Thiết kế vector mang cấu trúc rnai chứa vùng gen coat protein của virus SMV và BYMV - Lò Thị Mai Thu

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135 129 THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN COAT PROTEIN CỦA VIRUS SMV VÀ BYMV Lò Thị Mai Thu1, Phạm Thanh Tùng2, Lê Văn Sơn2, Chu Hoàng Hà2, Chu Hoàng Mậu3* 1Trường Đại học Tây Bắc 2Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam 3Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên; *mauchdhtn@gmail.com TÓM TẮT: SMV và BYMV là hai loại virus điển hình gây bệnh khảm lá ở đậu tương, hiện nay, trong ngành sản xuất đậu tương mới dừng lại ở các biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị hai loại virus này. RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật, tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi thể hiện ở việc tạo cây trồng kháng virus bằng cách chuyển các gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh. Với mục đích cải thiện khả năng kháng virus SMV và BYMV của cây đậu tương Việt Nam bằng kỹ thuật chuyển gen, trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả thiết kế vector chuyển gen (pGWSMV-BYMV-CPi) mang cấu trúc RNAi-CPi của SMV và BYMV. Đoạn CPi là trình tự bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV có kích thước 573 bp. Tạo được dòng vi khuẩn A. umefaciens mang cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi sử dụng để lây nhiễm vào mô tổn thương nách lá mầm nhằm tạo các dòng cây đậu tương chuyển gen kháng virus SMV và BYMV. Từ khóa: Bệnh khảm lá, BYMV, đậu tương, gen CP, SMV. MỞ ĐẦU Kết quả điều tra về bệnh trên cây trồng ở Việt Nam đã xác định được 20 loại bệnh hại, trong đó, các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho năng suất đậu tương và hiện nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ hiệu quả các bệnh do virus. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh khảm (soybean mosaic virus-SMV), bệnh khảm vàng (bean yellow mosaic virus-BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác. Vì vậy, nghiên cứu tạo cây đậu tương kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương sạch bệnh là rất cần thiết. SMV và BYMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae. Hệ gen của SMV và BYMV bao gồm các gen trên sợi RNA (+). Bệnh khảm lá do SMV và BYMV là một trong những bệnh virus điển hình nhất ở đậu tương, làm giảm năng suất và chất lượng của hạt đậu tương. SMV và BYMV lan truyền do rệp làm môi giới và sự lan truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu. Hiện nay trong ngành sản xuất đậu tương mới dừng ở các biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị hai loại virus này. Đó là chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng và diệt trừ côn trùng truyền bệnh. Các biện pháp truyền thống thường phức tạp, tốn thời gian, hiệu quả không cao và kém bền vững. RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng kháng virus bằng cách chuyển các gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh [1, 2, 3] và khẳng định sự kết hợp với kỹ thuật chuyển gen là biện pháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việc cải thiện và tăng cương khả năng kháng virus ở cây trồng [12]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả thiết kế cấu trúc vector RNAi mang đoạn gen coat protein (CP) của SMV và BYMV nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus. VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vùng gen CPi của SMV và BYMV có ký hiệu SMV-BYMV-CPi với kích thước 573 nucleotide được thiết kế bao gồm đoạn bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV dựa trên phân tích đoạn gen CP của SMV và BYMV đã phân lập và các trình tự được công bố trên Gen Bank. Lo Thi Mai Thu et al. 130 Cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R cho PCR nhân bản đoạn CPi được thiết kế có trình tự: SMV-CPi-F: 5’- caccgcagcagaagcttaca -3’ và BYMV-CPi-R: 5’- atgttccgaaccccaagcaa -3’. Vector chuyển gen pK7GWIWG2(II), bộ kit nhân dòng pENTRTM Directional TOPO® Cloning Kit (Invitrogen), bộ kit thực hiện phản ứng Gateway Gateway® LR ClonaseTM II. Chủng vi khuẩn E. coli One Shot® TOP 10 (Invitrogen), E. coli DH5α và chủng A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc pGV2660. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc RNAi Kỹ thuật Gateway (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) được sử dụng để tạo cấu trúc RNAi dựa trên nguyên lý trao đổi chéo đặc hiệu vị trí của phage λ. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc RNAi được thực hiện theo mô tả của Karimi et al. (2002) [5] (hình 1). Hình 1. Sơ đồ mô tả các bước thiết kế vector mang cấu trúc RNAi bằng kỹ thuật Gateway Để thiết kế cấu trúc RNAi mang đoạn CPi của SMV và BYMV (SMV-BYMV-CPi), đầu tiên đoạn CPi được nhân lên bằng phản ứng PCR với thành phần phản ứng gồm: 2,5 µl pfu Buffer with MgSO4 10X, 0,5 µl taq Pfu, 2,5 µl dNTPs, 0,5 µl mồi mỗi loại (SMV-CPi- F/BYMV-CPi-R), 0,5 µl mẫu plasmid và 17 H2O2. Chu kỳ nhiệt của PCR là: 95oC/3 phút; 30 chu kỳ (95oC/30 giây, 54oC/30 giây, 72oC/1phút 30 giây); 72oC/7 phút; mẫu được giữ ở 4oC. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit của hãng Thermo Scientific. Sau khi tinh sạch, đoạn gen CPi tiếp tục được dòng hóa vào vector pENTRY/D để tạo ra dòng entry pENTR/D mang CPi (kí hiệu pEN-CPi) có chứa các vị trí tái tổ hợp attL. Đây là vị trí sẽ tái tổ hợp với attR trên pK7WIWG2(II) khi có sự xúc tác của enzyme đặc hiệu. Tiếp đó phản ứng LR (phản ứng xảy ra sự tái tổ hợp giữa các vị trí attL và attR được xúc tác bởi enzyme LR ClonaseTMII) được thực hiện giữa vector pEN-CPi với vector nhận destination pK7WIWG2(II). Kết quả sẽ tạo được vector nhị thể biểu hiện ở thực vật mang cấu trúc RNAi với hai vị trí chèn đoạn gen đưa vào theo chiều sene và antiense được ngăn cách bởi một đoạn intron dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (ký hiệu: pGWSMV-BYMV-CPi). Cấu trúc pGWSMV- BYMV-CPi được dòng hóa trong tế bào E. coli DH5α. Chọn lọc các khuẩn lạc dương tính trên môi trường LB bổ sung các kháng sinh streptomycin 40 mg/l, Spectinomycin 100 mg/l và Chloramphenicol 50 mg/l. Sau khi chọn dòng trong tế bào E. coli bởi phản ứng colony- PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Tách chiết plasmid pGWSMV-BYMV-CPi và cấu trúc pGWSMV- BYMV-CPi được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260 bằng phương pháp xung điện. Trước khi biến nạp vector tái tổ hợp pGWSMV-BYMV-CPi vào tế bào A. tumefaciens CV58C1 mang plasmid gây độc pGV2260 bằng phương pháp xung điện, tế bào này được làm cho khả biến theo Sambrook et al. (1998) [8]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khuếch đại vùng CPi thuộc gen CP của SMV và BYMV Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn và sự ức chế RNA ngoại lai bằng cơ chế RNAi chỉ xảy ra khi có sự tương đồng cao giữa các siRNA và gen đích (RNA của virus). Mặt khác, hiệu quả kháng virus của cây chuyển gen phụ thuộc rất nhiều vào vai trò và chức năng gen của virus cần phân hủy, vì vậy lựa chọn vùng gen nào để thiết kế cấu trúc RNAi được cho là khâu quan trọng đưa đến sự thành công kỹ thuật RNAi. Căn cứ vào trình tự gen CP TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135 131 phân lập được từ một số dòng virus SMV tại Sơn La và các thông tin về trình tự gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen CP phân lập từ SMV và BYMV đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế, sử dụng BLAST trong NCBI vùng bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV đã được xác định. Vùng cấu trúc RNAi (CPi) đã được lựa chọn, thiết kế và tổng hợp nhân tạo làm nguyên liệu để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi. Khuếch đại vùng CPi từ đoạn gen nhân tạo bằng PCR với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV- CPi-R và sản phẩm được điện di trên gel agarose 1%, kết quả thu được đoạn CPi có kích thước như thiết kế là 0,573 kb (hình 2). Vùng SMV-BYMV-CPi được thiết kế bao gồm trình tự thuộc vùng bảo thủ gen CP của cả hai loài virus SMV và BYMV. Trình tự đoạn SMV-BYMV-CPi gồm 573 nucleotide được trình bày ở hình 3. Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng CPi của SMV và BYMV M. thang DNA 1 kb; CPi.trình tự vùng bảo thủ CPi khuếch đại từ đoạn CP nhân tạo. Hình 3. Trình tự đoạn SMV-BYMV-CPi của virus SMV và BYMV Tạo dòng vector chuyển gen pGWSMV- BYMV-CPi trong tế bào E. coli DH5α và tạo chủng vi khuẩn A. Tumefaciens mang cấu trúc RNAi Sản phẩm PCR CPi được làm sạch bằng Kit GeneJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và được gắn vào vector pENTR theo bộ Kit pENTR™/D-TOPO® tạo plasmid tái tổ hợp có mang vùng CPi pENSMV-BYMV-CPi và biến nạp vào E. coli One Shop® TOP 10. 0,573 kb 0,5 kb 1,0 kb M CPi Lo Thi Mai Thu et al. 132 Kiểm tra khuẩn lạc bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R, kết quả thu được thể hiện ở hình 3A. Lựa chọn một dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR, nuôi và tách chiết plasmid phục vụ cho việc đọc trình tự và thí nghiệm tiếp theo. Kết quả xác định trình tự chứng tỏ đoạn gen quan tâm CPi đã được nhân dòng, ghép nối thành công tạo vector tái tổ hợp pENSMV- BYMV-CPi (hình 4B). A B Hình 4. A. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc (M. thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 3, 4: vùng CPi khuếch đại từ khuẩn lạc); B. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pENSMV- BYMV-CPi (M. thang DNA 1kb; 1-2: plasmid tách từ hai dòng khuẩn lạc) Plasmid pENSMV-BYMV-CPi tiếp tục tham gia phản ứng LR với pK7GWIWG2(II) để tạo vector chuyển gen nhị thể mang CPi (pGWSMV-BYMV-CPi) và dòng hóa vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Để chọn được dòng khuẩn lạc mong muốn, phản ứng colony-PCR đã được thực hiện. Kết quả colony-PCR đã thu được các dòng khuẩn lạc dương tính mang vector pGWSMV- BYMV-CPi với các đoạn gen lặp lại đảo chiều được ngăn cách bởi một đoạn intron ở giữa dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (Hình 5). Cấu trúc này sẽ tạo ra dạng kẹp tóc RNA sau khi được chuyển vào cây trồng và sẽ khởi sự cơ chế RNAi để kháng lại các RNA của virus ngoại lai có trình tự tương đồng. X b a I Hình 5. Sơ đồ cấu trúc pGW/gene: P35S, Promoter CaMV35S; att1 và attB2, các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR; LB, left T-DNA border; RB, right T-DNA border; T35S, terminator 35S; Kan, gen kháng kanamycin; CmR, gen kháng chloramphenicol; Gene, vị trí các đoạn gen chèn vào; vị trí cắt giới hạn của các enzyme tương ứng; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám mồi tương ứng. Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR được sử dụng tách chiết plasmid tái tổ hợp pGWSMV-BYMV-CPi. Sau khi tách chiết vector mang cấu trúc pGWSMV- BYMV-CPi được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và tiếp tục chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi- F/BYMV-CPi-R, kết quả được thể hiện ở hình 6. 1 2 M 3 kb 2 kb 2 kb 0,5 kb M 1 2 3 4 1 2 M TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135 133 Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc A. tumefaciens M. Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: Sản phẩm PCR của 10 dòng khuẩn lạc. Kết quả ở hình 6 cho thấy, một băng DNA có kích thước lớn hơn 0,5 kb đúng bằng kích thước của đoạn SMV-BYMV-CPi. Những dòng A. tumefaciens sau khi kiểm tra được lưu giữ trong glycerol ở -84oC để phục vụ chuyển gen tạo cây đậu tương kháng virus sau này. Trong nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự câm gen là cao nhất [9, 10]. Kenny et al. (2007) [6] đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Lim et al. (2007) [7] nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tương đã nhận thấy rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm lá do SMV biến mất và lượng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tương chuyển gen. Nhìn chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh. Tuy nhiên, tính kháng bệnh của cây trồng còn phụ thuộc nhiều vào chức năng và vị trí gen chuyển. Ở Việt Nam, thành công đầu tiên tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng CMV (cucumber mosaic virus) và TMV (tobacco mosaic virus) bằng kỹ thuật RNAi. Những dòng thuốc lá chuyển đoạn gen ghép nối mang đồng thời gen CP của TMV và CMV đã cho thấy hiệu quả kháng lên tới 60% đối với hai chủng virus này. Các cây biểu hiện khả năng kháng cao sau 3 lần lây nhiễm đồng thời 2 chủng virus đã cho thấy khả năng kháng bệnh được duy trì cho thế hệ sau [11]. Tiếp đến thành công ở đu đủ kháng bệnh đốm vòng do virus PRSV (papaya ringspot virus) [4, 13]. Tuy nhiên, các nhóm tác giả cũng thấy rằng tỷ lệ kháng bệnh của các dòng cây chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được lựa chọn để thiết kế vector. Bệnh khảm lá đậu tương do SMV và BYMV có triệu trứng khó phân biệt, cây đậu tương có thể chỉ bị nhiễm một loại virus SMV hoặc BYMV và cũng có thể nhiễm đồng thời cả hai loại virus này. Chính vì vậy chúng tôi thiết kế vector mang vùng bảo thủ của gen CP của cả hai loài virus SMV và BYMV với mong muốn tạo cây đậu tương chuyển gen kháng được cả hai loài virus này. KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công vector chuyển gen (pGWSMV-BYMV-CPi) mang cấu trúc RNAi- CPi. Đoạn CPi là trình tự bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV được thiết kế có kích thước 573bp. Tạo được dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi sử dụng để lây nhiễm vào mô tổn thương nách lá mầm nhằm tạo các dòng cây đậu tương chuyển gen kháng SMV và BYMV. Lời cảm ơn: Nghiên cứu được hoàn thành có sử dụng thiết bị Phòng ADN&Ứng dụng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và thuộc nội dung của đề tài Khoa học-Công nghệ cấp Bộ 0,5kb 2kb 5kb 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 Lo Thi Mai Thu et al. 134 Giáo dục và Đào tạo, mã số: B2013-TN04-05. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Asad S., Haris W. A. A., Bashir A., Zafar Y., Malik K. A., Malik N. N., Lichtenstein C. P., 2003. Transgenic tobacco expressing geminiviral RNAs are resistant to the serious viral pathogen causing cotton leaf curl disease. Arch Virol., 148(12): 2341- 2352. 2. Abhary M. K., Anfoka G. H., Nakhla M. K., Maxwell D. P., 2006. Post- transcriptional gene silencing in controlling virruses of the tomato yellow leaf curl virus complex. Arch. Virol., 151(12): 2349-2363. 3. Fuentes A., Ramos P. L., Fiallo E., Callard D., Sánchez Y., Peral R., Rodríguez R., Pujol M., 2006. Intron-hairpin RNA derived from replication associated protein C1 gene confers immunity to Tomato yellow leaf curl virus infection in transgenic tomato plant. Transgenic Res., 15(3): 291-304. 4. Chu Hoàng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, 2011. Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng cơ chế RNAi. Hội Thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam, Nxb. Nông nghiệp Hà Nội: 316- 326. 5. Karimi M., Inzé D., Depicker A., 2002. Gateway TM vectors for Agrobacterium- mediated plant transformation. Trends Plant Sci., 7: 193-195. 6. Kenny B., Josias C. F., Elsa O. P. L. N., Érica A. M., Francisco J. L. A., 2007. RNAi-Mediated Resistance to Bean golden mosaic virus in Genetically Engineered Common Bean (Phaseolus vulgaris). Mol. Plant Microbe In., 20(6): 717-726. 7. Lim H. S., Ko T. S., Hobbs H. A., Lambert K. N., Yu J. M., McCoppin N. K., Korban S. S., Hartman G. L., Domier L. L., 2007, Soybean mosaic virus Helper Component- Protease Alters Leaf Morphology and Reduces Seed Production in Transgenic Soybean Plants. Phytopathology, 97(3): 366-372. 8. Sambrook J., Fritschi E. F., Maniatis T., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 9. Smith N. A., Singh S. P., Wang M. B., Stoutjesdijk P. A., Green A. G., Waterhouse P. M., 2000. Total silencing by intron- spliced hairpin RNAs. Nature, 407(6802): 319-320. 10. Wesley S. V., Helliwell C. A., Smith N. A., Wang M. B., Rouse D. T., Lie Q., Gooding P. S., Singh S. P., Abbott D., Stoutjesdijk P. A., Robinson S. P., Gleave A. P., Green A. G., Waterhouse P. M., 2001. Construct design for efficient, effective and high- throughput gene silencing in plants. Plant J., 27(6): 581-590. 11. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, 2008 Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4A): 679-687. 12. Đỗ Năng Vịnh, 2007. Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen và tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí Công nghệ sinh học, 5(3): 265-275. 13. Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình, 2011. Tạo dòng cà chua PT18 kháng bệnh xoăn vàng lá do virus bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học, 9(3): 333-340. TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 129-135 135 CONSTRUCTION OF VECTOR CARRYING RNAi STRUCTURES CONTAINING CP GENE FRAGMENT FROM SMV AND BYMV Lo Thi Mai Thu1, Pham Thanh Tung2, Le Van Son2 Chu Hoang Ha2, Chu Hoang Mau3* 1Tay Bac University 2 Institute of Biotechnology, VAST 3Thainguyen University of Education SUMMARY Soybean mosaic virus (SMV) and Bean yellow mosaic virus (BYMV) are two typical virus types causing mosaic disease in soybeans. Currently in soybean production just at measures to prevent and that no drugs for treatment two viruses. RNAi is considered a modern technique and effective against viral diseases in plants. Effectiveness of RNAi technique shown in creating virus-resistant crops by transgenic technique with the genes derived from the virus. With the aim of improving resistance to SMV and BYMV of Vietnam soybean cultivars by transgenic techniques, in this study we have successfully designed vector carrying RNAi structure (pGWSMV-BYMV-CPi) contained CP gene fragment from SMV and BYMV. CPi is conservative sequences of CP gene SMV and BYMV have size is 573bp. Strains A.tumefaciens carrying structure pGWSMV-BYMV-CPi has been created to use infect into lesion cotyledon node, for the purpose of generate transgenic soybean lines with resistance to SMV and BYMV. Keywords: BYMV, CP gene, mosaic disease, SMV, soybean. Ngày nhận bài: 23-4-2013