Giới thiệu chung:
Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau:
1. Nhận biết protein mục tiêu
2. Ly trích protein từ tế bào
3. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên
Phân tách protein bằng điện di trên gel Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di.
Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein. Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein.
Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+).
7 trang |
Chia sẻ: aloso | Lượt xem: 2650 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tinh sạch protein, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Tinh sạch protein
bằng phương pháp tủa
Phương pháp tủa được sử dụng tương
đối rộng rãi để thu nhận các phân tử
sinh học mà nhất là protein. Để tủa,
người ta có thể dùng nhiều cách khác
nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các
dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH
của dung dịch có chứa protein.
1. Tủa bằng muối
Đây là cách phổ biến để tủa protein.
Khả năng hòa tan của protein tùy
thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý
hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ,
nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của
protein tăng nhẹ (salting in). Tuy
nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan
của protein giảm mạnh (salting out).
Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng
độ muối thấp được giải thích bởi
Debye - Huckel. Trong dung dịch,
protein được bao bọc xung quanh bởi
các ion muối mang điện tích trái dấu.
Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính
của các dung môi, làm giảm các phân
tử protein không mang điện tích, do
đó làm tăng tính tan của protein trong
dung môi. Giả thuyết của Debye –
Huckel cho rằng: tính tan của protein
được biểu diễn bằng một hàm logarit,
giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai
của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ salting out trong môi
trường có nồng độ muối cao được giải
thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng
lượng ion muối trong dung dịch làm
giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính
hòa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân
theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng
của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào
pH, hỗn hợp và lượng muối có trong
dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan
của protein biến thiên theo nồng độ
muối:
Hình 1. Độ tan theo nồng độ muối
Những đường biểu diễn khác nhau tùy
theo từng protein khác nhau. Vì thế,
khi muốn tách 1 protein từ một hỗn
hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta
có thể lựa chọn nồng độ muối thích
hợp sao cho phù hợp nhất với protein
mục tiêu.
Độ dốc của đường salting out mô tả ở
trên phụ thuộc vào chức năng của
protein và nồng độ muối, không phụ
thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài
ra, nếu trọng lượng phân tử của
protein tăng thì lượng muối cần cho
phương pháp tủa giảm xuống.
Hiệu quả tủa protein của các anion
muối khác nhau thì khác nhau, có thể
xếp theo thứ tự giảm dần như sau:
citrate > phosphate > sulphate >
acetate/chloride > nitrate >
thiocyanate.
2. Tủa protein bằng các dung môi
hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi
trường, hằng số điện môi của môi
trường giảm xuống. Công thức biểu
diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và
hằng số điện môi:
ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D)
Trong đó
S: độ hòa tan của protein trong dung
môi hữu cơ
Sw: độ hòa tan của protein trong nước
D: hằng số điện môi của môi trường
sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ
vào
Dw: hằng số điện môi của nước
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
A: hằng số khí
Công thức trên cho thấy: khi thêm
dung môi hữu cơ vào môi trường,
hằng số điện môi tăng lên, khả năng
hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự
kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu
cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ
nước của phân tử protein. Kết quả là
chúng làm biến tính protein trong suốt
quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên
sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng
độ thấp (mặc dù một số dung môi
như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol
(MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO)
và Ethanol có thể được sử dụng ở
nồng độ cao.
