Thí nghiệm Chuyên đề công nghệ tách chiết hợp chất thiên nhiên

THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN GV: ThS. Hoàng Minh Hảo KS. Nguyễn Bình Kha TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH Quốc Gia TP. HCM. [2]. Nguyễn Khác Quỳnh Cứ (1999), Bài giảng chiết xuất dược liệu. Bộ môn dược liệu. ĐH Y-Dược TP. Hồ Chí Minh, 45-97. BÀI 1: MỞ ĐẦU
Hợp chất thiên nhiên (natural product), phân tử sinh học tự nhiên (biological molecule) là chất biến dưỡng thứ cấp được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật, chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho cơ thể sinh vật.
Các chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật thường thuộc các nhóm sau: alcaloid, quinonoid, steroid, terpenoid, iridoid, flavonoid, glycosid.
Nếu những chất đại phân tử có trọng lượng phân tử lớn, tính chất hóa học tương đối đồng nhất, người ta có thể đề xuất được một số qui trình tổng quát để chiết tách cô lập chúng thì các hợp chất thiên nhiên có trọng lượng phân tử nhỏ, tính chất hóa học đa dạng, khác biệt nên không có qui trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số phương pháp khác nhau. Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên
Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem những chất này có hoạt tính sinh học gì? Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp chất đạt độ tinh khiết >95% mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp quang phổ hiện đại.
Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem xét có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn.
Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh vật (sự sinh tổng hợp).
Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi có diều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự nhiên và những chất này có cùng hàm lượng hay không?  Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao.  Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng.  Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực. BÀI 2: SẮC LÝ LỚP MỎNG VÀ ĐỊNH TÍNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ NHÓM HỮU CƠ I. Mục đích
Trang bị những kỹ năng, thao tác khi khảo sát các hợp chất từ cây cỏ bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng.
Sinh viên có thể định tính sự hiện diện của một số nhóm hợp chất hữu cơ bằng phương pháp vật lý và hóa học. II. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin Layer Chromatography (TLC)) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ. Thí dụ: silica gel hay oxit alumin. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.  Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọbằng thủy tinh, có nắp đậy.  Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu thí dụ như silica gel, alumin.  Mẫu phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau.  Pha động: Dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. III. Cách tiến hành 1. Các bước chuẩn bị trước khi SKLM 1.1 Chuẩn bị vi quản Dụng cụ  Ống vi quản  Đèn cồn  Kẹp  Lọ thủy tinh  Giấy thấm  Aceton Cách tiến hành Dùng 2 tay cầm 2 đầu ống vi quản, hơ nóng đoạn giữa của vi quản đến khi mềm dẻo. Đem vi quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai đầu ống ra xa. Giữ yên cho đến khi thủy tinh đặc cứng lại. Tiến hành rửa vi quản đã kéo bằng cách chấm vào lọ thủy tinh có chứa aceton, lấy vi quản ra và chấm vào giấy thấm để rút bỏ aceton. Làm lại vài lần để vi quản được sạch. 1.2 . Chấm mẫu lên tấm bản mỏng 1.2.1. SKLM bản nhỏ Dụng cụ:  Tấm bản mỏng thương mại 20x20cm  Kéo cắt  Thước  Bút chì  Vi quản đã kéo  Mẫu đã chấm bản mỏng  Máy sấy Hóa chất: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất Cách tiến hành Mẫu là chất lỏng, lấy mẫu và chấm trực tiếp trên bản mỏng. Mẫu là chất rắn thì phải hòa tan mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%, dung môi hòa tan mẫu không nhất thiết là dung môi giải ly. Cắt tấm bản mỏng nhỏ (5x2cm), dùng viết chì kẻ một đường thẳng phía dưới bảng cao 1cm làm mức xuất phát. Một đường thẳng phía trên bản mỏng cao 0.5cm làm tiền tuyến dung môi. Chấm vi quản nhúng vào dung dịch mẫu, chạm nhẹ đầu vi quản vào tấm bản mỏng tại vạch xuất phát. Nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm bản mỏng để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 2-5mm. Sau khi chấm xong, sấy nhẹ để dung môi bay ra khỏi vết chấm rồi nhúng vào dung dịch giải ly. Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị và chấm mỗi mẫu một vết trên bản mỏng. Vết này cách vết kia 1cm. Hai vết ở ngoài bìa phải cách bờ cạnh 1,5cm. 1.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế (20x20cm) Với SKLM điều chế, dung dịch mẫu chất sẽ được chấm lên thành một đường dài, đều, dọc theo vạch xuất phát bằng cách dùng vi quản kéo một đường dài dọc theo vạch xuất phát. 1.3. Giải ly bản mỏng 1.3.1. Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng Dụng cụ  Bình giải ly (bình phải có nắp đậy)  Giấy lọc (cắt sao cho bỏ vừa vào bình giải ly)  Ống đong 10ml, 100ml  Đũa thủy tinh Hóa chất: Eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất 1.3.2. Giải ly bản mỏng Cách tiến hành Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy thấm (giấy lọc), nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình được bão hòa). Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và ngập vào dung môi. Các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi. Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng quá trình giải ly. Lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi. Tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc trưng. 2. Hiện hình các vết sau khi giải ly Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phương pháp hóa học hoặc vật lý. 2.1. Phương pháp vật lý Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV) Dụng cụ:  Đèn chiếu UV  Viết chì Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát màu, nếu quan tâm thì dung viết chì khoanh lại. 2.2. Phương pháp hóa học: Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng Dụng cụ:  Kẹp  Máy sấy  Cuộn băng keo  Kéo Hóa chất  I2  Dd FeCl3  Dd H2SO4 50% Thuốc thử Màu của vết Hợp chất Hơi I2 H2SO4 đđ H2SO4 đđ H2SO4 đđ FeCl3 H2SO4 đđ Vàng hoặc nâu Vàng đậm đến da cam Màu đỏ hoặc xanh dương –đỏ Màu cam đến đỏ Xanh lục đến xanh đen Màu tím Hợp chất hữu cơ nói chung Flavon, Flavonol Chalcon, auron Flavonoid Sesquiterpen Triterpen Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô. Nếu hiện hình bằng hơi I2 thì đặt bản mỏng trong bình chứa I2. Nếu hiện hình bằng dung dịch FeCl3, hay H2SO4 thì nhúng tấm bản mỏng vào lọ chứa dung dịch đó, lấy ra và lắc nhẹ cho thuốc thử chảy xuống hết. Tiến hành nướng bản mỏng bằng máy sấy hay bếp điện, các vết màu sẽ hiện lên, dùng băng keo dán tấm bản mỏng lại để tấm bản mỏng không bị vỡ để tiện cho quan sát lần sau. Trên tấm bản mỏng phải ghi rõ dung môi hoặc hệ dung môi giải ly. Màu đỏ sậm (λmax: 545nm) Màu xanh dương đen (λmax: 595nm) BÀI 3: CHIẾT XUẤT TINH DẦU I. Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp tách chiết tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước. II. Cơ sở lý thuyết Muốn khảo sát tinh dầu trong cây nên tiến hành việc lôi cuốn hơi nước trên mẫu cây tươi, để tránh thất thoát tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi cao. Nước khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu. Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành Dụng cụ  Bình cầu, erlen  Bếp đun, ống ngưng hơi  Các ống nối bằng thủy tinh Hóa chất  Nước  Vỏ bưởi, vỏ chanh Cách tiến hành Mẫu được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể tích của cả mẫu và nước chỉ chiếm tối đa hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng. Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở thành thể lỏng, rơi xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành hai lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu. Tùy theo tinh dầu nhẹ hơn nước hay nhẹ hơn nước, khi ráp hệ thống sẽ lựa chọn ống gạn cho phù hợp. Vẫn tiếp tục đun nóng hệ thống, lớp nước trong ống gạn càng lúc càng nhiều, sẽ được trả về bình cầu nhờ ống nhánh ngang thông nhau. Nhờ ống này mà không cần phải tiếp thêm nước cho hệ thống trong quá trình chưng cất. Lúc này chỉ cần mở khóa ống gạn là có thể thu lấy tinh dầu. BÀI 4: SẮC KÝ CỘT I. Mục đích Đây là một trong những kỹ thuật nhằm phân đoạn cao thô ban đầu (cao etanol, metanol, butanol) ra thành các phân đoạn cao nhỏ hơn, có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập ra hợp chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ. II. Cơ sở lý thuyết Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh). Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không là tùy vào hệ số phân chia. Bất kỳ một hợp chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm hai pha (hai pha: lỏng- lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỷ lệ nồng độ cố định, tỷ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của hợp chất và của cả hai pha. Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ thống gồm hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất. Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly đươc đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly. Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau: Bảng 1: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột Hydrocarbon Alken Eter Hydrocarbon R-H Hợp chất thơm Ceton Aldehyde Ester Alcol Amin Acid carboxylic Các hợp chất kiềm mạnh Chậm nhất, cần dung môi phân cực III. Dụng cụ, hóa chất Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography) Dụng cụ  Phễu lọc xốp bằng thủy tinh với độ xốp của lỗ thuộc loại 2 hoặc loại 3 để dòng chảy của dung môi được thuận lợi, đường kính trung bình của lỗ xốp 41-100µm.  Chén sứ và chày nhỏ  Bình tam giác  Hệ thống tạo chân không nhẹ bằng vòi nước (máy bơm).  2 cái muỗng  Bông gòn, kéo  5 lọ thủy tinh (100ml) Hóa chất  Silica gel khô (cỡ hạt 15-40 µm)  Eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, nước cất, aceton. Sắc ký cột hở (open-column chromatography) Dụng cụ  Cột thủy tinh (đường kính 1.5cm, cao 60cm)  2 cái kẹp  1 giá đỡ (giữ cột)  1 becher 100ml, đũa thủy tinh  Ống đong 100ml  Bông gòn thấm nước  Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (100ml, 50ml) Hóa chất  Silica gel (50-150µm)  Eter dầu hỏa, chloroform, etyl acetat, metanol, acetone, nước. IV. Cách tiến hành Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography) a) Nạp chất hấp thu vào cột Ráp hệ thống gồm phễu lọc xốp gắn trên bình tam giác, bình này nối với một máy bơm hút tạo chân không, cho máy bơm hoạt động. Múc từng lượng nhỏ silica gel khô cho vào phễu, dùng muỗng nén nhẹ silica gel xuống đáy phễu, mỗi lần mỗi ít, từng lớp, tạo thành một khối rắn, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều dày lớp silica gel khoảng 5cm. Nếu cần tách một lượng mẫu chất nhiều hơn thì sử dụng phễu to hơn, có đường kính lớn hơn. Bảng 2: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký-nhanh cột khô. Lượng mẫu Đường kính trong của phễu (cm) Chiều cao lớp hấp thu Phân đoạn dung dịch giải ly (ml) <100 mg 0,5-1,0 4 10-15 0,5-1,0 g 2,0-3,0 4 20-30 1,0-10,0 g 5 5 30-50 10,0-20,0 g 10 5 50 b) Cân bằng cột sắc ký Sau khi nạp pha tĩnh xong, chỉnh lớp bề mặt pha tĩnh cho bằng phẳng, đặt một lớp bông gòn dày lên bề mặt cột để bảo vệ lớp mặt. Cân bằng cột bằng loại dung môi ít phân cực nhất, loại dung môi dùng để giải ly đầu tiên. Cho một lượng lớn dung môi lên đầu cột, mở máy bơm, dung môi sẽ được hút xuống bình tam giác. Thực hiện vài lần, đến khi chất hấp thu đồng nhất trong cột thì dừng, cột được cân bằng. c) Nạp mẫu lên đầu cột và giải ly cột Nạp mẫu thô: Dùng muỗng múc từng lượng nhỏ silica gel vào cao thô ban đầu, nghiền thành bột, sau khi nghiền thành bột mịn xong, lấy lớp bông gòn ra khỏi cột, dùng muỗng múc bột nghiền vào đầu cột, dùng muỗng trải đều phần bột này để có một lớp mỏng, không được đè nén lớp bột này. Lấy lớp bông gòn lúc nảy phủ trở lại lên mặt cột, bề mặt này sẽ không bị xáo trộn khi giải ly. Cho máy bơm hoạt động, rót một lượng vừa phải dung môi lên bề mặt phễu, khi máy bơm rút hết phần dung môi, ngắt áp suất, rót phần dung dịch vừa giải ly đang chứa trong bính tam giác và các lọ có đánh số thứ tự. Gắn phễu vào hệ thống, rót dung môi, cho máy bơm hút hoạt động, hút phễu khô. Mỗi lần phải hút khô phễu rồi mới cho dung môi mới vào. Ghi chú: Đôi khi mới bắt đầu giải ly, cột bị nghẹt, dung môi không hút qua được là do các hợp chất phân cực nào đó đã kết tinh lại khi gặp dung môi ít phân cực. Giải quyết bằng cách dùng spatule khuấy xới trộn lớp bề mặt của cột lên khoảng 0,5cm, rồi tiếp tục giải ly bình thường. Sắc ký cột hở (open-column chromatography) a) Chọn chất hấp thu để nhồi cột Silica gel pha thường (50-150µm) b) Chọn dung môi cho quá trình sắc ký cột Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp. Các bước tuần tự như sau: + Mẫu chất cần sắc ký được hòa tan trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10mg/ml. Gọi là dd mẫu (A). + Chuẩn bị 5-6 tấm bản mỏng (2x5cm), chấm lên những tấm bảng này, mỗi chấm khoảng 2-5µl dung dịch mẫu (A). + Mỗi bảng được giải ly với các dung môi hoặc hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, tiến hành hiện hình các vết ở mỗi bảng bằng UV hay thuốc thử. + Đối với mẫu cao khô chiết xuất từ cây cỏ (cao chứa các hợp chất từ ít phân cực đến phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bảng với Rf = 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cức nhất của cao chiết với Rf = 0,2. c) Tỷ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột - Tỷ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng: Trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu. - Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong cột sắc ký: Chiều cao chất hấp thu: đường kính trong của của cột = 10:1. d) Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột - Giữ cho cột thẳng đừng trên giá, đầu ra của cột dùng miếng thủy tinh xốp hoặc miếng bông gòn để chặn. - Trong một becher đã có sẵn dung môi (dung môi đầu tiên cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót, vừa khuấy nhẹ đều. Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt, khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng. - Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột. - Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột. - Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất. Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, hứng lượng dung môi này được sử dụng lại để rót trở lại lên đầu cột, không để cho đầu cột bị khô, nghĩa là phải luôn có một lượng dung môi ở trên đầu cột. - Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho them dung môi them lên trên đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đão nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chất hấp thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống tư từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng. e) Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký - Đặt mẫu cao trong một chén sứ, cho một ít silica gel vào, lấy chày nghiền mịn, dùng phễu thủy tinh để đặt mẫu vào cột. Khi đặt mẫu bột khô lên đầu cột xong, dùng một ít dung môi (dung môi đầu tiên để chạy cột) để thấm ướt phần bột (mẫu chất và silica gel) để đồng thời rửa phần còn dính trên cột. - Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly. f) Theo dõi quá trình giải ly cột. - Hứng dung dịch giải ly trong những lọ thủy tinh có đánh số thứ tự, hứng mỗi lọ 50ml. - Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các lọ thành các phân đoạn có kết quả SKLM giống nhau. BÀI 5: TÁCH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT I. Mục đích Sinh viên sẽ cô lập một vài hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp các chất ban đầu bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với SKBM. II. Cơ sở lý thuyết Xem lai bài sắc ký cột và sắc ký bản mỏng III. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ  Cột thủy tinh (sẽ được lựa chọn sau)  2 cái kẹp (giữ cột)  1 giá đỡ (giữ cột)  2 becher, đũa thủy tinh  Ống đong 100ml  Bông gòn  Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (các lọ bi)  Kéo, vi quản đã kéo, bản mỏng (20x20cm)  1 cái kẹp bản mỏng  Máy sấy hoặc bếp điện để nướng bản  Bình giải ly bản  Đèn soi UV  H2SO4 50% Hóa chất: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất IV. Cách tiến hành Xem lại phần sắc ký cột hở của bài sắc ký cột.