Thông số về tính đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài đỉnh tùng (Cephalotaxus Mannii Hook. F.) ở Tây Nguyên, Việt Nam bằng chỉ thị SSR

Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 245-252, 2016 245 THÔNG SỐ VỀ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ TỰ NHIÊN LOÀI ĐỈNH TÙNG (CEPHALOTAXUS MANNII HOOK. F.) Ở TÂY NGUYÊN, VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ SSR Đinh Thị Phòng, Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Ngày nhận bài: 22.3.1016 Ngày nhận đăng: 25.6.2016 TÓM TẮT Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f.) là một trong số 15 loài lá kim có ở Tây Nguyên. Đỉnh tùng là một cây có giá trị dược liệu và đặc hữu của khu vực trung tâm phía nam của Trung Quốc và Việt Nam. Ở Việt Nam, mặc dù loài phân bố rộng rãi (Lào Cai, Hà Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng ...) nhưng được coi là hiếm và sắp tuyệt chủng bởi sự khai thác bừa bãi của con người. Trong nghiên cứu này, 18 chỉ thị SSR đã được sử dụng để phân tích tính đa dạng di truyền của 34 cá thể Đỉnh tùng thu ở Tà Nung và Hiệp An, tỉnh Lâm Đồng. Kết quả phân tích đã chỉ ra 12/18 chỉ thị có tính đa hình. Tổng số đã nhân bản được 36 phân đoạn DNA, trong đó 24 phân đoạn đa hình (chiếm 66,66%). Tính đa dạng di truyền ở quần thể Hiệp An cao hơn (h = 0,269; I = 0,449 và PPB = 72,22%) so với quần thể Tà Nung (h = 0,433; I = 0,264 và PPB = 66,67%). Tổng mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể là 27,74% và giữa các cá thể trong cùng quần thể là 72,26%. Hệ số di nhập gen (Nm) trung bình của loài Đỉnh tùng là 3,310. Cả hai quần thể Tà Nung và Hiệp An đều có hệ số giao phấn cận noãn Fis < 0 (- 0,244 và - 0,052, tương ứng) và xuất hiện alelle hiếm (Ap) (0,222 và 0,333, tương ứng). Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh tùng với chỉ thị SSR chia thành hai nhánh chính có mức độ tương đồng di truyền dao động từ 65% (Cpm31 và Cpm32) đến 100% (Cpm16 và Cpm17, Cpm21 và Cpm22). Thông qua kết quả phân tích phân tử cho thấy loài Đỉnh tùng cần có chiến lược sớm để bảo tồn loài ở mức quần thể. Từ khóa: Allele hiếm, Cephalotaxus mannii, đa dạng di truyền quần thể, SSR, Tây Nguyên MỞ ĐẦU Tây Nguyên được xem là cái nôi cho nhiều loài lá kim của Việt Nam. Hầu hết chúng là những loài lá kim có giá trị khoa học và kinh tế cao. Nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng, trong đó có loài Đỉnh tùng. Theo Nguyễn Tiến Hiệp ở Việt Nam loài phân bố ở một số vùng núi từ Bắc vào Nam (Điện Biên, Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Tuyên Quang, Hà Nội, Hòa Bình, Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng và Ninh Thuận) tuy nhiên số lượng cá thể vô cùng ít ỏi (Phan Kế Lộc et al., 2013). Theo Quỹ Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2015 (Liao, Yang, 2013), Đỉnh tùng (toàn cầu) được xếp vào bậc sắp nguy cấp (VU A2cd), theo đánh giá của Phan Kế Lộc et al., 2013 thì Đỉnh tùng của Việt Nam được xếp ở thứ hạng sắp bị tuyệt chủng VU A4acd, B1,2ab, C. Hầu hết các nghiên cứu trước đây mới chỉ tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và nơi phân bố, còn nghiên cứu đa dạng di truyền cho loài Đỉnh tùng ở Tây Nguyên thì hầu như chưa có. Trong số các kỹ thuật phân tử thì kỹ thuật SSR được xem có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây trồng, trong đó có cả một số loài lá kim trên thế giới và Việt Nam (Arif et al., 2009; Isshiki et al., 2008; Yang et al., 2005; Zhang et al., 2005). Xuất phát từ các cơ sở khoa học trên đây, công trình này trình bày kết quả nghiên cứu “Thông số về tính đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Đỉnh tùng ở Tây Nguyên, Việt Nam bằng chỉ thị SSR” làm cơ sở cho việc đề xuất giải pháp bảo tồn, sử dụng và phát triển bền vững tính đa dạng sinh học ở Tây Nguyên nói riêng và Việt Nam nói chung. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Ba mươi tư mẫu lá hoặc vỏ thân (mỗi mẫu là một cá thể, chiều cao từ > 0,5 m đến 20 m) thu tại Tà Nung và Hiệp An tỉnh Lâm Đồng được sử dụng để phân tích phân tử. Các mẫu được bảo quản trong túi nhựa dẻo có chứa silicagel ngay tại thực địa và chuyển đến phòng thí nghiệm giữ ở nhiệt độ phòng Đinh Thị Phòng et al. 246 đến khi sử dụng. Thông tin của các mẫu nghiên cứu như trong bảng 1. Trình tự 18 chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) trong nghiên cứu được khai thác từ các tài liệu (Bảng 2). Tổng hợp các mồi SSR bởi công ty IDT, Hoa Kỳ (Intergarated DNA Technology, USA). Bảng 1. Thông tin của các mẫu Đỉnh tùng sử dụng trong nghiên cứu phân tử. Quần thể Địa điểm Số mẫu Ký hiệu mẫu Tọa độ Vĩ độ (◦N) Kinh độ (◦E) Độ cao (so mặt nước biển) (m) Tà Nung Tà Nung, Đà Lạt, Lâm Đồng 5 Cpm1- Cpm5 11° 56’ 01.3” 108° 23’ 12.5” 1364 Hiệp An Hiệp An, Đức Trọng, Lâm Đồng 29 Cpm6 - Cpm34 11° 50’ 13.3” 108° 25’ 37.5” 1392 Bảng 2. Trình tự nucleotide và nhiệt độ gắn mồi của 18 chỉ thị SSR. Chỉ thị Trình tự Tài liệu tham khảo Nhiệt độ bắt cặp (oC) 1 CO4 5’ TCAGGCTTTAGATCTTGGAATGT 3’ 3’ GTGGTGGGAGTTCGGAGTTTT 5’ Miao et al., 2012 52 2 CO7 5’ GAGGAGGTTCAAGGTGGTCT 3’ 3’ CCCACTTCCTCCAGCAATAC 5’ Miao et al., 2012 52 3 CO15 5’ TCCAAGGATGCACATTCAAT 3’ 3’ AAACAAAACCTCACTCAATGAA 5’ Miao et al., 2012 54 4 CO17 5’ ACCTAAGGGTGCTTGGAGATA 3’ 3’ GATGATGACACCTGTTATGCC 5’ Miao et al., 2012 53 5 CT08 5’ TTTATGAGTTCAAGAGGAGTATGT 3’ 3’ TGAGTAAGGGCGTAGCAG 5’ Pan et al., 2011 51 6 Pt15169 5’ CTTGGATGGAATAGCAGCC 3’ 3’ GGAAGGGCATTAAGGTCATTA 5’ Vendramin et al., 1996 53 7 Pt26081 5’ CCCGTATCCAGATATACTTCCA 3’ 3’ TGGTTTGATTCATTCGTTCAT 5’ Vendramin et al., 1996 52 8 Pt36480 5’ TTTTGGCTTACAAAATAAAAGAGG 3’ 3’ AAATTCCTAAAGAAGGAAGAGCA 5’ Vendramin et al., 1996 53 9 Pt71936 5’ TTCATTGGAAATACACTAGCCC 3’ 3’ AAAACCGTACATGAGATTCCC 5’ Vendramin et al., 1996 54 10 Pt110048 5’ TAAGGGGACTAGAGCAGGCTA 3’ 3’ TTCGATATTGAACCTTGGACA 5’ Vendramin et al., 1996 50 11 PtTX3020 5’ GTCGGGGAAGTGAAAGTA 3’ 3’ CTAGGTGCAAGAAAAGAGTAT 5’ Elsik et al., 2000 51 12 PtTX3030 5’ AATGAAAGGCAAGTGTCG 3’ 3’ GAGATGCAAGATAAAGGAAGTT 5’ Elsik et al., 2000 53 13 PtTX3034 5’ TCAAAATGCAAAAGACG 3’ 3’ ATTAGGACTGGGGATGAT 5’ Elsik et al., 2000 53 14 PtTX3037 5’ CGTTTGGAGCACTACTT 3’ 3’ AAGTCACTTAATGCAATATGTA 5’ Elsik et al., 2000 52 15 Pinus02 5’ GTCCCTGGCTTGCAGACTAT 3’ 3’ ACACACACACACAGAGAGAGAG 5’ Hung et al., 2012 55 16 ITPH4516 5’ TGATGCAAACAAGTTCCATG 3’ 3’ AGCACTCGCTAAACTATGAAGG 5’ Mariettea et al., 2011 54 17 PRE13 5’ GATGTGTCTTTAGGCTCGTTGC 3’ 3’ AGGGTTAGTAATCACGGCCTGT 5’ Boys et al., 2005 52 18 RPS2 5’ CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA 3’ 3’ TGGAGGCTATCACGTATGCACC 5’ Echt et al., 1996 51 Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 245-252, 2016 247 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số được tách chiết và làm sạch theo phương pháp của Porebski và đồng tác giả (1997). Kiểm tra độ sạch trên gel agarose 0,9% và đo nồng độ DNA tổng số trên máy UVS 2700, Labomed, Hoa Kỳ. Phản ứng PCR_SSR và phân tích số liệu: Phản ứng nhân gen được thực hiện trên máy PCR system 9700 (Hoa Kỳ) với tổng thể tích 25 µl. Thành phần của phản ứng, chu trình nhiệt và phân tích một số thông số về tính đa dạng di truyền như trong công bố của Trần Thị Liễu và đồng tác giả (2015) và Đinh Thị Phòng và đồng tác giả (2014). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đa dạng di truyền Mười tám chỉ thị SSR đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho 34 mẫu Đỉnh tùng thuộc 2 quần thể thu ở Lâm Đồng thì có 12 chỉ thị thể hiện tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu. Tổng số đã nhân bản được 36 phân đoạn, trong đó có 24 phân đoạn đa hình (chiếm 66,67%). Các phân đoạn nhân bản được có kích thước trong khoảng từ 100 đến 500 bp. Giá trị trung bình hàm lượng thông tin đa hình (PIC) và đa dạng gen trong một locus (Hj) là 0,170 và 0,186, tương tứng, trong đó chỉ thị Pt71936 có hàm lượng thông tin đa hình cao nhất (0,461) và chỉ thị ITPH4516 có giá trị đa dạng gen trong một locus cao nhất (0,457) (Bảng 3). Kết quả điện di sản phẩm PCR của 34 mẫu Đỉnh tùng với chỉ thị PtTX3020 và Pt71936 đại diện cho 18 chỉ thị SSR được thể hiện trong Hình 1. Các thông số di truyền của quần thể Đỉnh tùng được phân tích ở cả mức độ quần thể và loài đã chỉ ra quần thể Đỉnh tùng ở Hiệp An có tính đa dạng di truyền cao hơn (h = 0,269; I = 0,449 và PPB = 72,22%) so với quần thể Tà Nung (h = 0,264; I = 0,433 và PPB = 66,67%) (Bảng 4). Hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) ở quần thể Hiệp An (0,308) cao hơn so với quần thể Tà Nung (0,306), trong khi đó hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) ở quần thể Tà Nung lại cao hơn so với quần thể Hiệp An (0,411 so với 0,330). Điều này cho phép nhận định quần thể Đỉnh tùng ở Hiệp An bị thiếu hụt gen dị hợp tử. Số alelle hiếm (Ap) đã tìm thấy cả trong hai quần thể Tà Nung (Ap = 0,222) và Hiệp An (Ap = 0,333). Ở mức độ quần thể, chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon (I) và theo Nei (h) của quần thể Đỉnh tùng là 0,441 và 0,266, tương ứng. Mức đa dạng này cao hơn so với loài Pinus krempfii ở Tây Nguyên (I = 0,377; h = 0,137), loài C. koreana của Hàn Quốc (I = 0,344) (Đinh Thị Phòng et al., 2014; Hong et al., 2014). Hệ số gen dị hợp tử của quần thể Đỉnh tùng của Tây Nguyên ở mức trung bình (He = 0,307; Ho = 0,370) và thấp hơn khi so sánh với loài C. oliveri của Trung Quốc (He =0,604; Ho = 0,538 đối với quần thể ở Quảng Châu), (He =0,566; Ho = 0,583 đối với quần thể ở Vân Nam) và (He =0,533; Ho = 0,588 đối với quần tể ở Giang Tây) (Miao et al., 2012). Tuy nhiên, khi so sánh mức độ dị hợp tử (He) giữa một số loài lá kim trong chi Cephalotaxus cho thấy, loài Đỉnh tùng C. mannii (He = 0,307) ở Tây Nguyên, Việt Nam cao hơn so với loài C. mannii (He = 0,135) và loài C. oliveri (He = 0,118) của Trung Quốc, loài C. koreana của Hàn Quốc (He = 0,224) (Xiang et al., 2001; Chen et al., 2003; Hong et al., 2014) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 500 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 500 bp A B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 200 bp 500 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 00 bp 300 bp 200 bp 100 bp 500 bp A B B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 200 bp 1 500 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 500 bp A B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 2 100 bp 500 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 500 bp A B A Hình 1. Sản phẩm PCR-SSR của 34 mẫu Đỉnh tùng với chỉ thị PtTX3020 (A) và Pt71936 (B) trên gel polyacrylamide 6% (giếng 1 - 34 thứ tự sắp xếp của các mẫu Đỉnh tùng từ Cpm1 – Cpm34), M: marker phân tử 100 bp). Đinh Thị Phòng et al. 248 Bảng 3. Giá trị PIC, đa dạng gen trong một locus và tỷ lệ phân đoạn đa hình của 34 mẫu Đỉnh tùng phân tích với chỉ thị SSR. TT Chỉ thị Kích thước (bp) PIC Phân đoạn đa hình Phân đoạn đồng hình Tổng số phân đoạn % phân đoạn đa hình Đa dạng gen trong một locus (Hj) 1 CO4 180 - 270 0,000 0 2 2 0 0,000 2 CO7 150 - 175 0,216 1 1 2 50 0,219 3 CO15 250 - 250 0,000 0 1 1 0 0,000 4 CO17 295 - 295 0,000 0 1 1 0 0,000 5 CT08 320 - 480 0,216 1 1 2 50 0,219 6 Pt15169 400 - 450 0,259 2 0 2 100 0,450 7 Pt26081 250 - 300 0,262 2 0 2 100 0,431 8 Pt36480 300 - 300 0,000 0 1 1 0 0,000 9 Pt71936 140 - 180 0,461 4 0 4 100 0,285 10 Pt110048 100 - 100 0,000 0 1 1 0 0,000 11 PtTX3020 185 - 195 0,419 3 0 3 100 0,367 12 PtTX3030 200 - 240 0,000 0 2 2 0 0,000 13 PtTX3034 100 - 105 0,351 1 1 2 50 0,080 14 PtTX3037 260 - 305 0,278 3 0 3 100 0,300 15 Pinus02 350 - 500 0,273 1 1 2 50 0,163 16 ITPH4516 290 - 305 0,196 2 0 2 100 0,457 17 PRE13 115 - 160 0,070 2 0 2 100 0,208 18 RPS2 195 - 210 0,051 2 0 2 100 0,166 Tổng 3,052 24 12 36 - 3,345 Trung bình 0,170 1,333 0,667 2 66,67 0,186 Xem xét ở khía cạnh giao phấn (Fis) trong quần thể đạt giá trị trung bình là - 0,148 (Fis = - 0,244 ở Tà Nung và Fis = - 0,052 ở Hiệp An) (Bảng 4). Điều này cho thấy khả năng giao phấn chéo tương đối cao trong cả 2 quần thể. Để có thêm cơ sở đánh giá đa dạng di truyền quần thể Đỉnh tùng, chúng tôi cũng đã quan tâm đến kết quả phân tích các thông số di truyền cho từng chỉ thị SSR. Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 5 cho thấy, mức độ di nhập gen (Nm) trong quần thể Đỉnh tùng khi phân tích với các chỉ thị SSR tương đối cao, dao động từ 0,500 (chỉ thị PtTX3034) đến 17,813 (chỉ thị ITPH4516), trung bình 3,310. So sánh với loài Pinus krempfii ở Tây Nguyên, Việt Nam cho thấy mức độ di nhập gen của loài Đỉnh tùng cao hơn (3,310 so với 2,315, tương ứng) (Đinh Thị Phòng et al., 2014). Cấu trúc di truyền Phân tích mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể và giữa các cá thể Đỉnh tùng đối với chỉ thị SSR chỉ ra, tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (27,74%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (72,26%) với giá trị P < 0,001 (Bảng 6). Cho đến nay, chưa có công bố nào về mức độ đa dạng di truyền của quần thể Đỉnh tùng ở Việt Nam. Trong nghiên cứu của Du et al., 2002, Xiang et al., 2001 cũng mới chỉ ra tính đa dạng di truyền của quần thể C. mannii ở Trung Quốc nhưng chưa nghiên cứu mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể. Tuy nhiên, khi so sánh loài Đỉnh tùng ở Việt Nam với loài C. koreana ở Hàn Quốc (Hong et al., 2014) cho thấy mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể cao hơn (27,74% so với 13,9%, tương ứng) Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 245-252, 2016 249 và giữa các cá thể trong quần thể là thấp hơn (72,26% so với 86,1%, tương ứng). Thông qua kết quả phân tích tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (27,74%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (72,26%) của loài loài Đỉnh tùng ở Tây Nguyên đã cho thấy mức độ bảo thủ rất cao trong hệ gen của loài. Đây chính là yếu tố di truyền của bất kỳ một loài sinh vật nào đó. Mức độ thay đổi phân tử cao giữa các cá thể trong quần thể của loài Đỉnh tùng ở Tây Nguyên là tín hiệu tốt cho việc bảo toàn tính đa dạng di truyền. Khía cạnh này cũng được phản ánh khi phân tích các thông số di truyền như hệ số di nhập gen Nm, Fis, trong bảng 4 và bảng 5. Bảng 4. Một số thông số di truyền của quần thể Đỉnh tùng phân tích với chỉ thị SSR Quần thể N Na Ne I Ho He h PPB (%) Ap Fis Tà Nung 5 1,667 1,574 0,433 0,411 0,306 0,264 66,67 0,222 -0,244 Hiệp An 29 1,778 1,585 0,449 0,330 0,308 0,269 72,22 0,333 - 0,052 Trung bình 17 1,722 1,580 0,441 0,370 0,307 0,266 69,45 0,277 - 0,148 Loài 34 2,0 1,627 0,496 0,342 0,326 0,291 77,78 - - Ghi chú: N: Số mẫu; Na: Số alelle quan sát trung bình; Ne: Số alelle hiệu quả; I: Chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon; Ho và He: Hệ số gen di hợp tử quan sát và mong đợi; h: Chỉ số đa dạng di truyền theo Nei; PPB: Phần trăm phân đoạn đa hình; Ap: Số alelle hiếm trên một locus; Fis: Hệ số giao phấn cận noãn với p < 0,05. Bảng 5. Một số thông số di truyền của quần thể Đỉnh tùng phân tích với từng chỉ thị SSR. Chỉ thị Na Ne I Ho He Fis Fst Nm CO4 2,00 2,000 0,693 1,000 0,500 -1 0 - CO7 2,00 1,497 0,490 0,421 0,316 -0,331 0,048 4,916 CO15 1,00 1,000 0,000 0,000 0,000 - - - CO17 1,00 1,000 0,000 0,000 0,000 - - - CT08 2,00 1,518 0,506 0,438 0,329 -0,331 0,038 6,261 Pt15169 1,50 1,471 0,339 0,069 0,243 0,716 0,261 0,708 Pt26081 1,50 1,471 0,339 0,069 0,243 0,716 0,261 0,708 Pt36480 1,00 1,000 0,000 0,000 0,000 - - - Pt71936 2,50 1,907 0,739 0,490 0,471 -0,040 0,092 2,482 Pt110048 1,00 1,000 0,000 0,000 0,000 - - - PtTX3020 2 1,951 0,680 0,269 0,487 0,448 0,157 1,341 PtTX3030 2,00 2,000 0,693 1,000 0,500 -1,000 0,000 - PtTX3034 1,50 1,500 0,347 0,100 0,250 0,600 0,333 0,500 PtTX3037 2,00 1,989 0,690 0,845 0,497 -0,699 0,219 0,893 Pinus02 2,00 1,329 0,397 0,286 0,239 -0,199 0,026 9,220 ITPH4516 2,00 1,960 0,683 0,503 0,490 -0,028 0,014 17,813 PRE13 2,00 1,891 0,664 0,762 0,471 -0,618 0,057 4,160 RPS2 2,00 1,951 0,680 0,414 0,487 0,151 0,023 10,585 Trung bình 1,72 1,580 0,441 0,370 0,307 -0,115 0,109 3,310 Ghi chú: Na: Số alelle quan sát trung bình; Ne: Số alelle hiệu quả; I: Chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon; Ho và He: Hệ số gen di hợp tử quan sát và mong đợi; h: Chỉ số đa dạng di truyền theo Nei; PPB: Phần trăm phân đoạn đa hình; Ap: Số alelle hiếm trên một locus; Fis: Hệ số giao phấn cận noãn với p < 0,05; Fst: Hệ số khác biệt di truyền; Nm: Hệ số di nhập gen. Bảng 6. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Đỉnh tùng phân tích với chỉ thị SSR Nguồn biến thiên Bậc tự do Tổng bình phương Thành phần biến đổi Tổng sự biến đổi (%) Giá trị P Giữa các quần thể 1 22,384 2,010 27,74 < 0,001 Giữa các cá thể trong quần thể 32 167,586 5,237 72,26 Đinh Thị Phòng et al. 250 Khoảng cách di truyền và phân nhóm Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh tùng với chỉ thị SSR (Hình 2) chia thành hai nhánh chính I và II riêng biệt có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 65 (Cpm31 và Cpm32) đến 100% (Cpm16 và Cpm17, Cpm21 và Cpm22). Trong đó nhánh chính I gồm 29 mẫu có nguồn gốc ở Hiệp An, có hệ số tương đồng di truyền trong khoảng từ 69 đến 100%. Nhánh chính II gồm 5 mẫu Cpm1, Cpm2, Cpm3, Cpm4 và Cpm5 có hệ số tương đồng di truyền trong khoảng từ 74,8 đến 96% và đều có nguồn gốc ở Tà Nung. Theo kết quả điều tra thực địa của chúng tôi cho thấy cả 2 quần thể Đỉnh tùng đều quá nhỏ về kích thước trong các mảnh rừng bị suy giảm, không quá 20 cá thể/quần thể. Thêm vào đó, qua khảo sát về khả năng tạo hạt, nảy mầm và phát triển tại hai quần thể Tà Nung và Hiệp An cho thấy tỷ lệ tạo hạt và tái sinh cây mạ rất cao, nhưng chỉ có một tỷ lệ rất thấp (19,4%) (số liệu không chỉ ra ở đây) trong số đó phát triển thành cây có chiều cao 1 m. Lý do mà cây mạ không phát triển thành cây là do rễ cây mạ không nhận được dinh dưỡng bởi các lớp hổng của các tầng mùn tự nhiên hình thành. Việc mất môi trường sống cũng là nguy cơ giảm quy mô quần thể. Vì vậy, mặc dù có tính đa dạng di truyền tương đối cao xong lại có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng (thuộc khung EN). Vì thế, việc bảo tồn và duy trì tính đa dạng di truyền của loài cần được các nhà nghiên cứu quan tâm sớm. KẾT LUẬN Tính đa dạng di truyền của quần thể Đỉnh tùng ở Hiệp An cao hơn (h = 0,269; I = 0,449 và PPB = 72,22%) so với quần thể Tà Nung (h = 0,264; I = 0,433 và PPB = 66,67%). Tổng mức thay đổi phân tử (AMOVA) tương đối thấp giữa các quần thể (27,74%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (72,26%). Mức độ tương đồng di truyền của loài Đỉnh tùng ở Tây Nguyên dao động từ 65 đến 100%. Hệ số di nhập gen (Nm) trong quần thể Đỉnh tùng tương đối cao, trung bình là 3,310. Cả hai quần thể đều có hiện tượng trao đổi chéo cao (giá trị Fis < 0) đồng nghĩa với việc giao phấn cận noãn rất thấp. Số alelle hiếm (Ap) đã tìm thấy cả trong hai quần thể Tà Nung (0,222) và Hiệp An (0,333) khi phân tích chỉ thị SSR. Thông qua hệ số Fis, sự xuất hiện của alelle hiếm (Ap) và tổng mức độ thay đổi của quần thể rõ ràng cho thấy tính đa dạng di truyền ở mức báo động, mặc dù có sự di nhập gen tương đối cao ở một số locus (ví dụ Nm = 17,813 đối với chỉ thị Hình 2. Biểu đồ hình cây theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA (A) và Biểu đồ phân nhóm (B) thể hiện mối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh tùng phân tích với 18 chỉ thị SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Hiệp An, b: mẫu ở Tà Nung). I II b a 66.9 75.9 88.6 51.1 95.3 96.8 61.8 A B T? a d ? 2 (2 5. 54 % ) T?a d? 1 (31.54%) Tà Nung Hi?p An Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 245-252, 2016 251 ITPH4516). Tuy nhiên việc mất môi trường sống và giảm đáng kể số lượng cá thể trong quần thể lại là nguy cơ dẫn đến sự tuyệt chủng của loài. Vì thế cần sớm có chiến lược bảo tồn ở mức cá thể và quần thể. Lời cảm ơn: Đây là một phần kết quả nghiên cứu của đề tài mã số TN3/T15 thuộc Chương trình Tây Nguyên 3. Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn các thành viên và các cơ quan địa phương ở Tây Nguyên đã tham gia thực hiện đề tài. TÀI LIỆU THAM KHẢO Arif M, Zaidi NM, Singh YP, Haq QMR, Singh US (2009) A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in Shisham (Dalbergia sissoo). Plant Mol Biol Rep 27: 488- 495. Boys J, Cherry M, Dayanandan S (2005) Microsatellite analysis reveals genetically distinct populations on red pine (Pinus resinosa, pinaceae). Amer J Bot 92(5): 833-841. Chen S, Sima Y, Fang B (2003) The genetic diversity of Cephalotaxus oliveri and its endangered causes. J Northwest Forestry Univ 18(2): 29-32 (Abstract in English). Du D, Su J, Fu Y, Zhou P, Ma W, Xiang Z (2002) Genetic diversity of Cephalotaxus mannii, a rare and endangered plant. Acta Botanica Sinica 44(2): 193-198 (Abstract in English). Đinh Thị Phòng, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Nguyễn Tiến Hiệp (2014) Đánh giá tính đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) ở Tây Nguyên, Việt Nam bằng chỉ thị SSR. Tạp chí Sinh học 36(2): 210-219. Echt CS, May-Marquardt P, Hseih M, Zahorchak R (1996) Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39: 1102-1108. Elsik CG, Minihan VT, Hall SE, Scarpa AM, Williams CG (2000) Low-copy microsatellite markers for Pinus taeda L. Genome 43: 550-555. Hong KN, Kim YM, Park YJ, Lee JW (2014) Genetic diversity and population genetic structure of Cephalotaxus koreana in South Korea. Korean J Plant Res 27(6): 660-670. Hung KH, Lin CY, Huang CC, Hwang CC, Hsu TW, Ku YL, Wang WK, Hung CY, Chiang TY (2012) Isolation and characterization of microsatellite loci from Pinus massoniana (Pinaceae). Botanical Studies 53: 191-196. Isshiki S, Iwata N, Khan MMR (2008) ISSR variations in eggplant (Solanum melongena L.) and related Solanum species. Scientia Hortic 117:186–190. Liao W, Yang Y (2013) Cephalotaxus mannii. The IUCN Red List of Threatened Species 2013: e.T18625568A2804770. Mariettea S, Chagnéa D, Decroocqa S, Vendraminb GG, Lalannea C, Madura D, Plomiona C (2001) Microsatellite markers for Pinus pinaster Ait. Ann For Sci 58: 203-206. Miao Y, Lang X, Li S, Su J, Wang Y (2012) Characterization of 15 polymorphic microsatellite loci for Cephalotaxus oliveri (Cephalotaxaceae), a conifer of medicinal importance. Int J Mol Sci 13: 11165-11172. Pan HW, Guo YR, Su YJ, Wang T (2011) Development of microsatellite loci for Cephalotaxus oliveri (Cephalotaxaceae) and cross-amplification in Cephalotaxus. Amer J Bot e229-e232. Phan Kế Lộc, Phạm Văn Thế, Nguyễn Sinh Khang, Nguyễn Thị Thanh Hương, Averyanov LV (2013) Trích yếu được cập nhật hóa Thông mọc tự nhiên ở Việt Nam. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 135- 143. Porebski S, Bailey LG, Baum BR (1997) Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plan Mol Biol Rep 15(1): 8-15. Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Tiến Hiệp, Đinh Thị Phòng (2015) Tính đa dạng nguồn gen di truyền và cấu trúc quàn thể loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) – loài đặc hữu hẹp ở Tây Nguyên, Việt Nam bằng chỉ thị ISSR. Vendramin GG, Lelli L, Rossi P, Morgante M (1996) A set of primers for the amplification of 20 chloplast microsatellites in Pinaceae. Mol Ecol 5: 595-598. Xiang Z, Liu Y, Du D (2001) Genetic diversity and population differentiation of Cephalotaxus mannii Hk.f. populations. J Wuhan Botanical Res 19(3): 220-224 (Abstract in English). Yang CP, Wei L, Jiang J, Liu GF, Zhao GY (2005) Analysis of genetic diversity for nineteen populations of Pinus sibirica Du Tour with technique of ISSR. J Northeast For Univ 33: 1-3. Zhang ZY, Chen YY, Li DZ (2005) Detection of low genetic variation in a critically endangered Chinese pine, Pinus squamata, using RAPD and ISSR markers. Biochem Genet 43: 239-249. Đinh Thị Phòng et al. 252 GENETIC DIVERSITY IN NATURAL POPULATIONS OF (CEPHALOTAXUS MANNII HOOK. F.) IN TAY NGUYEN, VIETNAM BASE ON SSR MARKERS Dinh Thi Phong*, Tran Thi Lieu, Vu Thi Thu Hien Vietnam National Museum of Nature, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Cephalotaxus mannii Hook.f. is one of 15 species of conifer in the Central Highlands. Cephalotaxus mannii is a scarce medicinal conifer endemic to the south central region of China and Vietnam. In Vietnam, although widely distributed species (Lao Cai, Ha Giang, Thanh Hoa, Nghe An, Thua Thien Hue, Kon Tum, Gia Lai, Lam Dong...) but is considered rare and vulnerable by the indiscriminately exploitation of people. In this study, 18 SSR markers were used to analyze the genetic diversity of 34 individuals C. mannii collected in Ta Nung and Hiep An of Lam Dong province. The results showed 12/18 polymorphic markers. Among 36 DNA amplified fragments, 24 were polymorphic (66.66%). Genetic diversity in Hiep An population (h = 0.269; I = 0.449 and PPB = 72.22%) was higher than that of Ta Nung (h = 0.433; I = 0.264 and PPB = 66.67%). The total level of molecular variance (AMOVA) among populations was 27.74% and among individuals within the populations was 72.26%. The average of gene flow value (Nm) of the species C. mannii populations was 3,310. Both Ta Nung and Hiep An populations had Wright’s inbreeding coefficient Fis <0 (- 0.244, - 0.052, respectively) and the private allele (Ap) (0.222, 0.333, respectively). A dendrogram constructed based on similarity matrix of 34 C. mannii samples divided into two main groups with their genetic similarity coefficient ranged from 65% (Cpm31 and Cpm32) to 100% (Cpm16 and Cpm17, Cpm21 and Cpm22). Molecular analysis results showed that C. mannii species should be protected at the population level. Keywords: Private allele, Cephalotaxus mannii, population genetic diversity, SSR, Tay Nguyen * Authors for correspondence: Tel: +84-4-39941215; E-mail: dinhthiphong@hotmail.com