association of Food Scientists & Technologists (India), Deparment of Fish Processing Technology, Faculty of Fishery Sciences 5, Original article, 1-9. 8. Satya, S., D., Krushna, C., D., 2011. Optimization of the production of shrimp waste protein hydrolysate using microbial proteases adopting response surface methodology. Association of Food Scientists & Technologists (India), Deparment of Fish Processing Technology, Faculty of Fishery Sciences 5, Original article, 1-9.