Tinh sạch và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố đỏ prodigiosin từ serratia marcescens - Nguyễn Sỹ Lê Thanh

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 210-216 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA SẮC TỐ ĐỎ PRODIGIOSIN TỪ Serratia marcescens Nguyễn Sỹ Lê Thanh*, Lê Đình Quyền Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nslthanh@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Prodigiosin (Pg) là hợp chất chuyển hóa sinh học thứ cấp alkaloid có nhiều tác dụng đặc biệt như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế miễn dịch. Prodigiosin được sản xuất bởi một số chủng vi khuẩn như Serratia marcescens, Hahella chejuensis, Vibrio psychroerythrus và Streptomyces coelicolor, trong đó loài S. marcescens được biết đến sớm nhất và được tìm hiểu từ rất sớm. Trong nhiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện để tách chiết và tinh sạch sơ bộ Pg từ dịch lên men chủng S. marcescens M10. Ethyl acetate có chứa 5% acetone là hệ dung môi thích hợp để tách chiết Pg từ dịch nuôi cấy. Hệ dung môi chloroform: methanol: H2O với tỷ lệ tương ứng là 8: 0,5: 0,1 thích hợp cho việc phân tách hoạt chất Pg trên hệ sắc kí bản mỏng TLC. Bước đầu được tinh sạch qua cột sắc ký chứa silicagel 60, trên bản sắc kí bản mỏng TLC, chúng tôi đã thu được một băng đậm có kích thước ngang với Pg chuẩn. Pg từ chủng S. marcescens M10 có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn như S. aureus, B. subtilis và không ức chế vi khuẩn như E. coli. Từ khóa: Serratia marcescens M10, môi trường, prodigiosin, tinh sạch, vi khuẩn đỏ. MỞ ĐẦU Prodigiosin (Pg) là chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên được sinh tổng hợp bởi các loài lựa chọn của vi khuẩn như S. marcescens, S. proteamacula 657 [11], Hahella chejuensis KCTC 2396, V. psychroerythrus, V. ruber sp. nov, V. gazogenes ATCC 29988T, Streptomyces coelicolor, Pseudoalteromonas sp. 1020R, Pseudomonas magnesiorubra [4], Janthinobacterium lividum [12], Zooshikella rubidus S1-1 [9]. Hiện nay, prodigiosin đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do khả năng ức chế miễn dịch và kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư kháng thuốc như MDR1, BCRP, hoặc MRP2 [3], hay tế bào bạch cầu nguyên bào tuỷ K562 mãn tính ở người [13]. Ngoài ra, Pg còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm [2] và ít gây ảnh hưởng tới tế bào bình thường. Trong các loài vi khuẩn S. marcescens là loài có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin được biết đến sớm nhất và được tìm hiểu từ rất sớm [7]. S. marcescens là trực khuẩn hình que, vi khuẩn hô hấp tuỳ tiện, thuộc họ Enterobacteriaceae và đặc trưng bởi khả năng tạo ra các sắc tố đỏ prodigiosin. Mười loài của Serratia đã được mô tả, trong đó chỉ ba loài có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin: S. plymuthica, S. rubidaea và S. marcescens. S. marcescens là một vi sinh vật hô hấp tuỳ tiện và do đó các sắc tố được sản xuất dưới cả hai điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Sản xuất sắc tố rất khác nhau giữa các loài và phụ thuộc vào nhiều các yếu tố như nguồn loài điển hình, thời gian nuôi cấy, pH, carbon, nitơ và các muối vô cơ. Với các thành phần môi trường và các yếu tố nuôi cấy tối ưu, các chủng S. marcescens phân lập ở các nơi khác nhau cho năng suất sinh tổng hợp prodigiosin rất khác nhau, như S. marcescens SWML08: 1,39796 mg/L, S. marcescens: 1,84527 mg/L [8]. Song et al. (2006) [14] đã chiết và tinh sạch prodigiosin từ chủng Serratia sp. KH-95 từ chất hấp phụ bên trong sử dụng methanol đã acid hóa và tách pha với nước và chloroform. Tiếp theo, chất được tinh sạch bằng sắc ký silica gel và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Sắc tố quan tâm được tinh chế qua cột sắc ký (50×1 cm) sử dụng silica làm chất hấp phụ. Việc nghiên cứu những loại thuốc có tác dụng chống ung thư, có giá thành phù hợp với điều kiện của đa số người bệnh ở Việt Nam là một việc làm rất quan trọng, cần thiết và cấp bách. Vì vậy để bước đầu nghiên cứu về thu nhận prodigiosin, việc nghiên cứu tách chiết và thử nghiệm hoạt tính là vô cùng cần thiết. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Môi trường nuôi Chủng Serratia marcescens M10 được phân lập, định danh theo các nghiên cứu trước đây [15,16]. Môi trường nuôi cấy khảo sát khả năng sinh tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin của các chủng vi khuẩn: (30 ml LB + 2% lạc xay; tinh dầu vừng, casein). Chủng vi khuẩn sinh sắc tố đỏ trên trong 3 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 200 rpm ở 28oC qua đêm. Sau đó tiếp giống 5% (1,5 ml) vào các bình tam giác chứa 50 ml các môi trường khác nhau, nuôi lắc 200 rpm ở 28oC trong 120 giờ nuôi cấy, kiểm tra các mẫu nuôi lắc mỗi ngày để chọn lựa môi trường có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin cao nhất. Xác định hàm lượng prodigiosin bằng đường chuẩn Prodigiosin chuẩn (Sigma) có hàm lượng 100 µg/ml được chúng tôi tiến hành pha loãng ở các nồng độ xác định và đo OD ở bước sóng 535 nm. Tiến hành lặp lại 3 lần sau đó lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn. Đường chuẩn prodigiosin được dựng dựa vào hàm lượng prodigiosin pha loãng và giá trị OD ở nồng độ pha loãng đó [1]. Đường chuẩn prodigiosin: Y = 0,2544X + 0,0711. Sắc kí bản mỏng Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography, TLC) được sử dụng để phân tích và xác định số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết hoặc các phân đoạn tách ra. Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độ phân cực khác nhau nên được tách ra ở các vị trí khác nhau. Đây là phương pháp vi lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày 0,25 mm, với hệ dung môi là chloroform: methanol: H2O sau đó hiện màu bằng thuốc thử iodine. Sắc ký cột Sắc ký cột (Column chromatography, CC) được sử dụng để phân tách các chất dựa vào độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử. Trong nghiên cứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang là SiO2. Tẩm SiO2 với cặn chiết lên men theo tỷ lệ 1:1 w/w, nhồi cột SiO2 bằng kỹ thuật nhồi ướt và đẩy với hệ dung môi đã chọn là dichloromethane: ethyl acetate với tỷ lệ thể tích thay đổi từ 100/0 đến 50/50. Rửa giải cột bằng hệ dung môi ở trên với tỷ lệ tăng độ phân cực (bắt đầu từ 100/0 đến 0/100). Sau khi thu được các phân đoạn chính, tiến hành chạy TLC để xác định vạch chất cần, lấy phân đoạn có vạch xác định tách lại để phân lập tiếp bằng sắc ký cột hoặc kết tinh. Xác định khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Hadacek et al. (2000) [6]. Một khuẩn lạc các chủng vi sinh vật nghiên cứu được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm trong môi trường LB không bổ sung kháng sinh. Trải 50 ml dịch nuôi trên môi trường thạch LB không bổ sung kháng sinh, sau đó đục lỗ thạch và nhỏ 100 ml dịch chiết có chứa prodigiosin tách từ dịch nuôi cấy, để 4°C trong 3-4 giờ rồi chuyển sang nuôi 37°C, qua đêm. Quan sát khả năng kháng khuẩn. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu nhận và tách chiết Pg từ Seratia marcescens M10 Hình 1. Ảnh hưởng của cơ chất nuôi cấy lên tổng hợp Pg Chủng Seratia marcescens M10 đã được định danh, tối ưu môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp prodigiosin trong các nghiên cứu trước đây [15, 16]. Tuy nhiên, với điều kiện nuôi cấy ở các nghiên cứu trước với nguồn cơ chất là lạc xay dịch tách chiết rất khó phân tách khi tinh sạch. Đặc biệt trong môi trường có chứa dầu lạc, việc tinh sạch và chạy sắc kí bản mỏng gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, chúng tôi cũng đã nghiên cứu tìm môi trường dễ tách chiết và đảm bảo hàm lượng prodigiosin đạt cao nhất. Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng S. marcescens M10 trong môi trường chứa các cơ chất là lạc xay, bột gạo, casein, tinh dầu dừa và bột sắn với hàm lượng là 1% (w/v). Kết quả hình 1 cho thấy, chủng M10 sinh tổng hợp prodigiosin cao nhất ở môi trường có chứa casein 1% (w/v) tương đương với môi trường lạc xay (hình 1). Theo một số nghiên cứu trước đây, các tác giả đã thu được sản phẩm prodigiosin thu được thấp hơn so với kết quả của chúng tôi và chỉ đạt 1,84527 mg/L, và tương đương với prodigiosin sản xuất bởi S. marcescens trong môi trường có chứa hạt vừng và lạc xay trong nghiên cứu của Giri et al. (2004) [5]. Nghiên cứu của Aurjo et al. (2010) [1] cho thấy, hàm lượng prodigiosin bởi S. marcescens UCP 1549 cũng thấp hơn trong môi trường chất thải sắn khi so sánh nồng độ prodigiosin trong nước luộc sắn thu được. Để lựa chọn dung môi thích hợp và thơi gian tiến hành tách chiết, dịch lên men sau khi đã ly tâm loại tế bào được ủ với các dung môi khác nhau như ethyl acetate, ethyl acetate: acetone (95:5) và chloroform trong khoản thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 phút trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Kết quả ở hình 2 cho thấy, hệ dung môi ethyl acetate: acetone (95:5) cho hàm lượng Pg cao nhất sau 72 phút ở nhiệt độ phòng. Hình 2. Ảnh hưởng của dung môi và thời gian ủ lên hiệu quả tách chiết Pg từ dịch chiết lên men chủng S. marcescens M10. ▲ Ethyl acetate ; ■ Ethyl acetate :Acetone (95 :5) ; ♦ Chloroform A B C D E Hình 3. TLC dịch chiết lên men chủng S. marcescens M10 với các hệ dung môi khác nhau: A (8 : 1,5 : 0,1); B (8 : 1,3 : 0,1); C (8 : 1 : 0,1); D (8 : 0,5 : 0,1); E (8 : 0,8 : 0,1). Sau khi lựa chọn môi trường và điều kiện tách chiết cho thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra các sản phẩm từ dịch chiết trong các môi trường có chứa casein, lạc xay và tinh dầu vừng. Kết quả TLC ở hình 3 với hệ dung môi chloroform: methanol: H2O với tỷ lệ D (8 : 0,5 : 0,1) cho thấy, dịch chiết từ môi trường có chứa casein cho số băng vạch ít hơn. Điều này có thể lý giải là do môi trường lạc xay và môi trường tinh dầu vừng có thế có thêm các chất béo trong dịch chiết. Vì vậy, môi trường casein là môi trường được chúng tôi chọn lựa cho các nghiên cứu tiếp theo. Lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho TLC Hệ dung môi và tỷ lệ dung môi khác nhau khi chạy sắc kí bản mỏng sẽ cho những hình ảnh khác nhau. Vì vậy, để lựa chọn dung môiphù hợp cho TLC, chúng tôi đã khảo sát nhiều hệ dung môi khác nhau và kết quả cho thấy hệ dung môi có chứa chloroform: methanol: H2O cho vạch tương đối rõ nét và gọn. Khi tìm được hệ dung môi thích hợp, chúng tôi tiến hành lựa chọn tỷ lệ dung môi để cho bản sắc kí được tách ra các vạch rõ nét. Kết quả ở hình 3 cho thấy, hệ dung môi với tỷ lệ D  (8 : 0,5 : 0,1) cho các băng vạch rõ nét và tách rời khỏi nhau. Vì vậy chúng tôi chọn hệ dung môi chloroform: methanol: H2O với tỷ lệ D (8 : 0,5 : 0,1) cho các thí nghiệm tiếp theo. CHCl3 94/6 90/10 80/20 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0 100 200 300 400 500 600 700 OD, 535 nm Thể tích (ml) Hình 4. Phân đoạn tinh sạch sắc tố đỏ thô qua cột silica gel. Thứ tự rửa giải: 0-300 ml với CHCl3; 310-400 ml với CHCl3/CH3OH 94/6 (v/v); 410-600 ml với CHCl3/CH3OH 90/10 (v/v); từ 610 ml với CHCl3/CH3OH 80/20 (v/v). Tinh sạch sắc tố đỏ prodigiosin qua cột silicagel Sắc tố đỏ prodigiosin được tách chiết theo quy trình đã nêu ở trên được chúng tôi tiến hành tinh sạch qua cột sắc ký. Khoảng 5 mg sắc tố đỏ thô trong ethyl acetate được sây khô trong máy cô quay chân không Buchi (Đức) hòa trở lại trong 5 ml methanol. Nhồi mẫu lên cột (2,5x35 cm), cột được nhồi với silica gel 60 (0,063-0,200 mm) (Merck KgaA - Đức), cân bằng cột trong chloroform. Thu các phân đoạn được thực hiện một cách tự chảy với tốc độ dòng chảy 5-10 ml/phút, rửa giải đầu tiên với chloroform tinh khiết, sau bằng chloroform/methanol với tỷ lệ khác nhau. Các mẫu được rửa giải trong chloroform tinh khiết có màu đỏ tươi, sau đó thay đổi thành màu nâu đỏ trong phân đoạn chloroform/methanol, và đỏ tím trong phân đoạn methanol tinh khiết. Các phân đoạn thu được xác định hàm lượng Pg bằng đo OD 535 nm. Các phân đoạn tinh sạch thu được nhiều đỉnh với hàm lượng Pg khác nhau (hình 4), sau đó được TLC kiểm tra với chuẩn Pg (Sigma). Chúng tôi tiến hành gom các phân đoạn theo các đỉnh thu được khi chạy cột, các mẫu có hàm lượng Pg cao nhất khi đo OD 535nm được chúng tôi tiến hành qua cột lần hai để thu được các phân đoạn có độ tinh sạch cao hơn. Kết quả TLC của các phân đoạn tinh sạch theo thứ tự cho thấy, có 4 phân đoạn 4-7 cho một băng sạch không chứa các vạch phụ và có Rf ngang với chuẩn Pg (hình 5). 1 2 3 4 5 6 7 Hình 5. Kết quả chạy sắc kí bản mỏng (TLC) mẫu M10 1: Pg chuẩn (SIGMA); 2: dịch nổi; 3: dịch chiết 4-7: Các phân đoạn prodigiosin sau khi chạy qua cột sắc kí theo thứ tự rửa giải với CHCl3/CH3OH 94/6 (v/v); 410-600 ml với CHCl3/CH3OH 90/10 (v/v); từ 610 ml với CHCl3/CH3OH 80/20 (v/v). Thử hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố đỏ prodigiosin Pg được biết đến là một hợp chất thứ cấp có màu đỏ và có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế miễn dịch, kháng ung thư. Trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi kiểm tra khả năng kháng một số loại vi khuẩn. Mẫu dịch chiết sắc tố đỏ và các phân đoạn tinh sạch được thử hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis WB800, E. coli DH10B, và chủng S. aureus, theo phương pháp khuếch tán giếng thạch. 50 μl mẫu được nhỏ vào mỗi giếng (9 mm) được đục bằng khoanh đục lỗ vô trùng trên đĩa thạch LB và YP đã trải vi khuẩn kiểm định trên bề mặt. Đĩa thử nghiệm được ủ ở 30°C trong 18-24 giờ. Sự kháng khuẩn được thể hiện với khu vực ức chế (vòng vô khuẩn) xung quanh giếng cũng đã được thể hiện trên đĩa thạch (hình 6). Dịch chiết Pg đã không xuất hiện vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch có chứa vi khuẩn E. coli DH10B, điều này phù hợp với các nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới [10]. Trên đĩa thạch có chứa B. subtilis WB800 và chủng S. aureus đã xuất hiện vòng kháng khuẩn tương đối rõ nét. A B C Hình 6. Khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định của sắc tố đỏ Pg A. S. aureus; B. B. subtilis; C. E. coli; Ampi: ampicillin; Pg: standard prodigiosin; CL: dịch chiết từ môi trường lạc xay; Casein: dịch chiết từ môi trường casein; DC (-): methanol (đối chứng âm). KẾT LUẬN Nghiên cứu này chỉ ra rằng môi trường có bổ sung casein là tốt nhất để sinh tổng hợp Pg và dễ dàng tinh sạch. Dung môi ethyl acetate có chứa 5% acetone là hệ dụng môi thích hợp để tách chiết Pg từ dịch nuôi cấy. Chúng tôi đã tách chiết được sắc tố đỏ từ dịch nuôi chủng S. marcescens M10 bằng dung môi phân cực, dịch chiết được tinh sạch sơ bộ bằng sắc kí cột silicagel xuất hiện vạch trùng với chuẩn Pg khi kiểm tra bằng TLC. Pg từ chủng S. marcescens M10 có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn như S. aureus, B. subtilis và không ức chế vi khuẩn như E. coli. Các kết qua thu được sẽ được phát triển thêm để tinh sạch lượng lớn Pg và tiến tới thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Lời cảm ơn. Công trình có sự hỗ trợ của nhiệm vụ quỹ gen: “Khai thác và phát triển nguồn gene vi sinh vật tổng hợp prodigiosin có hoạt tính chống ung thư” Bộ Khoa học và Công nghệ, 2014-2016. TÀI LIỆU THAM KHẢO de Araujo H. W., Fukushima K., Takaki G. M., 2010. Prodigiosin production by Serratia marcescens UCP 1549 using renewable-resources as a low cost substrate. Molecules, 15(10): 6931-6940. Duzhak A. B., Panfilova Z. I., Duzhak T. G., Vasyunina E. A., Shternshis M. V., 2012. Role of prodigiosin and chitinases in antagonistic activity of the bacterium Serratia marcescens against the fungus Didymella applanata. Biochem Biok, 77(8): 910-916. Elahian F., Moghimi B., Dinmohammadi F., Ghamghami M., Hamidi M., Mirzaei S. A., 2013. The anticancer agent prodigiosin is not a multidrug resistance protein substrate, DNA Cell Biol, 32(3): 90-97. Gerber N. N., 1975. Prodigiosin-like pigments. Crit Rev Microbiol, 3(4): 469-485. Giri A. V., Anandkumar N., Muthukumaran G., Pennathur G., 2004. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiol., 4: 11-15. Hadacek F., Greger H., 2000. Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice. Phytochem Analysis, 11: 137-147. Harned R. L., 1954. The production of prodigiosin by submerged growth of Serratia marcescens. Appl Microbiol, 2(6): 365-368. Kamble K. D., Hiwarale V. D., 2012. Prodigiosin production from Serratia marcescens strains obtained from farm soil. Int J Environ Sci, 3(1):doi:10.6088/ ijes.2012030131061. Lee J. S., Kim Y. S., Park S., Kim J., Kang S. J., Lee M. H., Ryu S., Choi J. M., Oh T. K., Yoon J. H., 2011. Exceptional production of both prodigiosin and cycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novel marine bacterium, Zooshikella rubidus S1-1. Appl. Environ. Microbiol., 77(14): 4967-4973. Mekhael R., F. Y. S., 2009. The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid agent. Kurd Biol. Sci., 12(1): 268-274. Miao L., Wang X., Jiang W., Yang S., Zhou H., Zhai Y., Zhou X., Dong K., 2013. Optimization of the culture condition for an antitumor bacterium Serratia proteamacula 657 and identification of the active compounds. J. Microbiol. Biotechnol., 29(5): 855-863. Schloss P. D., Allen H. K., Klimowicz A. K., Mlot C., Gross J. A., Savengsuksa S., McEllin J., Clardy J., Ruess R. W., Handelsman J., 2010. Psychrotrophic strain of Janthino bacterium lividum from a cold Alaskan soil produces prodigiosin. DNA Cell Biol, 29(9): 533-541. Smithen D. A., Forrester A. M., Corkery D. P., Dellaire G., Colpitts J., McFarland S. A., Berman J. N., Thompson A., 2013. Investigations regarding the utility of prodigiosenes to treat leukemia. Org. Biomol. Chem., 11(1): 62-68. Song M. J., Bae J., Lee D. S., Kim C. H., Kim J. S., Kim S. W., Hong S. I., 2006. Purification and characterization of prodigiosin produced by integrated bioreactor from Serratia sp. KH-95. J Biosc Bioeng, 101(2): 157-161. Nguyen Sy Le Thanh, Le Dinh Quyen, Do Thi Tuyen, Vu Trong Luong, Nguyen Thi Anh Tuyet, Quyen Dinh Thi, 2014. Optimized culture conditions and preliminary purification of prodigiosin production from Serratia marcescens M10. Pub Sci Tech, 335-344. Nguyen Sy Le Thanh, Le Dinh Quyen, Vu Trong Luong, Do Thi Tuyen, Quyen Dinh Thi, 2014. Screening, determination of bacteria producing prodigiosin., Viet Nam Med, 421: 120-124. PURIFICATION AND ANTIBACTERIA ACTIVITY OF ANTICANCER AGENT PRODIGIOSIN FROM Serratia marcescens M10 Nguyen Sy Le Thanh, Le Dinh Quyen Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Prodigiosin (Pg) is a secondary metabolite alkaloid with anti cancer, immunosuppressive, antifungal properties. Pg is a red pigment, which isolated from bacteria, such as Serratia marcescens, Hahella chejuensis, Vibrio psychroerythrus and Streptomyces coelicolor. In present study, we focus on selection of culture medium for effective pigment production, and preliminary purification of the Pg from culture of S. marcescens M10. Casein supplemented with LB medium acts as a good substrate for Pg production by S. marcescens M10. We used casein broth for the further studies as we knew the ingredients in the broth, using it would be easier for extraction than using the natural substrates as sesame or peanut because of its unknown component. In addition, ethyl acetate containing 5% acetone is the most effective solvent for extraction to get the highest total prodigiosin. The pigment extracted from supernatant was passed through the column chromatography containing silicagel 60 to purify prodigiosin. On TLC, it can seen that the interested fragments observed run the same with a known compound as standard prodigiosin. The crude extract from peanut powder broth, casein broth and standard prodigiosin were tested against common pathogen B. subtilis and S. aureus, which are Gram-positive bacteria. In addition, it was not against the pathogen E. coli, which is a gram-negative bacterium. Keywords: Serratia marcescens M10, Red-pigment microoganism medium, prodigiosin, purification. Ngày nhận bài: 22-10-2014