Tiểu luận Tiêu chuẩn kiểm nghiệm staphylococcus aureus

Môn học: Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm Năm học: 2014 – 2015 TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN STAPYLOCOCCUS AUREUS Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có mủ. Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu. 1.2. PHÂN BỐ Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như thịt, sữa Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi. Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh. Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội (opportunist type) vì sự có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, cả khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu. Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc. Hầu hết các dòng đều tạo sắc tố vàng sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi tăng trưởng ở 35-37oC. S. aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu được phân lập từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. S.aureus có thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁ Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol, manitol Không lên men salicin, raffinose,inulin. Có khả năng chịu mặn cao Làm đông tụ sữa Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu. Phản ứng indol-,NH3-, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương. 1.6. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM: Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm đó và bị ngộ độc. Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng. Loại này thường có tính chất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có vsv gây bệnh. Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm đó bị ngộ độc). Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột. Type A và D gây ngộ độc thực phẩm cho người. TRIỆU CHỨNG BỆNH: Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộc vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắt bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng, đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72h, nạn nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội. Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc. Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố này. 100oC/30’; 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến. BIỆN PHÁP PHÒNG NGỪA: Kiểm tra sức khoẻ công nhân. Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú. Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố. Hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển. toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ các tế bào, một số bị phân huỷ ở to= 80oC /0.5h. Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt 10%/10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương trên da ở người và động vật doStaphylococcus gây ra dùng dung dịch gentiant violet 2%. 2.1. Ý NGHĨA CỦA VIỆC KIỂM TRA VI KHUẨN Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 2.2 MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được đẻ phân tích định tính S.aureus hay trong định lượng bằng phương pháp MPN. Môi trường thạch máu: Máu được sử dụng là máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chát chống đông citrate. Môi trường cần được pha chế ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến khoảng 60oC. Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA) Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ. 2.3 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH STAPHYLOCOCCUS AUREUS Cấy 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Dung que cấy vòng ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1-1,5mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường đặc trưng BHI, ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ. Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) (có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng không có) 2.3.1. ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC ĐỒNG NHẤT MẪU VÀ PHA LOÃNG Cân chính xác 10 ± 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa. PHÂN LẬP MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa cho môi trường thạch Baird Parker cho mỗi độ pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1oC trong 24-48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đổi với môi trường thạch máu. Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker ó đường kính khoảng 0,5-1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1-2mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1-1,5mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2-4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn l ạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc. Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xá hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1-2mm. Hầu hết S. aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. KHẲNG ĐỊNH Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1oC trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 1oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương được hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. CÁCH TÍNH KẾT QUẢ Mật độ S. aureus trong mẫu được tính như sau: Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10 (NtHt+NaHa)F1+F2 F: độ pha loãng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng Ha: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng 2.3.2. ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Phương pháp này dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với ba độ pha loãng thập phân liên tiếp (ví dụ 10-1; 10-2; 10-3). Tuỳ theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ phoãng với 3 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm ( 3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng). Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa 10% muối NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu ở độ pha loãng khác nhau vào ống 10ml môi trường, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để thực hiện các thử nghiệm khẳng định S. aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc. Các đĩa cho kết quả khẳng định S. aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN để suy ra mật độ S. aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml). Quy trình định lượng S. aureus được tóm tắt qua hình sau.