Thiết kế vector mang gen OPHC2 phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu

Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64 59 THIẾT KẾ VECTOR MANG GEN OPHC2 PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU Lê Văn Sơn1, Nguyễn Vũ Thanh Thanh2*, Nguyễn Mạnh Cƣờng2 1 Viện Công nghệ sinh học 2 Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên TÓM TẮT Organophosphorus (OP) là một chất có nhiều trong các loại thuốc trừ sâu hiện đang đƣợc dùng rộng rãi trên thị trƣờng và nó gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Enzyme organophosphorus hydrolase (OPHC2) của một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy chất OP. Một số công trình nghiên cƣ́u đã sƣ̉ dụng gen mã hóa enzyme OPHC2 để biến nạp, biểu hiện trong cây thuốc lá và tạo ra cây chuyển gen kháng đƣợc thuốc trừ sâu methyl parathion (Mep)-một loại OP. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả tối ƣu trình tự gen OPHC2 biểu hiện trong thực vật và thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc 35S-OPHC2opt-cmyc-KDEL-NOS (pBIN121/OPHC2). Vector này đã chuyển vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Đây là cơ sở để tạo cây chuyển gen mang gen OPHC2 để phân hủy thuốc trừ sâu Mep tồn dƣ trong môi trƣờng. Từ khóa: Agrobacterium, OPHC2, Organophosphorus hydrolase, vector chuyển gen. MỞ ĐẦU* Việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đang là một trong những nhân tố gây ô nhiễm môi trƣờng đất ở nhiều khu vực sản xuất nông nghiệp ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con ngƣời và cây trồng (Wauchope, 1978; Kawahigashi, 2009). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng cây trồng để loại bỏ các chất ô nhiễm từ môi trƣờng đất và nƣớc mang lại rất nhiều ƣu điểm so với các phƣơng pháp xử lý truyền thống. Các chất ô nhiễm thƣờng đƣợc hấp thụ vào cây thông qua rễ và lá và đƣợc chuyển hóa thành các chất không có hại và tích lũy trong mô của cây (Salt et al., 1998) hoặc cây trồng tiết ra các loại enzyme giúp phân hủy chất ô nhiễm trong môi trƣờng đất. Organophosphorus (OP) là một chất có trong thuốc trƣ̀ sâu hiện đang đƣợc dùng rộng rãi trên thị trƣờng nông nghiệp (Singh et al ., 2006; Karpouzas et al., 2006) và đang làm ô nhiễm môi trƣờn g nghiêm trọng (Kawahara et al ., 2005; Konstantinou et al., 2006; Pagliuca et al., 2006; Bondarenko et al ., 2004; Qian et al ., 2006). Enzyme organophosphorus hydrolase (OPH) của một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy chất OP (Wu et al., 2004; Amaya- * Tel: 0912 664 126; Email: thanhthanhdhkhtn@gmail.com Chavez et al., 2006). Đã có một số nghiên cƣ́u sƣ̉ dụng gen mã hóa enzyme OPH để biến nạp và biểu hiện trong cây thuốc lá . Kết quả phân tích cho thấy, cây thuốc lá chuyển gen đã sản xuất ra enzyme OPH trong môi trƣờng nuôi cấy. Cây chuyển gen kháng đƣợc thuốc trƣ̀ sâu methyl parathion (Mep)-một loại OP (Wang et al., 2008). Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp gen mã hóa enzyme OPHC2 (OPHC2opt) đƣợc tối ƣu biểu hiện trong thực vật và thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen OPHC2opt. Đây là cơ sở cho tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu Mep tồn dƣ trong môi trƣờng hiện nay. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Gen OPHC2 và mồi (primer) đặt từ hãng Epochlifescience (Mỹ) tổng hợp. Chủng E.coli DH5α, Agrobacterium CV58 và vector pBI121 do phòng Công nghệ tế bào- Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Phƣơng pháp nghiên cứu Tách DNA, plasmid và tinh sạch đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của Sambrook (1989) hoặc kít tách plasmid của QIAGEN Thu đoạn DNA mong muốn từ gel agarose với kít thôi gel QIAquick (QIAGEN). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64 60 Các phƣơng pháp trong sinh học phân tử nhƣ cắt bằng enzyme cắt giới hạn, ghép nối gen đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của Sambrook (2001). Biến nạp plasmid vào trong E.coli dựa theo phƣơng pháp biến nạp bằng sốc nhiệt (Cohen, 1972), vào Agrobacterium bằng phƣơng pháp xung điện. Trình tự DNA đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer bằng cách sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminor v3.1 Cycle Sequencing -Viện Công nghệ Sinh học. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tối ƣu và tổng hợp gen OPHC2 biểu hiện trong thực vật: Hình 1. So sánh trình tự gen OPHC2 của P.pseudoalcaligenes (OPHC2) và OPHC2 đã sửa đổi (OPHC2opt) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64 61 MAAPAQQKTQVPGYYRMALGDFEVTALYDGYVDLPASLLKGIDDKDLQSLLARMFVASEKGVQTAVNAYL INTGDNLVLI DTGAAQCFGPTLGVVQTNLKASGYQPEQVDTVLLTHLHPDHACGLVNADGSPAYPNATVEVPQAEAEFWLD EATMAKAPE GMQGMFKMAQQAVAPYAKMNKLKPYKTEGELLPGVSLVASPGHTPGHTSYLFKSGGQSLLVWGDILLNHA VQFAKPEVVF EFDVDSDQARQSRQRILAEAATDKLWVAGAHLPFPGLGHVRKEAQGYAWVPVEFSPIRSDR. Hình 2. Trình tự amino acid của protein OPHC2 Mỗi amino acid đƣợc mã hóa bởi các bộ ba nucleotide khác nhau. Mức độ biểu hiện của mỗi bộ ba trong từng đối tƣợng, từng loài rất khác nhau. Cùng một amino acid, có những bộ ba biểu hiện trong vi khuẩn mức độ cao nhƣng trong thực vật lại biểu hiện ở mức độ thấp và ngƣợc lại (Kawabe và Miyashita, 2003; Streatfield, 2007). Do vậy, để biểu hiện protein cao trong cây trồng cần phải tối ƣu mã bộ ba phù hợp. Mức biểu hiện protein cao là vấn đề đƣợc nhiều công trình nghiên cứu, ứng dụng và cho kết quả tốt (Fennoy và cs, 1993; Laguía-Becher và cs, 2010; Jabeen và cs, 2010). Dựa vào trình tự của gen OPHC2 (kích thƣớc 906 bp) phân lập từ chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes trên NCBI với mã số AJ605330, chúng tôi đã thiết kế mồi để nhân gen OPHC2, trình tự gen OPHC2 đƣợc sửa đổi để biểu hiện tối ƣu trong thực vật (hình 1). Amino acid của OPHC2 opt có kích thƣớc và trình tự không thay đổi với enzyme OPHC2 của P.pseudoalcaligenes (hình 2). Trình tự gen bị thay đổi nhằm tăng khả năng biểu hiện trong cây trồng, song trình tự protein OPHC2 vẫn giữ nguyên nhƣ ban đầu, do vậy hoạt tính protein không thay đổi, tính chất phân hủy chất OP vẫn đƣợc giữ nguyên. Khi OPHC2opt biểu hiện trong hệ thống tế bào thực vật, để giúp cho protein đƣợc hoàn thiện cấu trúc, hoạt tính, chúng tôi bổ sung thêm một peptid tín hiệu KDEL và một đoạn nhận biết c-myc (hình 4). Để đảm bảo sự chính xác trình tự gen tối ƣu, OPHC2opt đã đƣợc tổng hợp nhân tạo bởi Công ty Epochlifescience (Mỹ). Cấu trúc này đã đƣợc ghép trong vector tách dòng pBluescript II SK(-). Sau khi nhận đƣợc pBluescript II SK(-) /OPHC2opt, chúng tôi đã tiến hành biến nạp và nhân trong E.coli, sau đó kiểm tra cắt thử vector bằng enzyme BamHI/SacI. Kết quả thu đƣợc có 2 đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1 kb và 3 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc của gen OPHC2opt và vector pBluescript II SK(-) (hình 3). Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pBluescript II SK(-)/OPHC2opt bằng BamHI/SacI M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2: sản phẩm cắt vector pBluescriptIISK(-)/OPHC2opt Gen OPHC2opt cũng đã đƣợc kiểm tra lại trình tự, kết quả thu đƣợc giống với cấu trúc đã thiết kế, trình tự gen đã đƣợc tối ƣu mã bộ ba theo yêu cầu ban đầu. Đây là cơ sở cho thiết kế vector chuyển gen. Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho OPHC2opt Để thiết kế vector chuyển gen, plasmid pBluescriptII SK(-)/OPHC2opt đƣợc cắt đồng thời bằng 2 enzyme BamHI/SacI. Cấu trúc OPHC2opt-cmyc-KDEL thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 1,0 kb (hình 4). Đồng thời vector chuyển gen pBI121 có chứa promoter 35S cũng đƣợc cắt bởi 2 enzyme tƣơng ứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64 62 BamHI/SacI. Cấu trúc OPHC2opt-cmyc- KDEL và vector pBI121 mở vòng đƣợc thu lại và tinh sạch khỏi agarose. Sau đó 2 sản phẩm đƣợc ghép nối vào nhau bằng enzyme T4 ligase. Hình 4. Cấu trúc gen chuyển trong vector pBI121 Sản phẩm lai này đƣợc biến nạp vào E.coli DH5 và đƣợc chọn lọc dòng biến nạp bằng kháng sinh Kanamicine. Các dòng biến nạp đƣợc kiểm tra bằng cách tách chiết plasmid, sau đó PCR với cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R và cắt bởi enzyme hạn chế BamHI/SacI (hình 3). Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A) và cắt vector tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt (B) M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2 (A): sản phẩm PCR nhân gen OPHC2opt với cặp mồi đặc hiệu 1-2 (B): sản phẩm cắt các dòng vector tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt bằng enzyme giới hạn Hình 5 cho thấy sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,0 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc cấu trúc gen OPHC2opt-cmyc-KDEL. Trên hình ảnh điện di cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn chúng tôi thu đƣợc có 2 băng kích thƣớc khoảng 1,0 kb và 12 kb tƣơng ứng với cấu trúc OPHC2opt-cmyc- KDEL và vector pBI121. Nhƣ vậy, cấu trúc OPHC2opt-cmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế thành công vào vector chuyển gen pBI121. Tạo chủng Agrobacterium mang vector pBI121/OPHC2opt Vector pBI121/OPHC2opt đã đƣợc chuyển vào chủng Agrobacterium CV58 bàng phƣơng pháp xung điện và đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng chứa kháng sinh Rifamicine và Kanamicine. Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ chủng Agrobacterium đã biến nạp pBI121/OPHC2opt M: thang DNA chuẩn 1 kb; +: đối chứng dương (plasmid pBI121/OPHC2opt); -: đối chứng âm (nước); 1-4: các dòng Agrobacterium biến nạp Các khuẩn lạc mang vector chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng PCR bằng cặp mồi đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R. Điện di sản phẩm PCR cho thấy, vi khuẩn Agrobacterium đã mang vector tái tổ hợp (hình 6). Kết quả này cho thấy, chúng tôi đã biến nạp thành công vector pBI121/OPHC2opt vào Agrobacterium. KẾT LUẬN Dựa trên trình tự gen mã hóa enzyme OPHC2 của P.pseudoalcaligenes, chúng tôi đã tối ƣu mã biểu hiện trong thực vật và tổng hợp đƣợc gen OPHC2opt. Cấu trúc gen OPHC2opt- cmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế vào vector chuyển gen pBI121. Đây là nguồn vật liệu để sử dụng chuyển gen vào thực vật, nhằm nâng cao khả năng phân hủy thuốc trừ sâu Mep gây ô nhiễm môi trƣờng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64 63 Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Viện Công nghệ sinh học “Nghiên cứu phương pháp tạo cây xoan ta (Melia azedarach Lin) chuyển gen OPHC2 nhằm ứng dụng trong xử lý ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật”. Các thí nghiệm được tiến hành có sử dụng trang thiết bị của Phòng Thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Amaya-Chavez A, Martınez-Tabche L, Lopez-Lopez E, Galar-Martınez M (2006) Methyl parathion toxicity to and removal efficiency byTypha latifolia in water and artificial sediments, Chemosphere 63: 1124–1129. [2]. Bondarenko S, Gan J, Haver DL, Kabashima JN (2004) Persistence of selected organophosphate and carbamate insecticides in waters from a coastal watershed, Environ. Toxicol. Chem. 23: 2649–2654. [3]. Do Xuan Dong, Bui Van Thang, Ho Van Giang, Nong Van Hai, Chu Hoang Ha (2008) An efficient protocol for plant regeneration of persian lilac tree (Melia azedarach L.) via somatic embryogenesis induction. Journal of Biotechnology 6(2): 1-6. [4]. Fennoy SL,Julia Bailey-Serres (1993) Synonymous codon usage in Zea mays L. nuclear genes is varied by levels of C and G-ending codons. Nucleic Acid Res 21(23): 5294-5300 [5]. Jabeen R, Khan M, Zafar Y, Anjum T (2010) Codon optimization of cry1Ab gene for hyper expression in plant organelles. Mol Biol Rep 37:1011–1017 [6]. Karpouzas DG, Singh BK (2006) Microbial degradation of organophosphorus xenobiotics: metabolic pathways and molecular basis, Adv.Microb. Physiol. 51: 119–185. [7]. Kawabe A, Miyashita NT (2003) Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species. Genes Genet Syst 78: 343-352 [8]. Kawahara J, Horikoshi R, Yamaguchi T, Kumagai K, Yanagisawa Y (2005) Air pollution and young children’s inhalation exposure to organophosphorus pesticide in an agricultural community in Japan, Environ. Int. 31: 1123–1132. [9]. Konstantinou IK, Hela DG, Albanis TA (2006) The status of pesticide pollution in surface waters (rivers and lakes) of Greece. Part I. Review on occurrence and levels, Environ. Pollut. 141: 555–570. [10]. Laguía-Becher M, Valentina M, Mauricio K, Corigliano M, Yacono ML, Goldman A, Clemente M (2010) Effect of codon optimization and subcellular targeting on Toxoplasma gondii antigen SAG1 expression in tobacco leaves to use in subcutaneous and oral immunization in mice. BMC Biotechnology 10:52 [11]. Pagliuca G, Serraino A, Gazzotti T, Zironi E, Borsari A, Rosmini R (2006) Organophosphorus pesticides residues in Italian raw milk, J. Dairy Res. 73: 340–344. [12]. Qian L, He Y, Hu Y (2006) Determination of organophosphorus pesticide residues in vegetables by electrokinetic sequential injection analysis, Spectrosc. Lett. 39: 581–592. [13]. Salt DE, Blaylock M, Kumar NP, Dushenkov V, Ensley BD, Chet I, Raskin I (1995) Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Biotechnology (N Y). 13:468-474. [14]. Salt DE, Smith RD, Raskin I (1998) Phytoremediation. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 49:643-668. [15]. Singh BK, Walker A (2006) Microbial degradation of organophosphorus compounds, FEMS Microbiol. Rev. 30: 428–471. [16]. Streatfield SJ (2007) Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J 5:2-15. [17]. Wang X, Wu N, Guo J, Chu X, Tian J, Yao B, Fan Y (2008) Phytodegradation of organophosphorus compounds by transgenic plants expressing a bacterial organophosphorus hydrolase. BBRC 365: 453–458. [18]. Wauchope RD (1978) The pesticide content of surface water draining from agricultural fields - A review. J Environ Qual. 7:459-465. [19]. Wu NF, Deng MJ, Chu XY, Liang GY, Yao Y, Fan YL (2004) Isolation, purification and characterization of a new organophos-phorus hydrolase OPHC2, Chin. Sci. Bull. 49: 268–272. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lê Văn Sơn và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 59 - 64 64 SUMMARY CONSTRUCTION OF BINARY VECTOR CARRYING OPHC2 GENE FOR PESTICIDES RESISTANCE TRANSGENIC Le Van Son 1 , Nguyen Vu Thanh Thanh 2* , Nguyen Manh Cuong 2 1Institute of Biotechnology 2College of Sciences - Thai Nguyen University Organophosphorus (OP) compounds are widely used as pesticides in agriculture but cause broad- area environmental pollution. Bacterial organophosphorus hydrolase (OPHC2) could degrade OP compounds in environment. OPHC2 gene is isolated and transferred into tobacco. An assay of enzyme activity showed that transgenic plants could secrete OPH into the growth medium. The transgenic plants were resistant to methyl parathion (Mep) as an OP pesticide. In this paper, we present the results on OPHC2 and binary vector construction. In this paper, OPHC2 gene has successfully optimized codon in plants and constructed binary vector caring 35S-OPHC2opt- cmyc-KDEL-NOS (pBIN121/OPHC2opt). This vector was transferred into A. tumefaciens CV58 and confirmed by PCR with specific primers. This results leads to further study for OPHC2opt gene overexpression and Mep degradation in transgenic plants. Key words: Agrobacterium, binary vector, OPHC2, Organophosphorus hydrolase * Tel: 0912 664 126; Email: thanhthanhdhkhtn@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên