Tối ưu hóa quá trình thủy phân chitosan và đánh giá khả năng kháng E.coli của chitosan hòa tan trong nước - Lê Thanh Long

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 20 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITOSAN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI CỦA CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC OPTIMIZATION OF CHITOSAN HYDROLYSIS FOR MAKING WATER-SOLUBLE CHITOSAN AND ITS ANTIBACTERIAL ABILITY ON E.COLI Lê Thanh Long1, Nguyễn Thị Phương Thảo2, Trang Sĩ Trung3, Vũ Ngọc Bội4 Ngày nhận bài: 23/11/2012; Ngày phản biện thông qua: 28/3/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013 TÓM TẮT Chitosan hòa tan trong nước, sản phẩm thủy phân từ chitosan, với các đặc tính sinh học đặc biệt đang là đối tượng được quan tâm trong lĩnh vực nông nghiệp nhằm bảo quản thực phẩm và bảo vệ cây trồng. Quá trình tối ưu hóa điều kiện thủy phân tạo chitosan hòa tan trong nước sử dụng tác nhân hydrogen peroxide (H2O2) đã được nghiên cứu. Phương pháp mặt phẳng đáp ứng được sử dụng để biểu diễn mối tương quan giữa hiệu suất thu hồi chitosan hòa tan trong nước và các yếu tố ảnh hưởng (nồng độ H2O2, thời gian và nhiệt độ phản ứng) và tối ưu hóa điều kiện thủy phân. Điều kiện thủy phân thu hồi lượng chitosan hòa tan trong nước nhiều nhất: nồng độ H2O2 5,4%, nhiệt độ phản ứng là 47,1oC và thời gian phản ứng 3,4 h, với tỷ lệ thu hồi đạt 87,2% và khối lượng phân tử trung bình 45 kDa. Thông qua vòng kháng khuẩn trên môi trường đặc hiệu EMB, sản phẩm chitosan hòa tan trong nước thể hiện khả năng kháng E.coli tốt hơn đáng kể so với chitosan thô. Kết quả nghiên cứu chỉ ra tiềm năng ứng dụng chitosan tan trong nước như một tác nhân có tính kháng khuẩn cao. Từ khóa: chitosan hòa tan trong nước; thủy phân chitosan; hydrogen peroxide; tối ưu hóa ABSTRACT Water-soluble chitosan, the product of chitosan hydrolysis process, with particular biological characteristics, have been particularly used in the fi elds of food storage and plant protection. Hydrogen peroxide was used to optimally degrade the crude chitosan into water-soluble chitosan. A mathematical model between independent factors (H 2 O 2 level, time and temperature) and the recovery of water-soluble chitosan was constructed, and to optimize the degradation conditions using response surface methodology. The optimal conditions to obtain the highest recovery of chitosan were 5,4% of H 2 O 2 level, 47,1 oC of temperature and 3,4 h of time, with predicted recovery of 87,2% and corresponded to a molecular weight of about 45 kDa. By determination of inhibition zone diameter, water-soluble chitosan showed signifi cantly higher inhibition capacities against E.coli than crude chitosan without degradation treatment. The result indicated the high potential of water soluble chitosan as antibacterial agent. Key words: water-soluble chitosan; chitosan hydrolysis; hydrogen peroxide; optimization 1 ThS. Lê Thanh Long, 2Nguyễn Thị Phương Thảo: Trường Đại học Nông - Lâm Huế 3 PGS.TS. Trang Sĩ Trung, 4 TS. Vũ Ngọc Bội: Trường Đại học Nha Trang Nồng độ (mg/ml) I. ĐẶT VẤN ĐỀ Mặc dù được biết đến như là một polyme sinh học không độc hại với nhiều đặc tính quan trọng, nhưng do khả năng hòa tan kém (chỉ tan trong môi trường acid) đồng thời khi tan tạo ra dung dịch có độ nhớt cao, do đó chitosan khó sử dụng trong thực tế. Khác với chitosan, sản phẩm thủy phân từ chitosan có thể hòa tan trong nước do mạch phân tử ngắn, khối lượng phân tử thấp và có mặt của các nhóm NH2 tự do trong các đơn vị D-glucosamine. Bên cạnh đó, các sản phẩm thủy phân chitosan này thường có hoạt tính sinh học (kháng nấm, kháng khuẩn, tăng hệ miễn dịch) cao hơn so với chitosan ban đầu. Chính các đặc điểm khác biệt này mà có nhiều nghiên cứu theo hướng ứng dụng chitosan ở dạng hòa tan trong nước đặc biệt trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm và bảo vệ cây trồng (Qin và Du, 2002; Kim và Rajapakse, 2005; Abdelbasset và Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 21 cộng sự, 2010; Wenshui và cộng sự, 2011). Để tạo ra chitosan hòa tan trong nước người ta tiến hành thủy phân chitosan bằng các tác nhân hóa học, vật lý và enzyme, trong đó phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến hơn ở quy mô công nghiệp. Quá trình thủy phân chitosan bằng enzyme sẽ giảm thiểu khả năng biến đổi hóa học không có lợi và tăng hoạt tính sinh học của sản phẩm. Tuy nhiên do tính đặc hiệu phản ứng cao (cơ chất chitosan có độ tinh khiết cao, cấu trúc phù hợp), chi phí sử dụng enzyme quá đắt nên khó ứng dụng vào thực tế sản xuất qui mô lớn (Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2006; Xia và cộng sự, 2008; Lê Thanh Long và cộng sự, 2011). Việc sử dụng tác nhân hydrogen peoxide (H2O2) đã được một số tác giả nước ngoài lựa chọn do khả năng cắt mạch thân thiện và không để lại tạp chất trong sản phẩm thủy phân mặc dù mức độ loại bỏ gốc NH2 trong các mắt xích D-glucosamine cần phải được khống chế thích hợp dựa vào các điều kiện của quá trình cắt mạch (Qin và cộng sự, 2002; Feng và cộng sự, 2004). Tuy nhiên, việc đưa ra một điều kiện tối ưu thủy phân tạo chitosan hòa tan trong nước từ chitosan thô vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện thủy phân tạo chitosan hòa tan trong nước từ chitosan thô bằng tác nhân H2O2 và đánh giá khả năng kháng E.coli của sản phẩm thủy phân ở điều kiện in vitro. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu và hóa chất Chitosan thô được cung cấp bởi Công ty TNHH Đông Tiến, Tp Hồ Chí Minh có dạng bột, màu trắng ngà; độ deacetyl (DD): 85-90%; Nitơ tổng số: 5,84%; tro toàn phần: 0,09%; độ tan: >97 %; cặn tro không tan trong HCl: 0,1%. Chủng E.coli được cung cấp từ phòng thí nghiệm Khoa Vi sinh, Trường Đại học Y dược, Đại học Huế. Môi trường EMB, EC Broth đặc hiệu nuôi cấy E.coli được cung cấp từ Merck. Các hóa chất thông thường khác (H2O2 30%, acid acetic tinh khiết, cồn 99,5%) đạt tiêu chuẩn phân tích. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Phương pháp chuẩn bị chitosan tinh sạch từ chitosan thô Chitosan thô (1-2g) cho vào 100ml acid acetic 2%, khuấy trộn đều trên máy khuấy từ và tiếp tục đưa vào máy lắc liên tục ở nhiệt độ phòng trong 24h. Dung dịch sau khi lắc lọc bỏ tạp chất và cặn không tan, được điều chỉnh pH đến 7 bằng dung dịch NaOH 4% thu kết tủa dạng bông xốp, màu trắng ngà. Tiến hành lọc, rửa kết tủa nhiều lần bằng nước cất và sấy khô ở 50oC, nghiền thu được chitosan tinh sạch ở dạng bột. Dung dịch chitosan tinh sạch với các nồng độ (0,5%; 1%; 1,5%; 2%) dùng trong bước kháng khuẩn được chuẩn bị bằng cách pha trong trong acid acetic 0,5%, sau đó pH được điều chỉnh đến 6 bằng dung dịch NaOH 4%. 2.2. Phương pháp thu hồi chitosan hòa tan trong nước từ quá trình thủy phân chitosan bằng tác nhân H2O2 1g chitosan tinh sạch cho vào 100ml acid acetic 1%, tiến hành khuấy trộn và lắc liên tục ở nhiệt độ thường trong 24h đến tan hoàn toàn. Dung dịch được nâng dần nhiệt độ đến nhiệt thủy phân yêu cầu trong bể ổn nhiệt, tiếp tục nhỏ từ từ H2O2 30% với thể tích yêu cầu vào bình phản ứng kết hợp khuấy đảo trên máy khuấy từ. Tiếp tục tiến hành lắc hỗn hợp trên máy lắc tốc độ 120 rpm ở nhiệt độ thủy phân trong thời gian yêu cầu. Kết thúc thời gian thủy phân, điều chỉnh pH đến 7 bằng dung dịch NaOH 10%. Tiến hành lọc bỏ phần kết tủa chitosan chưa được cắt mạch bằng máy lọc chân không, bổ sung một lượng ethanol 99,5% gấp đôi thể tích dịch lọc và giữ ở nhiệt độ 2 - 50C ở tủ lạnh trong 12h. Tách kết tủa, lọc và sấy ở 40 - 500C trong thiết bị sấy chân không đến khối lượng không đổi thu được sản phẩm chitosan hòa tan trong nước. 2.3. Đánh giá tính kháng E.coli của chế phẩm chitosan bằng phương pháp khuếch tán trên “giếng thạch” Chủng E.coli từ ống mẫu cấy sang môi trường EMB, ủ ở 44oC trong 24h; tiếp tục cấy chuyền sang môi trường EC Broth, ủ ở 44oC trong 48h thu được dịch tăng sinh E.coli. Sau khi hấp khử trùng, làm nguội đến 40-50oC, 12 ml dung dịch môi trường EMB cho vào mỗi đĩa etri Φ10 cm. Sau 30 phút, tiến hành đục lỗ ở tâm trên đĩa thạch (1 lỗ tương ứng với 1 nồng độ chất kháng) bằng ống kim loại đã khử trùng (đường kính 4 mm) và nhỏ 5 μl môi trường EMB để bịt kín giếng thạch. Cấy 250 ml dịch tăng sinh E.coli vào đĩa đã đục lỗ và dàn đều trên bề mặt thạch, để yên 15 phút tiếp tục cho 25 µl dung dịch chitosan (dung dịch chitosan tinh sạch và chitosan tan trong nước) với các nồng độ vào mỗi giếng. Các đĩa được bao gói và giữ ở 35oC ± 2oC, sau 24h quan sát khả năng kháng và đo đường kính vòng kháng khuẩn bằng thước kẹp điện tử. Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức (1 đối chứng), mỗi công thức là 1 đĩa và lặp lại 3 lần. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 22 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 2.4. Xác định phân tử lượng trung bình chitosan bằng phương pháp đo độ nhớt Chitosan được hòa tan trong hệ dung môi gồm: CH3COOH 0,1M và NaCl 0,2M với các nồng độ giảm dần: 0,2%; 0,1%; 0,05%; 0,025%; 0,0125%. Độ nhớt tương đối ηtđ được xác định theo công thức: ηtđ = t/to với t và to tương ứng là thời gian chảy qua mao quản nhớt kế Ostwald của dung dịch chitosan và dung môi ở nhiệt độ 25oC được duy trì trong bể ổn nhiệt. Mỗi dung dịch được đo lặp lại 3 lần. Giá trị độ nhớt thực η là giới hạn của tỷ số giữa độ nhớt riêng với nồng độ C% (w/v) của dung dịch chitosan khi nồng độ này tiến tới 0 ([η] = lim (ηr/C)) với độ nhớt riêng ηr = ηtđ -1. Độ nhớt thực η được xác định thông qua các hệ số của phương trình hồi qui tuyến tính giữa nồng độ C% và tỷ số (ηr/C) (Vũ Ngọc Ban, 2007). Khối lượng phân tử trung bình (M) của chitosan được xác định theo công thức Mark-Houwink: M = (η/K)1/α; trong đó: K: hằng số độ nhớt; α là giá trị thực nghiệm. Với hệ dung môi CH3COOH 0,1M, NaCl 0,2M; K = 1,81×10 -3 và α = 0,93 (No và cộng sự, 2003). 2.5. Phương pháp xác định quang phổ hấp phụ của sản phẩm chitosan Bột chitosan và KBr được trộn chung và nghiền nhỏ bằng cối thạch anh. Hỗn hợp sau đó được nén thành đĩa và sấy trước khi phân tích. Sử dụng máy đo phổ hồng ngoại FTIR (Vertex 70, Brucker, Đức) tiến hành đo phổ hồng ngoại của các sản phẩm chitosan. 2.6. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Trên cơ sở tham khảo kết quả nghiên cứu của Weska và cộng sự (2007), Du và cộng sự (2009), bố trí thực nghiệm theo phương án kế hoạch trực giao cấp hai với mô hình Box- Behnken với số thí nghiệm là 17 trong đó có 5 thí nghiệm tại tâm phương án (bảng 2). Ba biến độc lập tương ứng với các khoảng khảo sát được ký hiệu: X1, nồng độ H2O2 (%); X2, thời gian thủy phân (h) và X3, nhiệt độ thủy phân (oC) với ba mức biến thiên cho mỗi biến; biến phụ thuộc (hàm mục tiêu) là hiệu suất thu hồi chitosan hòa tan trong nước (%), Y được biểu diễn ở bảng 1. Bảng 1. Mức thí nghiệm của các biến độc lập Các biến độc lập Mức cơ sở (0) Mức trên (+1) Mức dưới (-1) Khoảng biến thiên X1: nồng độ H2O2 (%) 5 6 4 1 X2: thời gian tiến hành (h) 3 4 2 1 X3: nhiệt độ ( oC) 45 60 30 15 Phần mềm Design Expert (Vesion 8.0.3, Stat Aese Inc., Minneapolis, USA) được sử dụng để thiết kế thí nghiệm, phân tích dữ liệu, xây dựng mô hình bậc hai và tối ưu hóa bằng cách phân tích bề mặt đáp ứng. 3. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai một nhân tố ANOVA (Anova single factor) và so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp DUNCAN (Duncan’s Multiple Range Test) trên phần mềm thống kê SAS, phiên bản 9.0. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2, thời gian và nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước Tiến hành bố trí thí nghiệm với miền khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng đã được chọn: nồng độ H2O2 (4 ÷ 6%), nhiệt độ thủy phân (30 ÷ 60oC) và thời gian thủy phân (2 ÷ 4 giờ), mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Bảng ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp hai theo mô hình Box-Behnken và hiệu suất thu hồi chitosan hòa tan trong nước Thí nghiệm Nồng độ H2O2 (%)(X1) Thời gian (h) (X2) Nhiệt độ (oC) (X3) Hiệu suất thu hồi (%) (Y) 1 -1(4) +1(2) 0(45) 43,12 2 +1(6) +1(2) 0(45) 65,23 3 -1(4) -1(4) 0(45) 61,02 4 +1(6) -1(4) 0(45) 84,53 5 -1(4) 0(3) -1(30) 22,70 6 +1(6) 0(3) -1(30) 39,52 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 23 7 -1(4) 0(3) +1(60) 50,75 8 +1(6) 0(3) +1(60) 57,40 9 0(5) -1(2) -1(30) 29,70 10 0(5) +1(4) -1(30) 39,84 11 0(5) -1(2) +1(60) 45,40 12 0(5) +1(4) +1(60) 55,38 13 0(5) 0(3) 0(45) 86,13 14 0(5) 0(3) 0(45) 81,03 15 0(5) 0(3) 0(45) 84,70 16 0(5) 0(3) 0(45) 83,90 17 0(5) 0(3) 0(45) 81,31 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2, thời gian và nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước được biểu diễn bởi các đồ thị 1, 2, 3. Hình 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ H 2 O 2 đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước, thời gian thủy phân ở 3h Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ H 2 O 2 đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước, nhiệt độ thủy phân ở 45oC Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước, ở nồng độ H2O2 5% Kết quả từ các đồ thị mặt phẳng đáp ứng cho thấy các yếu tố đều ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước. Hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước tăng dần theo chiều tăng của nồng độ H2O2 trong khoảng 4 - 6% (hình 1). Tuy nhiên, hiện tượng là khác biệt khi quan sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước. Trong miền khảo sát, khi thời gian được giữ không đổi (hình 1) hoặc khi nồng độ H2O2 được giữ không đổi (hình 3), hiệu suất thu hồi có xu hướng tăng đến một giá trị nhất định theo chiều tăng của nhiệt độ phản ứng sau đó giảm dần. Thời gian phản ứng có ảnh hưởng tương tự nồng độ H2O2 đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước (hình 2). Điều này có thể giải thích là do khi nhiệt độ và nồng độ H2O2 tăng quá cao trong thời gian dài, quá trình thủy phân diễn ra mạnh mẽ và triệt để dẫn đến Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 24 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG sản phẩm tạo ra có kích thước quá bé ảnh hưởng đến khả năng thu hồi sản phẩm bằng phương pháp kết tủa trong môi trường cồn lạnh. 2. Tối ưu hóa quá trình thủy phân chitosan tạo chitosan tan trong nước Từ kết quả thực nghiệm ở bảng 2, sử dụng phần mềm Design Expert tiến hành xử lý và phân tích dữ liệu. Kết quả phân tích phương sai xác định tính tương thích mô hình bậc 2 bề mặt đáp ứng được trình bày ở bảng 3 và phương trình hồi qui tuyến tính bậc 2 mô tả tương quan giữa các yếu tố được chọn trong miền khảo sát với hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước được biểu diễn như sau: Y = 83,41 + 8,64X1 + 7,17X2 + 9,65X3 + 0,35X1X2 - 2,54X1X3 - 0,04X2X3 - 9,96X1 2 - 9,98X2 2 - 30,86X3 2 (*) Với Y: hàm mục tiêu (biến phụ thuộc); X1, X2, X3 tương ứng là các biến độc lập (mã hóa) của nồng độ H2O2, thời gian và nhiệt độ thủy phân. Bảng 3. Phân tích phương sai mô hình bậc hai bề mặt đáp ứng Nguồn Bậc tự do Tổng các bình phương Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị p Mô hình 9 6989,33 776,59 37,71 0,0001 Sai số dư 7 144,15 20,59 Không phù hợp 3 124,77 41,59 8,59 0,03 Sai số thuần 4 19,38 4,84 Tổng 16 7133,47 R2 = 0.9798 ; R2hiệu chỉnh = 0,9538 ; R = 0,9898 Qua bảng phân tích phương sai cho thấy mô hình tuyến tính bậc 2 biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố độc lập đến hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước là phù hợp (pmô hình < 0,03). Sự tương thích của mô hình còn được kiểm tra thông qua giá trị tương quan bội R2 và R2hiệu chỉnh. Số liệu phân tích cho thấy hồi qui bậc 2 có ý nghĩa ở mức 0,9898 (hệ số tương quan bội R = 0,9898). Giá trị R2hiệu chỉnh (0,9538) của phương trình (*) chỉ ra rằng hơn 95% sự thay đổi hiệu suất thu hồi chitosan tan trong nước là do các yếu tố ảnh hưởng, chỉ có khoảng gần 5% không thể giải thích bởi mô hình. Với mục tiêu thu hồi tối đa lượng chitosan tan trong nước, sử dụng công cụ tối ưu hóa của phần mềm Design Expert, kết quả cho thấy: ở nồng độ 5,4% H2O2, nhiệt độ 47,1oC và thời gian 3,4h hiệu suất thu hồi dự đoán theo mô hình đạt 87,2%. Áp dụng điều kiện tối ưu vào thực nghiệm với (3 lần lặp lại), hiệu suất thu hồi được xác định là 85,6 ± 2,5% và không sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với giá trị hiệu suất thu hồi dự đoán. 3. Kết quả xác định khối lượng phân tử trung bình và sơ bộ đánh giá ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến cấu trúc sản phẩm chitosan tan trong nước Tiến hành đo độ nhớt các dung dịch chitosan và chitosan tan trong nước ở các nồng độ giảm dần (0,2-0,0125%) và dung môi (hệ dung môi CH3COOH 0,1M, NaCl 0,2M), kết quả xác định tương quan giữa nồng độ C (x) và độ nhớt thực η (y) của chitosan tinh sạch và sản phẩm chitosan tan trong nước (hình 4) được biểu diễn bởi các phương trình hồi qui tuyến tính (**), (***). y = 0,568x + 1,000 (với R= 0,941) (**) y = 0,248x + 0,361 (với R=0,901) (***) Từ hệ số các phương trình hồi qui, thay các giá trị các giá trị η (khi C → 0) vào công thức M = (η/K)1/α, giá trị khối lượng phân tử trung bình của chitosan tinh sạch và chitosan tan trong nước tương ứng là: 125 kDa và 45 kDa. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm chitosan sau khi cắt mạch đã giảm đáng kể so với chitosan tinh sạch ban đầu. Theo Feng và cộng sự (2004) khi chitosan được thủy phân bằng 10% H2O2 ở 60oC trong 4h, khối lượng phân tử trung bình chitosan sau khi thủy phân là 11 kDa. Sự khác biệt này có thể là do khác về loại chitosan và điều kiện tiến hành thủy phân. Sản phẩm chitosan tan trong nước sau khi thu hồi, tiến hành sấy khô và giữ trong điều kiện cách ẩm trước khi tiến hành đo quang phổ hồng ngoại trên máy quang phổ FT-IR. Phổ hồng ngoại của các loại chitosan được biểu diễn ở hình 5. Từ hình 5 cho thấy tại dải bước sóng 1655 cm-1 đặc trưng cho nhóm amin (-NH2) và tại dãi ĐC 0,5 1% 1,5% 2% ĐC 0,5 1% 1,5% 2% a b c a: chitosan thương mại b: chitosan tinh sạch c: chitosan tan trong nước 22 Hình 4. Sản phẩm chitosan tan trong nước Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 25 bước sóng 3200 ÷ 3500 cm-1 đặc trưng cho nhóm hydroxyl (-OH) của 3 loại chitosan khá tương đồng và quang phổ hấp thụ của các loại chitosan hầu như không có thay đổi đáng kể. Ngoài ra đồ thị không thấy xuất hiện các peak mới trong vùng bước sóng khảo sát. Như vậy có thể khẳng định bước đầu điều kiện thủy phân chưa làm thay đổi cấu trúc phân tử mạch chitosan đáng kể và khá tương đồng với kết quả của Qin và cộng sự (2002) và Feng và cộng sự (2004). Theo Qin và cộng sự (2002), quá trình cắt đứt liên kết β-1-4 glycoside trong mạch chitosan làm giảm khối lượng phân tử diễn ra nhanh chóng trong thời gian đầu, với nồng độ H2O2 (trong môi trường acid HCl) và nhiệt độ càng cao hiện tượng giảm khối lượng càng đáng kể và đi kèm với những thay đổi cấu trúc chitosan như hình thành các nhóm carboxyl và mất gốc NH2. Tuy vậy, chitosan sau khi cắt mạch với khối lượng phân tử trong khoảng 10 - 50 kDa có cấu trúc mạch phân tử hầu như không thay đổi khi quan sát trên máy quang phổ FT-IR và cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR. Hiện tượng thay đổi cấu trúc chỉ xảy ra ở nhiệt độ phản ứng trên 70oC và nồng độ H2O2 cao hơn 5% tương ứng với khối lượng phân tử chitosan thu được nhỏ hơn 3,5 kDa. Tương tự, hiện tượng thay đổi cấu trúc cũng chưa xuất hiện trong mạch chitosan khi cắt mạch với nồng độ H2O2 10% ở 60oC trong 4h khi quan sát qua phổ hồng ngoại và cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (Feng và cộng sự, 2004). 4. Đánh giá khả năng kháng E.coli của chitosan và chitosan hòa tan trong nước Để xem xé t khả năng khá ng E.coli của chitosan và chitosan hòa tan trong nước, tiến hành thử kháng với các nồng độ từ 0,5, 1%, 1,5%, 2% trong môi trường đặc hiệu EMB. Sau 48 giờ, tiến hành đo đường kính vòng kháng khuẩn. Kết quả kháng E.coli của chitosan và chitosan tan trong nước của các mẫu thí nghiệm được trình bày ở hình 6, 7 và 8. Hình 5. Phổ hồng ngoại FT-IR của các loại chitosan Hình 6. Biểu đồ kết quả kháng E.coli của chitosan và chitosan tan trong nước Ghi chú: Các giá trị trung bình đường kính vòng kháng khuẩn (n=3) có cùng chữ cái in thường là không sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Kết quả ở hình 6 cho thấy các dung dịch chitosan và chitosan tan trong nước đều có khả năng kháng E.coli đáng kể (so sánh đối chứng), đường kính vòng kháng khuẩn tăng dần khi tăng nồng độ của chitosan và chitosan Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG tan trong nước. Đối với chitosan, nồng độ 0,5% có khả năng kháng yếu nhất với đường kính vòng kháng khuẩn là 13,42 mm và nồng độ 2% có khả năng kháng mạnh nhất với đường kính vòng kháng là 20,40 mm. Tuy vậy, khả năng kháng E.coli của dung dịch chitosan nồng độ 1% và 1,5% là không sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Đối với chitosan tan trong nước, đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất khi dung dịch chitosan tan trong nước có nồng độ 2% là 32,67 mm và đường kính kháng khuẩn bé nhất là 25,5 mm khi nồng độ chitosan tan trong nước là 0,5%. Khả năng kháng E.coli của dung dịch chitosan tan trong nước ở các nồng độ 1%, 1,5%, 2% không có sai khác có ý nghĩa thống kê. Thông qua đường kính vòng kháng khuẩn trong cùng nồng độ, khả năng kháng E.coli của dung dịch chitosan tan trong nước mạnh hơn đáng kể so với chitosan (gấp 1,6 lần ở nồng độ 0,5% và đến 2,2 lần ở nồng độ 0,5%). Hình 7. Hình ảnh kháng E.coli của dung dịch chitosan Hình 8. Hình ảnh kháng E.coli của dung dịch chitosan tan trong nước Mặc dù khác về phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn, kết quả trên là khá phù hợp với những công bố của Nan và cộng sự (2006) và Yunjian và cộng sự (2009) khi nghiên cứu khả năng kháng E.coli của chitosan và chitosan tan trong nước. Hiệu quả kháng E.coli của chitosan tan trong nước là rất rõ rệt, so với tác nhân chitosan thì hiệu quả kháng E.coli của chitosan tan trong nước là tốt hơn đáng kể. Theo Hui và cộng sự (2004) và Tsai và cộng sự (2004), cơ chế kháng E.coli có thể được giải thích dựa vào tương tác giữa mạch cấu trúc polycation của chitosan với các vùng tích điện âm trên thành tế bào E.coli cấu tạo bởi lớp mỏng peptidoglycan được bao bọc lớp bên ngoài gồm lipoproteins, lipopolysaccharides và phospholipids. Chính tương tác này đã ngăn cản các chất dinh dưỡng thấm qua màng tế bào gây ức chế phát triển vi khuẩn E.coli, thay đổi cấu trúc màng bán thấm gây chết tế bào vi khuẩn. Mặt khác, do có độ nhớt thấp và khả năng hòa tan tốt hơn nên chitosan tan trong nước có các nhóm NH3 + linh động hơn, dễ tác dụng lên các vị trí mang điện tích âm của tế bào vi khuẩn làm tăng khả năng kháng E.coli của chitosan tan trong nước. Đồng thời, khi nồng độ dung dịch tăng lên, mật độ nhóm NH3 + trong một đơn vị thể tích tăng lên, dưới tác dụng liên hợp của nhiều nhóm NH3 + dẫn đến sự ức chế phát triển tế bào E.coli tốt hơn so với dung dịch chitosan. IV. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu cho thấy H2O2 có thể được sử dụng như một tác nhân thủy phân chitosan tạo ra chitosan tan trong nước. Một mô hình toán học sử dụng phương pháp mặt phẳng đáp ứng biểu diễn mối tương quan giữa hiệu suất thu hồi chitosan hòa tan trong nước và các yếu tố ảnh hưởng (nồng độ H2O2, thời gian và nhiệt độ phản ứng) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Vũ Ngọc Ban (2007). Giáo trình thực tập hóa lý. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006). Công nghệ sinh học, tập 3, Enzyme và ứng dụng. NXB Giáo dục. 3. Lê Thanh Long, Nguyễn Bảo Gia, Trang Sĩ Trung (2011). Thủy phân chitosan bằng cellulase cố định trên chitosan và agar gel. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản, 1: 3-11. Tiếng Anh 4. Abdelbasset E. H., Lorne R.A., Ismail E.H., Fouad D., (2010). Chitosan in plant protection. Marine Drugs, 8, 968-987. 5. Hui L., Yumin D., Xiaohui W., Liping S (2004). Chitosan kills bacteria through cell membrane damage. International Journal of Food Microbiology 95: 147-155. 6. Feng T., Yu L., Keao H., Binyuan Z (2004). Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide. Carbohydrate Polymers 57: 31-37. 7. Kim S., Rajapakse N. (2005). Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS). Carbohydrate Polymers 62, 357-368. 8. No H. K., Lee S. H., Park N. Y., Meyers S. P (2003). Comparison of physicochemical, binding, and antibacterial properties of chitosans prepared without and with deproteinization process. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 7659-7663. 9. Nan L., Xi-Guang C., Hyun-Jin P., Chen-Guang L., Cheng-Sheng L., Xiang-Hong M., Le-Jun Y (2006). Effect of MW and concentration of chitosan on antibacterial activity of Escherichia coli. Carbohydrate Polymers 64: 60-65. 10. Qin C., Du Y. (2002). Enzymic preparation of water-soluble chitosan and their antitumor activity. International Journal of Biological Macromolecules 31: 111-117. 11. Qin C., Du Y., Xiao L (2002). Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan. Polymer Degradation and Stability 76: 211-218. 12. Tsai G.J., Zhang S.L., Shieh P.L. (2004). Antimicrobial activity of a low molecular-weight chitosan obtained from cellulase digestion of chitosan. Journal of Food Protection, 67 (2), 396-398. 13. Yunjian D., Yuqiao Z., Shuchao D., Bao Y (2009). Preparation of water-soluble chitosan from shrimp shell and its antibacterial activity. Innovative Food Science and Emerging Technologies 10: 103-107. 14. Xia W., Liu P., Liu J. (2008). Advance in chitosan hydrolysis by non-specifi c cellulase. Bioresource Technology, 99: 6751-6762. 15. Wenshui X., Ping L., Jiali Z., Jie C., (2011). Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides. Food Hydrocolloids 25: 170-179. 16. Weska R.F., Moura J.M., Batista L.M., Rizzi J., Pinto L.A.A (2007). Optimization of deacetylation in the production of chitosan from shrimp wastes: Use of response surface methodology. Journal of Food Engineering 80: 749-753. đã được xây dựng và tương thích với thực nghiệm. Điều kiện tối ưu thu hồi lượng chitosan hòa tan trong nước nhiều nhất: nồng độ H2O2 5,4%, nhiệt độ phản ứng là 47,1oC và thời gian phản ứng 3,4 h, với tỷ lệ thu hồi đạt 87,2% với khối lượng phân tử trung bình 45 kDa. Chitosan tan trong nước có cấu trúc mạch phân tử hầu như không thay đổi đáng kể so với chitosan thô khi quan sát trên máy quang phổ FT-IR. Chitosan hòa tan trong nước thu được thể hiện khả năng kháng E.Coli tốt hơn đáng kể so với chitosan thô trong cùng nồng độ thông qua vòng kháng khuẩn trên môi trường đặc hiệu EMB. Tuy vậy, cơ chế kháng khuẩn của chitosan tan trong nước vẫn chưa rõ ràng, những biến đổi cấu trúc tế bào vi khuẩn trên cơ sở tương tác trực tiếp của chế phẩm cần được tiếp tục nghiên cứu.