Thiết kế vector mang gen OPHC2 phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu
Dựa trên trình tự gen mã hóa enzyme OPHC2
của P.pseudoalcaligenes, chúng tôi đã tối ƣu
mã biểu hiện trong thực vật và tổng hợp đƣợc
gen OPHC2opt. Cấu trúc gen OPHC2optcmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế vào vector
chuyển gen pBI121. Đây là nguồn vật liệu để
sử dụng chuyển gen vào thực vật, nhằm nâng
cao khả năng phân hủy thuốc trừ sâu Mep gây
ô nhiễm môi trƣờng.
6 trang |
Chia sẻ: yendt2356 | Lượt xem: 459 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Thiết kế vector mang gen OPHC2 phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64
59
THIẾT KẾ VECTOR MANG GEN OPHC2 PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN
PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU
Lê Văn Sơn1, Nguyễn Vũ Thanh Thanh2*, Nguyễn Mạnh Cƣờng2
1 Viện Công nghệ sinh học
2 Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên
TÓM TẮT
Organophosphorus (OP) là một chất có nhiều trong các loại thuốc trừ sâu hiện đang đƣợc dùng rộng
rãi trên thị trƣờng và nó gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Enzyme organophosphorus hydrolase
(OPHC2) của một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy chất OP. Một số công trình nghiên cƣ́u đã sƣ̉
dụng gen mã hóa enzyme OPHC2 để biến nạp, biểu hiện trong cây thuốc lá và tạo ra cây chuyển gen
kháng đƣợc thuốc trừ sâu methyl parathion (Mep)-một loại OP. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày
kết quả tối ƣu trình tự gen OPHC2 biểu hiện trong thực vật và thiết kế vector chuyển gen mang cấu
trúc 35S-OPHC2opt-cmyc-KDEL-NOS (pBIN121/OPHC2). Vector này đã chuyển vào chủng vi
khuẩn A. tumefaciens CV58 và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Đây là cơ sở để tạo cây
chuyển gen mang gen OPHC2 để phân hủy thuốc trừ sâu Mep tồn dƣ trong môi trƣờng.
Từ khóa: Agrobacterium, OPHC2, Organophosphorus hydrolase, vector chuyển gen.
MỞ ĐẦU*
Việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật
trong sản xuất nông nghiệp đang là một trong
những nhân tố gây ô nhiễm môi trƣờng đất ở
nhiều khu vực sản xuất nông nghiệp ảnh
hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con
ngƣời và cây trồng (Wauchope, 1978;
Kawahigashi, 2009). Nhiều nghiên cứu đã
cho thấy việc sử dụng cây trồng để loại bỏ các
chất ô nhiễm từ môi trƣờng đất và nƣớc mang
lại rất nhiều ƣu điểm so với các phƣơng pháp
xử lý truyền thống. Các chất ô nhiễm thƣờng
đƣợc hấp thụ vào cây thông qua rễ và lá và
đƣợc chuyển hóa thành các chất không có hại
và tích lũy trong mô của cây (Salt et al., 1998)
hoặc cây trồng tiết ra các loại enzyme giúp
phân hủy chất ô nhiễm trong môi trƣờng đất.
Organophosphorus (OP) là một chất có trong
thuốc trƣ̀ sâu hiện đang đƣợc dùng rộng rãi trên
thị trƣờng nông nghiệp (Singh et al ., 2006;
Karpouzas et al., 2006) và đang làm ô nhiễm
môi trƣờn g nghiêm trọng (Kawahara et al .,
2005; Konstantinou et al., 2006; Pagliuca et al.,
2006; Bondarenko et al ., 2004; Qian et al .,
2006). Enzyme organophosphorus hydrolase
(OPH) của một số loài vi khuẩn có khả năng
phân hủy chất OP (Wu et al., 2004; Amaya-
*
Tel: 0912 664 126; Email: thanhthanhdhkhtn@gmail.com
Chavez et al., 2006). Đã có một số nghiên cƣ́u
sƣ̉ dụng gen mã hóa enzyme OPH để biến nạp
và biểu hiện trong cây thuốc lá . Kết quả phân
tích cho thấy, cây thuốc lá chuyển gen đã sản
xuất ra enzyme OPH trong môi trƣờng nuôi
cấy. Cây chuyển gen kháng đƣợc thuốc trƣ̀ sâu
methyl parathion (Mep)-một loại OP (Wang et
al., 2008).
Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả
tổng hợp gen mã hóa enzyme OPHC2
(OPHC2opt) đƣợc tối ƣu biểu hiện trong thực
vật và thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc
gen OPHC2opt. Đây là cơ sở cho tạo cây
chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu Mep tồn dƣ
trong môi trƣờng hiện nay.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Gen OPHC2 và mồi (primer) đặt từ hãng
Epochlifescience (Mỹ) tổng hợp.
Chủng E.coli DH5α, Agrobacterium CV58 và
vector pBI121 do phòng Công nghệ tế bào-
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Tách DNA, plasmid và tinh sạch đƣợc thực
hiện dựa theo phƣơng pháp của Sambrook
(1989) hoặc kít tách plasmid của QIAGEN
Thu đoạn DNA mong muốn từ gel agarose
với kít thôi gel QIAquick (QIAGEN).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64
60
Các phƣơng pháp trong sinh học phân tử nhƣ
cắt bằng enzyme cắt giới hạn, ghép nối gen
đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của
Sambrook (2001).
Biến nạp plasmid vào trong E.coli dựa theo
phƣơng pháp biến nạp bằng sốc nhiệt (Cohen,
1972), vào Agrobacterium bằng phƣơng pháp
xung điện.
Trình tự DNA đƣợc xác định trên máy đọc
trình tự tự động ABI PRIMS® 3100 Avant
Genetic Analyzer bằng cách sử dụng bộ hoá
chất sinh chuẩn BigDye® Terminor v3.1
Cycle Sequencing -Viện Công nghệ Sinh học.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tối ƣu và tổng hợp gen OPHC2 biểu hiện
trong thực vật:
Hình 1. So sánh trình tự gen OPHC2 của P.pseudoalcaligenes (OPHC2) và OPHC2 đã sửa đổi
(OPHC2opt)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64
61
MAAPAQQKTQVPGYYRMALGDFEVTALYDGYVDLPASLLKGIDDKDLQSLLARMFVASEKGVQTAVNAYL
INTGDNLVLI
DTGAAQCFGPTLGVVQTNLKASGYQPEQVDTVLLTHLHPDHACGLVNADGSPAYPNATVEVPQAEAEFWLD
EATMAKAPE
GMQGMFKMAQQAVAPYAKMNKLKPYKTEGELLPGVSLVASPGHTPGHTSYLFKSGGQSLLVWGDILLNHA
VQFAKPEVVF
EFDVDSDQARQSRQRILAEAATDKLWVAGAHLPFPGLGHVRKEAQGYAWVPVEFSPIRSDR.
Hình 2. Trình tự amino acid của protein OPHC2
Mỗi amino acid đƣợc mã hóa bởi các bộ ba
nucleotide khác nhau. Mức độ biểu hiện của
mỗi bộ ba trong từng đối tƣợng, từng loài rất
khác nhau. Cùng một amino acid, có những
bộ ba biểu hiện trong vi khuẩn mức độ cao
nhƣng trong thực vật lại biểu hiện ở mức độ
thấp và ngƣợc lại (Kawabe và Miyashita,
2003; Streatfield, 2007). Do vậy, để biểu hiện
protein cao trong cây trồng cần phải tối ƣu mã
bộ ba phù hợp. Mức biểu hiện protein cao là
vấn đề đƣợc nhiều công trình nghiên cứu, ứng
dụng và cho kết quả tốt (Fennoy và cs, 1993;
Laguía-Becher và cs, 2010; Jabeen và cs,
2010). Dựa vào trình tự của gen OPHC2 (kích
thƣớc 906 bp) phân lập từ chủng
Pseudomonas pseudoalcaligenes trên NCBI
với mã số AJ605330, chúng tôi đã thiết kế
mồi để nhân gen OPHC2, trình tự gen
OPHC2 đƣợc sửa đổi để biểu hiện tối ƣu
trong thực vật (hình 1).
Amino acid của OPHC2 opt có kích thƣớc và
trình tự không thay đổi với enzyme OPHC2
của P.pseudoalcaligenes (hình 2).
Trình tự gen bị thay đổi nhằm tăng khả năng
biểu hiện trong cây trồng, song trình tự
protein OPHC2 vẫn giữ nguyên nhƣ ban đầu,
do vậy hoạt tính protein không thay đổi, tính
chất phân hủy chất OP vẫn đƣợc giữ nguyên.
Khi OPHC2opt biểu hiện trong hệ thống tế
bào thực vật, để giúp cho protein đƣợc hoàn
thiện cấu trúc, hoạt tính, chúng tôi bổ sung
thêm một peptid tín hiệu KDEL và một đoạn
nhận biết c-myc (hình 4).
Để đảm bảo sự chính xác trình tự gen tối ƣu,
OPHC2opt đã đƣợc tổng hợp nhân tạo bởi
Công ty Epochlifescience (Mỹ). Cấu trúc này
đã đƣợc ghép trong vector tách dòng
pBluescript II SK(-).
Sau khi nhận đƣợc pBluescript II SK(-)
/OPHC2opt, chúng tôi đã tiến hành biến nạp
và nhân trong E.coli, sau đó kiểm tra cắt thử
vector bằng enzyme BamHI/SacI. Kết quả thu
đƣợc có 2 đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1
kb và 3 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc của gen
OPHC2opt và vector pBluescript II SK(-)
(hình 3).
Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt
pBluescript II SK(-)/OPHC2opt bằng BamHI/SacI
M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2: sản phẩm
cắt vector pBluescriptIISK(-)/OPHC2opt
Gen OPHC2opt cũng đã đƣợc kiểm tra lại
trình tự, kết quả thu đƣợc giống với cấu trúc
đã thiết kế, trình tự gen đã đƣợc tối ƣu mã bộ
ba theo yêu cầu ban đầu. Đây là cơ sở cho
thiết kế vector chuyển gen.
Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã
hóa cho OPHC2opt
Để thiết kế vector chuyển gen, plasmid
pBluescriptII SK(-)/OPHC2opt đƣợc cắt đồng
thời bằng 2 enzyme BamHI/SacI. Cấu trúc
OPHC2opt-cmyc-KDEL thu đƣợc có kích
thƣớc khoảng 1,0 kb (hình 4). Đồng thời
vector chuyển gen pBI121 có chứa promoter
35S cũng đƣợc cắt bởi 2 enzyme tƣơng ứng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64
62
BamHI/SacI. Cấu trúc OPHC2opt-cmyc-
KDEL và vector pBI121 mở vòng đƣợc thu
lại và tinh sạch khỏi agarose. Sau đó 2 sản
phẩm đƣợc ghép nối vào nhau bằng enzyme
T4 ligase.
Hình 4. Cấu trúc gen chuyển trong vector pBI121
Sản phẩm lai này đƣợc biến nạp vào E.coli
DH5 và đƣợc chọn lọc dòng biến nạp bằng
kháng sinh Kanamicine.
Các dòng biến nạp đƣợc kiểm tra bằng cách
tách chiết plasmid, sau đó PCR với cặp mồi
đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R và cắt bởi
enzyme hạn chế BamHI/SacI (hình 3).
Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A) và
cắt vector tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt (B)
M: thang DNA chuẩn 1 kb;
1-2 (A): sản phẩm PCR nhân gen
OPHC2opt với cặp mồi đặc hiệu
1-2 (B): sản phẩm cắt các dòng vector
tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt bằng enzyme
giới hạn
Hình 5 cho thấy sản phẩm PCR có kích thƣớc
khoảng 1,0 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc
cấu trúc gen OPHC2opt-cmyc-KDEL. Trên
hình ảnh điện di cắt vector tái tổ hợp bằng
enzyme giới hạn chúng tôi thu đƣợc có 2
băng kích thƣớc khoảng 1,0 kb và 12 kb
tƣơng ứng với cấu trúc OPHC2opt-cmyc-
KDEL và vector pBI121. Nhƣ vậy, cấu trúc
OPHC2opt-cmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế
thành công vào vector chuyển gen pBI121.
Tạo chủng Agrobacterium mang vector
pBI121/OPHC2opt
Vector pBI121/OPHC2opt đã đƣợc chuyển
vào chủng Agrobacterium CV58 bàng
phƣơng pháp xung điện và đƣợc chọn lọc trên
môi trƣờng chứa kháng sinh Rifamicine và
Kanamicine.
Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ chủng
Agrobacterium đã biến nạp pBI121/OPHC2opt
M: thang DNA chuẩn 1 kb; +: đối chứng
dương (plasmid pBI121/OPHC2opt); -: đối
chứng âm (nước); 1-4: các dòng
Agrobacterium biến nạp
Các khuẩn lạc mang vector chuyển gen đƣợc
kiểm tra bằng PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
OPHC2-F/OPHC2-R. Điện di sản phẩm PCR
cho thấy, vi khuẩn Agrobacterium đã mang
vector tái tổ hợp (hình 6). Kết quả này cho
thấy, chúng tôi đã biến nạp thành công vector
pBI121/OPHC2opt vào Agrobacterium.
KẾT LUẬN
Dựa trên trình tự gen mã hóa enzyme OPHC2
của P.pseudoalcaligenes, chúng tôi đã tối ƣu
mã biểu hiện trong thực vật và tổng hợp đƣợc
gen OPHC2opt. Cấu trúc gen OPHC2opt-
cmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế vào vector
chuyển gen pBI121. Đây là nguồn vật liệu để
sử dụng chuyển gen vào thực vật, nhằm nâng
cao khả năng phân hủy thuốc trừ sâu Mep gây
ô nhiễm môi trƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64
63
Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện trong
khuôn khổ đề tài cấp Viện Công nghệ sinh
học “Nghiên cứu phương pháp tạo cây xoan
ta (Melia azedarach Lin) chuyển gen OPHC2
nhằm ứng dụng trong xử lý ô nhiễm thuốc
bảo vệ thực vật”. Các thí nghiệm được tiến
hành có sử dụng trang thiết bị của Phòng Thí
nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện
Công nghệ sinh học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Amaya-Chavez A, Martınez-Tabche L,
Lopez-Lopez E, Galar-Martınez M (2006) Methyl
parathion toxicity to and removal efficiency
byTypha latifolia in water and artificial sediments,
Chemosphere 63: 1124–1129.
[2]. Bondarenko S, Gan J, Haver DL, Kabashima
JN (2004) Persistence of selected
organophosphate and carbamate insecticides in
waters from a coastal watershed, Environ. Toxicol.
Chem. 23: 2649–2654.
[3]. Do Xuan Dong, Bui Van Thang, Ho Van
Giang, Nong Van Hai, Chu Hoang Ha (2008) An
efficient protocol for plant regeneration of persian
lilac tree (Melia azedarach L.) via somatic
embryogenesis induction. Journal of
Biotechnology 6(2): 1-6.
[4]. Fennoy SL,Julia Bailey-Serres (1993)
Synonymous codon usage in Zea mays L. nuclear
genes is varied by levels of C and G-ending
codons. Nucleic Acid Res 21(23): 5294-5300
[5]. Jabeen R, Khan M, Zafar Y, Anjum T (2010)
Codon optimization of cry1Ab gene for hyper
expression in plant organelles. Mol Biol Rep
37:1011–1017
[6]. Karpouzas DG, Singh BK (2006) Microbial
degradation of organophosphorus xenobiotics:
metabolic pathways and molecular basis,
Adv.Microb. Physiol. 51: 119–185.
[7]. Kawabe A, Miyashita NT (2003) Patterns of
codon usage bias in three dicot and four monocot
plant species. Genes Genet Syst 78: 343-352
[8]. Kawahara J, Horikoshi R, Yamaguchi T,
Kumagai K, Yanagisawa Y (2005) Air pollution
and young children’s inhalation exposure to
organophosphorus pesticide in an agricultural
community in Japan, Environ. Int. 31: 1123–1132.
[9]. Konstantinou IK, Hela DG, Albanis TA
(2006) The status of pesticide pollution in surface
waters (rivers and lakes) of Greece. Part I. Review
on occurrence and levels, Environ. Pollut. 141:
555–570.
[10]. Laguía-Becher M, Valentina M, Mauricio
K, Corigliano M, Yacono ML, Goldman A,
Clemente M (2010) Effect of codon optimization
and subcellular targeting on Toxoplasma gondii
antigen SAG1 expression in tobacco leaves to use
in subcutaneous and oral immunization in mice.
BMC Biotechnology 10:52
[11]. Pagliuca G, Serraino A, Gazzotti T, Zironi
E, Borsari A, Rosmini R (2006)
Organophosphorus pesticides residues in Italian
raw milk, J. Dairy Res. 73: 340–344.
[12]. Qian L, He Y, Hu Y (2006) Determination
of organophosphorus pesticide residues in
vegetables by electrokinetic sequential injection
analysis, Spectrosc. Lett. 39: 581–592.
[13]. Salt DE, Blaylock M, Kumar NP,
Dushenkov V, Ensley BD, Chet I, Raskin I (1995)
Phytoremediation: a novel strategy for the removal
of toxic metals from the environment using plants.
Biotechnology (N Y). 13:468-474.
[14]. Salt DE, Smith RD, Raskin I (1998)
Phytoremediation. Annu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol. 49:643-668.
[15]. Singh BK, Walker A (2006) Microbial
degradation of organophosphorus compounds,
FEMS Microbiol. Rev. 30: 428–471.
[16]. Streatfield SJ (2007) Approaches to achieve
high-level heterologous protein production in
plants. Plant Biotechnol J 5:2-15.
[17]. Wang X, Wu N, Guo J, Chu X, Tian J, Yao
B, Fan Y (2008) Phytodegradation of
organophosphorus compounds by transgenic
plants expressing a bacterial organophosphorus
hydrolase. BBRC 365: 453–458.
[18]. Wauchope RD (1978) The pesticide content
of surface water draining from agricultural fields -
A review. J Environ Qual. 7:459-465.
[19]. Wu NF, Deng MJ, Chu XY, Liang GY, Yao
Y, Fan YL (2004) Isolation, purification and
characterization of a new organophos-phorus
hydrolase OPHC2, Chin. Sci. Bull. 49: 268–272.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64
64
SUMMARY
CONSTRUCTION OF BINARY VECTOR CARRYING OPHC2 GENE
FOR PESTICIDES RESISTANCE TRANSGENIC
Le Van Son
1
,
Nguyen Vu Thanh Thanh
2*
, Nguyen Manh Cuong
2
1Institute of Biotechnology
2College of Sciences - Thai Nguyen University
Organophosphorus (OP) compounds are widely used as pesticides in agriculture but cause broad-
area environmental pollution. Bacterial organophosphorus hydrolase (OPHC2) could degrade OP
compounds in environment. OPHC2 gene is isolated and transferred into tobacco. An assay of
enzyme activity showed that transgenic plants could secrete OPH into the growth medium. The
transgenic plants were resistant to methyl parathion (Mep) as an OP pesticide. In this paper, we
present the results on OPHC2 and binary vector construction. In this paper, OPHC2 gene has
successfully optimized codon in plants and constructed binary vector caring 35S-OPHC2opt-
cmyc-KDEL-NOS (pBIN121/OPHC2opt). This vector was transferred into A. tumefaciens CV58
and confirmed by PCR with specific primers. This results leads to further study for OPHC2opt
gene overexpression and Mep degradation in transgenic plants.
Key words: Agrobacterium, binary vector, OPHC2, Organophosphorus hydrolase
*
Tel: 0912 664 126; Email: thanhthanhdhkhtn@gmail.com
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- brief_33270_37096_3182012851211_split_11_3719_2052450.pdf