Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng tổng hợp Polyguluronat sunfat

82 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TỔNG HỢP POLYGULURONAT SUNFAT DETERMINATION OF THE OPTIMUM CONDITIONS FOR THE SYNTHESIS OF POLYGULURONATE SUNFATE Nguyễn Văn Thành1, Vũ Ngọc Bội2, Trần Thị Thanh Vân3, Nguyễn Đình Thuất3 Ngày nhận bài: 26/01/2016; Ngày phản biện thông qua: 11/8/2016; Ngày duyệt đăng: 10/3/2017 TÓM TẮT Polyguluronat sunfat (PGS) được điều chế từ polyguluronat (PG) thông qua phản ứng với tác nhân sunfat hóa trisulfonat natri amin (N(SO 3 Na) 3 ) được tổng hợp từ sodium bisulfi t (NaHSO 3 ) và nitrit natri (NaNO 2 ) trong nước. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ trao đổi (DS) của polyguluronat sunfat đã được nghiên cứu chi tiết, gồm có nhiệt độ phản ứng và thời gian điều chế tác nhân sunfat hóa, nhiệt độ phản ứng và thời gian tổng hợp polyguluronat sunfat, khối lượng tác nhân sunfat hóa và polyguluronat và pH của phản ứng sunfat hóa. Polyguluronat sunfat với độ trao đổi là 1,85 thu được trong điều kiện tối ưu. Phổ FTIR cho thấy hấp thụ đặc trưng của liên kết ester sunfat tại vị trí 1.241 cm-1 và 796 cm-1. Từ khóa: Alginate, độ trao đổi, Polyguluronate sunfat, tác nhân sunfat hóa ABSTRACT Polyguluronate sunfate (PGS) was prepared by chemical modifi cation of polyguluronate (PG) with trisulfonate sodium amine (N(SO 3 Na) 3 ), which was synthesized by reaction of sodium bisulfi te (NaHSO 3 ) and sodium nitrite (NaNO 2 ) in aqueous solution. The factors that affected the degree of substitution (DS) of polyguluronate sunfate were investigated in detail, including reaction temperature and time of preparing the sunfating agent, reaction temperature and time of synthesizing the polyguluronate sunfate, dosage of sunfating agent and polyguluronate and pH of sunfation reaction medium. A polyguluronate sunfate with DS of 1.85 was obtained under optimal conditions. FTIR spectra showed the typical absorptions of sunfate ester bonds at 1.241cm-1 and 796cm-1. Keywords: Alginate, degree of substitution, Polyguluronate sunfat, Sunfating agent 1 Trường Đại học Kiên Giang 2 Trường Đại học Nha Trang 3 Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Alginat gồm hai co-polyme của liên kết β-(1→4)-D-mannuronic axit (M) và α-(1→4)- L-guluronic axit (G) nằm ở vách thành ngoài của rong nâu [6], chúng là polysacarit tồn tại trong tự nhiên có chứa nhóm carboxyl tạo khả năng có hoạt tính [7]. Có ba phân đoạn polyme khác nhau trong phân tử alginat, cụ thể là phân đoạn polymannuronic acid (PM), polyguluronic acid (PG) và phân đoạn luân phiên của M và G (PMG). Phân đoạn PM và PG có thể được tách bằng pH khi thủy phân alginat [3]. Các dẫn xuất alginat sunfat hóa có tính chất và cấu trúc tương tự như chất kháng đông sản sinh Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 83 - Bước một: điều chế tác nhân sunfat hóa N(SO3Na)3 - Bước hai: tổng hợp polyguluronat sunfat (PGS) trong tế bào gan (heparin), được điều chế và có khả năng kháng đông và hoạt tính kháng đông đã được trình bày [14][17]. Tuy nhiên, thành phần tỷ lệ M/G, trình tự axit hex-uronic của alginat khác nhau đáng kể tùy thuộc vào loài rong, mùa thu hoạch, độ trưởng thành và các phần của rong được sử dụng để chiết [12]. Các dẫn xuất alginat sunfat hóa, giống các polysacarit sunfat hóa tự nhiên nhất, là các đại phân tử không đồng nhất cho thấy sự khác biệt lớn trong cấu trúc và hoạt tính của nó, sự đa dạng này đang làm phát triển các polysacarit thành các dược liệu mới [2][9]. Mục đích của nghiên cứu là xác định các điều kiện phản ứng tổng hợp PGS từ PG để nghiên cứu hoạt tính kháng đông sau này, thông qua phản ứng với tác nhân sunfat hóa hiếm thấy được tổng hợp bởi NaHSO3 và NaNO2 trong nước. Theo truyền thống, tác nhân sunfat hóa được điều chế bởi axit sunfuric, chlorosunfonic axit, clorua sunfuryl, triôxít lưu huỳnh, sulfamic acid và một vài dung môi hữu cơ được sử dụng làm phản ứng trung gian, chẳng hạn như pyridin, dimetyl sulfoxit và formamit [8][15][16]. Các tác nhân này không chỉ có thể làm cho quá trình thủy phân đến cùng hoặc bẻ ngắn mạch PGS trong suốt quá trình phản ứng, mà còn dẫn đến vấn đề ô nhiễm môi trường nghiêm trọng [3]. So với phương pháp truyền thống, toàn bộ phản ứng tổng hợp PGS được thực hiện trong nước, các tác nhân điều chế sunfat hóa được sử dụng trong phản ứng này không độc hại, chi phí thấp và ít ô nhiễm và được thực hiện theo sơ đồ sau: II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Polyguluronat được chúng tôi chuẩn bị ở một nghiên cứu trước [1]; NaHSO3, NaNO2 và các hóa chất khác được sử dụng trong thí nghiệm này là loại tinh khiết được cung cấp bởi Sigma-Aldrich (Mỹ). 2. Điều chế tác nhân sunfat hóa (N(SO3Na)3) Quá trình điều chế thực hiện theo phương pháp của Fan và cộng sự [6] trong bình ba cổ đáy tròn kèm với ống sinh hàn và khuấy từ. Toàn bộ hệ này được đặt trên thiết bị khuấy từ có gia nhiệt. Một lượng định trước NaHSO3 được hòa tan trong 40ml nước cất. Sau đó, lượng NaNO2 chuẩn bị trước được hòa tan trong 10ml nước cất được thêm từng giọt vào bình phản ứng có khuấy từ tại 900C và phản ứng hoàn thành sau 1,5 giờ. Bằng cách này, tác nhân sunfat hóa trisulfonat natri amin (N(SO3Na)3) được thu. 3. Tổng hợp polyguluronat sunfat Tác nhân sunfat hóa trisulfonat natri amin (N(SO3Na)3) điều chỉnh về pH thích hợp bằng dung dịch NaOH 1M. Sau đó, 5 g PG được 84 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 thêm vào dung dịch kèm theo khuấy từ, phản ứng được tiến hành ở thời gian và nhiệt độ thích hợp. Dung dịch tiến hành thẩm tách 72 giờ và chưng cất bay hơi bằng thiết bị cô quay, kết tủa bằng cồn rồi sấy chân không ở 40 0C thu được PGS [6]. 4. Đo độ trao đổi (DS) Phương pháp sunfat bari nephelometry (dùng ánh sáng phản chiết để đo mật độ các hạt trong chất lỏng) được sử dụng để đo độ trao đổi của PGS [5]. Thủy phân 0,03 g PGS bằng 10 ml HCl trong 8 h tại 100 0C. Sau đó, dung dịch được bay hơi đến khô và phần còn lại hòa tan trong 10 ml nước cất. Sau đó 0,5 ml dung dịch đã thủy phân; 2,0 ml nước cất; 1,25 ml dung dịch glutin-bari clorua (chuẩn bị dung dịch từ 0,5g bari clorua và 0,5 g glutin trong 100 ml nước cất tại 60-70 0C) và 0,7ml axit trichloroaxetic 8% được thêm vào. Hỗn hợp trên được khuấy 1 phút và cho phép sử dụng trong vòng 15-20 phút. Hấp thụ bari sunfat được đo ở bước sóng 360 nm trên phổ UV-Vis. Đường chuẩn ghi lại các nồng độ sunfat kali khác nhau thay thế dung dịch thủy phân cộng với các tác nhân khác trong điều kiện tương tự ở trên. Kiểm tra mẫu blank bằng 0,5 ml nước cất thay dung dịch sunfat kali, các điều kiện khác không thay đổi. Độ trao đổi của PGS được xác định bằng cách so sánh với đường chuẩn. Độ trao đổi thể hiện qua số lượng trung bình các nhóm sunfat trên mỗi đơn vị anhydroglucose, được thiết lập từ hàm lượng lưu huỳnh bằng công thức [11]: DS = (198 [S]) / (3200 - 102 [S]). Trong đó [S] là hàm lượng lưu huỳnh (%) của PGS thu được từ việc tính toán ở trên. 5. Đặc tính của polyguluronat sunfat bởi FT-IR PGS đặc trưng bởi Phổ FT-IR được ghi lại trên phổ kế Nicolet Nexus 470 IR với chất nền KBr. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng điều chế tác nhân sunfat hóa Tác nhân sunfat hóa đóng một vai trò quan trọng nên cần thiết nghiên cứu để tối ưu các điều kiện phản ứng điều chế tác nhân này. Các điều kiện phản ứng tối ưu được tính toán thông qua độ trao đổi và có ba yếu tố được khảo sát. 1.1. Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ NaHSO3 và NaNO2 Tỷ lệ nồng độ giữa NaHSO3 và NaNO2 đóng vai trò quan trọng nhất trong việc điều chế tác nhân sunfat hóa. Để thực hiện thí nghiệm, qua tham khảo các tài liệu chúng tôi thực hiện khảo sát tỷ lệ này từ 3 đến 4,75, nhiệt độ phản ứng 700C và thời gian phản ứng 90 phút. Kết quả đo độ trao đổi thể hiện trên Hình 1. Kết quả cho thấy độ trao đổi tăng từ 0,75 đến 1,76 khi tỷ lệ giữa nồng độ NaHSO3 và NaNO2 tăng từ 3,0 cho đến 4,25 và sau đó giảm dần cho dù có sự tăng giữa tỷ lệ nồng độ các tác nhân sunfat hóa. Tỷ lệ này lớn hơn so với cân bằng phản ứng hóa học từ phương trình trên. Có thể do NaHSO3 bị phân hủy sinh khí SO2 (mùi của SO2 có thể ngửi thấy) vì phản ứng này tỏa nhiệt rất mạnh nên sẽ có một phần NaHSO3 bị phân hủy không phản ứng với NaNO2, do đó lượng NaHSO3 sẽ cần nhiều hơn. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 85 Hình 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nồng độ NaHSO3 và NaNO2 Vì vậy, tỷ lệ giữa nồng độ NaHSO3/NaNO2 là 4,25/1 là tối ưu để thực hiện quá trình sunfat hóa và ngưỡng tỷ lệ này cũng nằm trong vùng khảo sát của các tác giả Cui và cộng sự [4], Fan và cộng sự [6]. 1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến điều chế tác nhân sunfat hóa Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến điều chế tác nhân sunfat hóa chúng tôi chọn tỷ lệ giữa nồng độ NaHSO3/NaNO2 là 4,25/1 để thực hiện khảo sát. Kết quả mối tương quan giữa nhiệt độ phản ứng và độ trao đổi được thể hiện trong Hình 2. Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng Có thể nhận thấy độ trao đổi tăng chậm khi nhiệt độ tăng từ 300C đến 500C, sau đó tăng nhanh khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 600C đến 900C và đạt tối đa 1,51 tại nhiệt độ cuối cùng. Kết quả này có thể được giải thích như sau: mặc dù là phản ứng tỏa nhiệt nhưng ở mức nhiệt độ thấp, năng lượng giải phóng do phản ứng có thể không duy trì đầy đủ phản ứng nên tốc độ sẽ chậm, chỉ ở nhiệt độ trên 600C, năng lượng cần thiết đủ để kích hoạt cho phản ứng xảy ra nhanh đạt đến độ trao đổi cực đại, nhưng khi vượt qua 900C chúng xảy ra hiện tượng bùng nổ phản ứng rất khó kiểm soát. 1.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sunfat hóa Ban đầu độ trao đổi tăng cùng với thời gian phản ứng nhưng sau 90 phút thì độ trao đổi gần như không đổi. Độ trao đổi thu được 1,78 tại thời gian 90 phút. Đây là thời gian cần thiết cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. 86 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 Qua các khảo sát trên ta có thể nhận thấy những điều kiện để phản ứng điều chế tác nhân sunfat hóa tối ưu: tỷ lệ nồng độ NaHSO3/NaNO2 là 4,25/1, nhiệt độ phản ứng 900C và thời gian phản ứng 90 phút. Chúng tôi chọn các điều kiện này để thực hiện các khảo sát tiếp theo để tối ưu hóa phản ứng điều chế PGS. 2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng điều chế polyguluronat sunfat 2.1. Ảnh hưởng của pH đến điều chế polyguluronat sunfat Kết quả hiển thị trên Hình 4. Độ trao đổi tăng từ 0.76 lên 1.85 khi pH tăng từ 5 đến 9. Độ trao đổi cao nhất thu được tại pH 9 được Fan và cộng sự (2011) giải thích là do nhóm hydroxyl trong đơn vị anhydroglucose của PGS trong điều kiện kiềm sẽ được kích hoạt, các anion tại pH cao tạo thuận lợi cho PGS phản ứng với tác nhân sunfat hóa và thu được độ trao đổi cao. Khi pH tiếp tục tăng nhưng độ trao đổi giảm vì khi pH của quá trình sunfat trung gian quá cao hoặc quá thấp, PGS có thể bị thủy phân dẫn đến độ trao đổi đều thấp. Hình 4. Ảnh hưởng của pH Hình 3 mô tả mối quan hệ giữa thời gian và độ trao đổi của quá trình sunfat hóa. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 87 2.2. Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ tác nhân sunfat hóa và polyguluronat Tỷ giữa nồng độ tác nhân sunfat hóa và PG là một thông số quan trọng trong quá trình điều chế PGS. Theo phương trình điều chế tác nhân sunfat hóa, để tiện cho việc tính toán ta có thể trao đổi nồng độ tác nhân sunfat hóa bằng nồng độ của NaNO2 và trọng lượng phân tử của đơn vị anhydrogluco alginat natri là 198. Hình 5. Ảnh hưởng tỷ lệ nồng độ tác nhân sunfat hóa và polyguluronat Từ hình 5 cho thấy độ trao đổi tăng khi tỷ lệ giữa nồng độ tác nhân sunfat hóa và PG tăng từ 1/198 đến 2/198, nhưng sau đó giảm và không thay đổi cho dù tỷ lệ nồng độ vẫn tiếp tục tăng. Có thể lý giải hiện tượng này từ phương trình phản ứng sunfat hóa điều chế PGS, ta nhận thấy rằng tỷ lệ lượng hóa học của tác nhân sunfat hóa (N(SO3Na)3) với nhóm hydroxyl trong đơn vị anhydroglucose là 1:2 và mỗi đơn vị anhydroglucose PG có chứa hai nhóm hydroxyl. Như vậy, theo tỷ lệ cân bằng hóa học, mỗi phân tử của tác nhân sunfat hóa sẽ phản ứng với một đơn vị anhydroglucose, hay nói cách khác tính theo giá trị lý thuyết của tỷ lệ mol của NaNO2 và PG là 1/198 có thể dẫn đến phản ứng hoàn toàn. Tuy nhiên, NaNO2 điều chế cho tác nhân sunfating nhỏ hơn 1M và hoạt động của N(SO3Na)3 sẽ thấp dần cùng với sự giảm đi của nhóm SO3Na. Vì vậy, N(SO3Na)2 sẽ không phản ứng hoàn toàn, cho đến khi cân bằng động hóa học được thiết lập, do đó lượng NaNO2 yêu cầu sẽ cao hơn giá trị lý thuyết. Tuy nhiên, mặt khác do hiệu ứng không gian, lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm thế sunfat và các nhóm hydroxyl trong PGS, nó không chỉ là phản ứng hydroxyl mà còn có thể là sunfat hóa, dẫn đến làm giảm tác dụng tác nhân sunfat hóa. Kết hợp cả hai hiệu ứng, ta có thể lý giải điều kiện tỷ lệ tốt nhất giữa nồng độ tác nhân sunfat hóa và PG là 2:198 mol/g, tỷ lệ này gần giống trong vùng khảo sát của tác giả Cui và cộng sự [4] và Fan và cộng sự [6]. 2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến điều chế polyguluronat sunfat Kết quả thể hiện ở Hình 6. 88 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 Hình 7. Ảnh hưởng của thời gian đến điều chế polyguluronat sunfat Có thể thấy ở hình 7 độ trao đổi tăng theo thời gian phản ứng từ 1 đến 4 giờ và sau đó lại giảm đi cho dù thời gian phản ứng có tăng nữa. Qua đây có thể nhận thấy phản ứng Từ Hình 6 cho thấy độ trao đổi tăng khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 250C đến 400C và sau đó giảm từ từ cùng với sự gia tăng của nhiệt độ. Có hai tác động đáng kể đến quá trình này. Đầu tiên, cùng với sự gia tăng của nhiệt độ phản ứng dẫn đến các vùng kết tinh tinh thể PG sẽ bị phá hủy do sự trương lên, làm cho chúng trở nên không có hình dạng nhất định, đồng thời cùng với đó các trung tâm phản ứng hoạt động hình thành, nên khi tăng nhiệt độ thúc đẩy phản ứng sunfat hóa. Mặt khác, khi nhiệt độ tăng cao chúng lại gây cản trở phản ứng, như ta đã biết phản ứng điều chế PGS là một phản ứng tỏa nhiệt, dẫn đến cân bằng hóa học đi theo hướng ngược lại [4]. Vậy khi nhiệt độ phản ứng dưới 400C hướng đầu tiên là hướng ưu tiên, trong khi hướng thứ hai được ưu tiên khi nhiệt độ sunfat hóa lớn hơn 400C. 2.4. Ảnh hưởng của thời gian đến điều chế polyguluronat sunfat Kết quả thể hiện ở hình 7. Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến điều chế polyguluronat sunfat Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 89 sunfat hóa đòi hỏi phải có thời gian dài. Do vậy, lúc đầu độ trao đổi đo được không cho giá trị cao, nhưng khi phản ứng diễn ra sau 4 giờ thì độ trao đổi đạt cực đại vì lúc này tâm hoạt động được hình thành để phản ứng diễn ra hoàn toàn. Tuy nhiên, thời gian phản ứng sau đó có tăng nhưng độ trao đổi giảm đi, có thể do có sự hình thành nên các sản phẩm phụ của quá trình sunfat hóa [6]. Vì vậy, có thể kết luận 4 giờ là thời gian tối ưu của quá trình sunfat hóa. 2.5. Đặc tính của polyguluronat sunfat bởi FT-IR Hình 8. Phổ FT-IR của (a) polyguluronat và (b) polyguluronat sunfat Các thay đổi polyguluronat sunfat hóa được chỉ ra trên phổ hồng ngoại. Trên hình 8 ta nhận thấy, xuất hiện dao động tại vị trí 1.630 cm-1 và 1.421 cm-1 là đặc trưng cho các dao động hóa trị không đối xứng và đối xứng của các nhóm cacboxyl (COO-) tương ứng, phổ tại 796 cm-1 đặc trưng cho dao động biến dạng α-anomeric C-H của polyguluronat sunfat, các dao động biến dạng này cũng đã được chỉ ra bởi tác giả Fenoradosoa và cộng sự [7]. Các đám phổ tại 1.249 cm-1 và 875 cm-1 thể hiện dao động biến dạng không đối xứng S=O và dao động biến dạng đối xứng C-O-S kéo dài tương ứng, nó chỉ ra rằng quá trình sunfat hóa đã thực sự xảy ra và kết quả này đều tương tự các vùng dao động biến dạng của tác giả Han và cộng sự [9] cũng tại các dao động 1.245,38 cm-1 và 847,06 cm-1. IV. KẾT LUẬN Phương pháp tổng hợp polyguluronat sunfat với tác nhân sunfat hóa (N(SO3Na)3) trong dung dịch nước đã được nghiên cứu. Tất cả các ảnh hưởng của điều kiện phản ứng về sự hình thành tác nhân sunfat hóa và polyguluronat sunfat đã được trình bày có hệ thống. Điều kiện phản ứng tối ưu để điều chế tác nhân sunfat hóa thu được bởi thí nghiệm như sau: tỷ lệ nồng độ NaHSO3 và NaNO2 là 4,25/1, nhiệt độ phản ứng 900C và thời gian phản ứng là 90 phút. Điều kiện phản ứng tối ưu để điều chế polyguluronat sunfat thu được bởi thí nghiệm như sau: pH = 9, tỷ lệ giữa nồng độ tác nhân sunfat hóa và polyguluronat là 2:198 mol/g, nhiệt độ phản ứng là 400C, thời gian phản ứng 4 giờ. Với những điều kiện phản ứng tối ưu này, độ trao đổi tối đa thu được là 1,85. Lời cảm ơn Bài báo này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc hướng khoa học và công nghệ biển VAST06.05/12-13 của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 90 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Thị Thanh Xuân, Nguyễn Văn Thành, Đặng Vũ Lương, Bùi Minh Lý, Trần Thị Thanh Vân, Thành Thị Thu Thủy, 2014. Nghiên cứu phân lập và cấu trúc hóa học của alginat và phân đoạn của chúng từ rong nâu Turbinaria ornata (Turner) J. Agardh. Tạp chí Khoa học và công nghệ, 52(5A): 35-41. Tiế ng Anh 2. Alban, S., Schauerte, A. and Franz, G., 2002. Anticoagulant sulfated polysaccharides: Part I. Synthesis and structure–activity relationships of new pullulan sulfates. Carbohydrate Polymers, 47(3), 267-276. 3. Bajdik, J., Makai, Z., Berkesi, O., Süvegh, K., Marek, T., Erős, I. and Pintye-Hódi, K., 2009. Study of the effect of lactose on the structure of sodium alginate fi lms. Carbohydrate Polymers, 77(3), 530-535. 4. Cui, D., Liu, M., Liang, R. and Bi, Y., 2007. Synthesis and Optimization of the Reaction Conditions of Starch Sulfates in Aqueous Solution. Starch – Stärke, 59(2), 91-98. 5. Dodgson, K.S. and Price, R.G., 1962. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides. Biochemical Journal, 84(1), 106-110. 6. Fan, L., Jiang, L., Xu, Y., Zhou, Y., Shen, Y., Xie, W., Long, Z. and Zhou, J., 2011. Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates. Carbohydrate Polymers, 83(4), 1797-1803. 7. Fenoradosoa, T.A., Ali, G., Delattre, C., Laroche, C., Petit, E., Wadouachi A. and Michaud, P., 2010. Extraction and characterization of an alginate from the brown seaweed Sargassum turbinarioides Grunow. Journal of Applied Phycology, 22(2), 131-137. 8. Guiseley, K.B., 1978. Some Novel Methods and Results in the Sulfation of Polysaccharides. Carbohydrate Sulfates, 77, 148-162. 9. Han F., Yao W., Yang X., Liu X. and Gao X., 2005. Experimental study on anticoagulant and antiplatelet aggregation activity of a chemically sulfated marine polysaccharide YCP. Int. J. Biol. Macromol, 36(4), 201-207. 10. Haug, A., Larsen, B., Smidsrød, O., Møller, J., Brunvoll, J., Bunnenberg, E., Djerassi, C. and Records, R., 1996. A Study of the Constitution of Alginic Acid by Partial Acid Hydrolysis. Acta Chemica Scandinavica - Acta. Chem. Scand., 20, 183-190. 11. Lim, D., Whang, H.S., Yoon, K. and Ko, S., 2001. Synthesis and absorbency of a superabsorbent from sodium starch sulfate-g-polyacrylonitrile. Journal of Applied Polymer, 79(8), 1423–1430. 12. Llanes, F., Ryan, D.H. and Marchessault, R.H., 2000. Magnetic nanostructured composites using alginates of different M/G ratios as polymeric matrix. International Journal of Biological Macromolecules, 27(1), 35-40. 13. Panikkar, R. and Brasch, D.J., 1996. Composition and block structure of alginates from New Zealand brown seaweeds. Carbohydrate Research, 293(1), 119-132. 14. Ronghua, H., Yumin, D. and Jianhong, Y., 2003. Preparation and in vitro anticoagulantactivities of alginate sunfate and its quaterized derivatives. Carbohydrate Polymers, 52(1), 19-24. 15. Schierbaum, F. and Kördel, K., 1978. Reaction of Starch with the Chlorosulfonic Acid-Formamide Reagent. Carbohydrate Sulfates, 77: 173-192. 16. Tessler, M.M., 1978. National Starch and Chemical Corporation. Patent US Number 4,086,419. 17. Yao, Z., Wu, H., Han, B., Ma, H., Jiang, Z. and Du, Y., 2006. The antithrombotic action of propylene glycol mannite sulfate (PGMS). Pharmacological Research, 53(2): 166-170.