Tạo dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa protein RHO liên quan đến cơ chế thực bào ở tôm sú (penaeus monodon) - Hoàng Thị Thu Yến

Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 145 - 150 145 TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN RHO LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ THỰC BÀO Ở TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Hoàng Thị Thu Yến1*, Kim Thị Phương Oanh2, Nông Văn Hải2 1Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái nguyên 2 Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT Protein Rho là một thành viên thuộc siêu họ Ras, protein này thực hiện chức năng liên quan đến cơ chế thực bào, một cơ chế miễn dịch chính ở tôm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần đầu tiên tiến hành phân lập đoạn gen Rho từ mẫu mô gan tôm sú bị bệnh đốm trắng. Để khuếch đại một phần đoạn gen Rho bằng kỹ thuật RT - PCR, cặp mồi suy diễn được thiết kế dựa trên trình tự amino acid bảo thủ của protein Rho ở một số loài đã biết. Sau đó, sản phẩm RT-PCR được tạo dòng trong vector pCR2.1 và tiến hành xác định trình tự. Trình tự đoạn gen Rho thu được có kích thước 272 bp, mã hóa 90 amino acid. Trình tự nucleotide đoạn gen Rho được đăng ký trên Genbank với mã số JN617867. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi góp phần tạo nguyên liệu nghiên cứu cấu trúc gen Rho hoàn chỉnh, từ đó phục vụ nghiên cứu chức năng của protein Rho. Từ khóa: Tôm sú, protein Rho, thực bào, gen liên quan đến miễn dịch, protein siêu họ Ras MỞ ĐẦU* Thực bào là cơ chế miễn dịch tế bào chính ở tôm, liên quan đến sự thu nhận các vật thể lạ từ bên ngoài. Cơ chế này được thực hiện bởi bạch cầu bán hạt và bạch cầu hạt. Quá trình thực bào bao gồm các bước: hướng hóa, bám chặt, tiêu hóa, phá hủy tác nhân gây bệnh và xuất bào [5], [10]. Quá trình thực bào ở động vật không xương sống nói chung và tôm nói riêng tương tự như ở động vật có xương sống. Tuy nhiên, sự tiếp xúc miễn dịch luôn được thực hiện có tính ngẫu nhiên, rất hiếm chủ động theo kiểu hóa hướng động ở động vật có xương sống [1]. Ngoài ra, bạch cầu bán hạt có khả năng nhận biết các tác nhân xâm nhập và hoạt động như là một sự opsonins hóa kết hợp với hệ thống hoạt hóa proPO [8]. Protein Rho là một thành viên thuộc siêu họ Ras (Ras superfamily). Hầu hết các nghiên cứu của các protein Ras về hoạt tính miễn dịch tập trung vào sự điều khiển cơ chế thực bào bởi Rho GTPase [4] và các nhân tố chịu tác động của Rho ảnh hưởng đến sự điều chỉnh vận động của actin trong quá trình thực bào ở động vật có vú [3]. Ở tôm thẻ Nhật Bản (Marsupenaeus japonicus), nghiên cứu so sánh sự biểu hiện gen giữa tôm kháng virus WSSV với tôm thường cho thấy: các gen * Tel: 0912 896298, Email: yenhtt79@gmail.com Ran, Rho và Rab biểu hiện tăng đáng kể ở tôm kháng virus. Đây là bằng chứng chứng tỏ những GTPase này tham gia vào quá trình truyền tín hiệu trong phản ứng bảo vệ ở tôm [6]. Ngoài ra, khi xây dựng thư viện EST tôm sú Tassanakajon và đtg (2006) đã chỉ ra: khi tôm sú ở trong điều kiện stress nhiệt độ (heat stress), gen Rho ở mô máu của tôm sú được biểu hiện tăng [9]. Đến nay, gen Rho từ tôm sú (Penaeus monodon) vẫn chưa được phân lập. Do đó, để góp phần nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein này, bước đầu chúng tôi tiến hành tạo dòng và xác định trình tự một phần đoạn gen Rho (gọi tắt là đoạn gen Rho) từ mẫu tôm sú Việt Nam. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tôm bị bệnh đốm trắng tại Trạm Nghiên cứu thủy sản nước lợ, km10 đường cao tốc Hải Phòng - Đồ Sơn và các đầm nuôi tư nhân vùng lân cận. Ngay sau khi nhận tôm nguyên con, mô gan đã được tách riêng và bảo quản trong dung dịch nitơ lỏng. Phương pháp Tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tổng hợp cDNA Phương pháp tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tổng hợp cDNA cho phản ứng Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 145 - 150 146 RT-PCR được tiến hành theo mô tả của Hoàng Thị Thu Yến và đtg [2]. Phản ứng 3’ và 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) được thực hiện theo kit “SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit”(Invitrogen). Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR Dựa trên thông tin trình tự amino acid của protein Rho của một số loài đã công bố, chúng tôi thiết kế mồi suy diễn Rho DPF và Rho DPR (DP-degenerate primer) (Hình 1, Bảng 1). Sau đó sử dụng cặp mồi này thực hiện phản ứng RT-PCR theo kit “SuperScript. First-Strand Synthesis System for RT-PCR” (Invitrogen). Hình 1. Sơ đồ thiết kế mồi Tách dòng gen Đoạn gen Rho khuếch đại bằng kỹ thuật RT- PCR được tinh sạch và gắn vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen), sau đó được biến nạp vào chủng E. coli DH10b và chọn lọc trên môi trường nuôi cấy có kháng sinh Ampicillin, X-gal. Plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng enzyme giới hạn nằm trên vector. Xác định trình tự gen Trình tự nucleotide đoạn gen Rho được xác định trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Anlalyzer (Applied Biosystems). Trình tự của gen được đọc ở 2 dòng plasmid tái tổ hợp và đọc một chiều. Kết quả trình tự gen được phân tích, so sánh bằng phần mềm sinh học chuyên dụng (Sequence Scanner, BLAST, Bioedit) KẾT QUẢ Tách dòng đoạn gen Rho Dựa trên cơ sở so sánh trình tự amino acid của protein Rho ở một số loài đã công bố trên GenBank như tôm he Nhật Bản (Marsupenaeus japonicus; HM581521), muỗi (Anopheles gambiae; XP_001688510), ruồi giấm (Drosophila melanogaster; NP_995851), ong (Apis mellifera; XP_393401), sâu (Saccoglossus kowalevskii; XM_002741555), cá (Danio rerio; NP_998302), Frog - ếch (Xenopus laevis; NP_001088626) chúng tôi thiết kế cặp mồi suy diễn (degenerate primers) để nhân đoạn gen Rho (Hình 1). Trước tiên, mẫu mRNA tách chiết và tinh sạch từ mô gan của tôm sú bị bệnh đốm trắng được dùng làm khuôn tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Phản ứng RT-PCR sau đó được tiến hành với cDNA thu được. Sản phẩm khuếch đại gen được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 2). Hình 2. Sản phẩm nhân đoạn gen Rho bằng kỹ thuật RT-PCR M: Marker 100 bp; 1: Sản phẩm khuếch đại gen Rho từ mô gan tôm sú Bảng 1. Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Gen đích Kích thước ước tính Rho DPF TAGGATCCGGNCARGARGAYTAYGAY Đoạn gen Rho ~ 300 bp Rho DPR TACTCGAGRTTDATYTTYTCNGCCAT Chú thích: *Phần gạch chân là đoạn nhận biết của enzyme giới hạn Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 145 - 150 147 Kết quả ở hình 2 cho thấy, sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen Rho có kích thước khoảng 0,3 kb đúng với tính toán lý thuyết (Bảng 1). Sản phẩm này được tinh sạch từ gel agarose và tách dòng phân tử trong vector pCR2.1. Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn EcoRI, cho phép cắt đoạn gen Rho (nếu có) ra khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3. Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI, kết quả điện di ở hình 3 cho thấy mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pCR2.1 (~3,9 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 0,3 kb tương ứng với sản phẩm RT-PCR (Hình 2). Như vậy, bước đầu chúng tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn đoạn gen Rho. Hình 3. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT- PCR trong vector tái tổ hợp M. Marker 1 kb; 1-3: Plasmid pCR2.1 mang đoạn gen Rho Hình 4. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn đoạn gen Rho của tôm sú Việt Nam Phần trình tự gạch dưới là trình từ mồi; phần trình tự in nghiêng là trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được thêm vào mồi xuôi BamHI và mồi ngược XhoI 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RHO TAGGATCCGGGCAGGAGGATTATGATAGATTGAGGCCACTGTCCTACCCCGACACAGATGTCATACTCATGTGTTTCTCT G Q E D Y D R L R P L S Y P D T D V I L M C F S 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RHO ATTGATTCCCCGGATTCGTTAGAAAATATTCCAGAAAAATGGACGCCTGAAGTTAAACACTTCTGTCCAAATGTTCCTAT I D S P D S L E N I P E K W T P E V K H F C P N V P I 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RHO TATCCTTGTTGGAAACAAAAAGGATCTAAGGAATGACGCTCCAACTATTAAAGAACTATTGAAAATGAAGCAGGAGCCGG I L V G N K K D L R N D A P T I K E L L K M K Q E P 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|... RHO TAAAGCCTGAAGAAGGTCGTAACATGGCCGAAAAGATCAACTCGAGTA V K P E E G R N M A E K I 0,25 0,5 1,0 3,0 kb M 1 2 3 Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 145 - 150 148 Hình 5. So sánh (alignment) trình tự amino acid của đoạn gen Rho giữa các loài khác nhau. Trong đó: Shrimp-Mj - tôm he Nhật Bản (Marsupenaeus japonicus; HM581521), Shrimp-Pm (tôm sú Việt Nam được xác định trong nghiên cứu này), Drosophila - ruồi giấm (Drosophila melanogaster; NP_995851), Worm - sâu (Saccoglossus kowalevskii; XM_002741555), Mosquito - muỗi (Anopheles gambiae; CAD27475), Fish – cá (Danio rerio; NP_998302), Frog - ếch (Xenopus laevis; NP_001088626), chicken – gà (Gallus gallus; NP_990240), Mouse - chuột (Mus musculus; NP_031511), Human - người (Homo sapiens; NP_055393) Xác định và phân tích trình tự Chúng tôi đã xác định trình tự đoạn gen Rho đã được gắn với vector pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi đã khẳng định được chắc chắn đoạn DNA phân lập được là trình tự CDS mã hóa một phần trình tự amino acid của protein Rho. Đoạn gen Rho có kích thước 272 bp (không tính phần trình tự có chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn được thêm vào trình tự mồi), mã hóa 90 amino acid. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn đoạn gen Rho được thể hiện trên hình 4. Trình tự đoạn gen Rho đã được đăng ký trên Genbank với mã số JN617867. Rho là một trong những protein đóng vai trò quan trọng trong cơ chế thực bào, hiểu biết cơ chế phân tử của chúng tham gia vào quá trình thực bào sẽ đưa ra được giải pháp trong việc điều khiển bệnh do virus, cụ thể là bệnh WSSV [7]. Ở tôm sú chưa có công bố nào về trình tự của gen này. Do đó, trình tự một phần đoạn gen Rho chúng tôi phân lập được từ tôm sú Việt Nam là hoàn toàn mới chưa được công bố trên thế giới. Trình tự amino acid đoạn gen mã hóa protein Rho được phân tích so sánh với protein Rho ở các loài khác. Kết quả so sánh được thể hiện trên hình 5 cho thấy, trình tự amino acid protein Rho tôm sú Việt Nam có sự tương đồng 100% so với protein Rho tôm thẻ Nhật Bản. Lớp giáp xác 10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Shrimp-Pm ---------------------------------------------------------------------------GQEDY Shrimp-Mj --------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Drosophila --------------MTTIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Worm MCSCFRRTRDLSWEMAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Mosquito --------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Fish --------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDSKQVELALWDTA..... Frog --------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Chicken --------------MAAIRKKLVVVGDGACGKTCLLIVFSKDEFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Mouse --------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... Human --------------MAAIRKKLVVVGDGACGKTCLLIVFSKDEFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVELALWDTA..... 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Shrimp-Pm DRLRPLSYPDTDVILMCFSIDSPDSLENIPEKWTPEVKHFCPNVPIILVGNKKDLRNDAPTIKELLKMKQEPVKPEEGRN Shrimp-Mj ................................................................................ Drosophila ...................V......................................PN..RD.A.........Q...A Worm ..........................................................ES.RR..A........T....G Mosquito ...................V......................................PH.....A.........Q...A Fish ..........................................................EH.RR..Q.............D Frog ..........................................................EH.RR..T.............D Chicken ...................V.............V...............A........EHVRN..AR......RT.D..A Mouse .............L.L....GN...FG...H..I................S.......FY..Q..A.R..A..R..Q.QG Human ...................V.............V...............A......S.EHVRT..AR......RTDD..A 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Shrimp-Pm MAEKI--------------------------------------------- Shrimp-Mj .....NAFAYLECSAKTKEGVREVFETATRAALAVKKK----KKPKCTLL Drosophila .....NAFAYLECSAKSKEGVRDVFETATRAALQVKKR----KKTRCLLL Worm ..D..GAFGYLECSAKTKEGVREVFEMATRAALQVKKK----RKGKCLIL Mosquito .....NAFAYLECSAKSKEGVREVFETATRAALQVKKK----KKSKCVLL Fish ..NR.NAFGYLECSAKTKEGVREVFEMATRAALQAKKRG---KKNACALL Frog ..NR.SAYGYMECSAKTKDGVREVFELATRAALQARRGK---KKTTCLLI Chicken ..IR.QAYDYLECSAKTKEGVREVFETATRAALQKRYGTQNGCINCCKVL Mouse L.NS.GAFEYVECSAKTKDGVRRVFEKATRAALQTNRVK---KKTGCFVF Human ..VR.QAYDYLECSAKTKEGVREVFETATRAALQKRYGSQNGCINCCKVL Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 145 - 150 149 và côn trùng là 2 lớp được xếp vào phân ngành giáp xác, đoạn protein Rho ở sâu và ruồi giấm cũng có độ tương đồng cao so với đoạn protein Rho ở tôm. Tuy nhiên, muỗi thuộc lớp côn trùng nhưng có trình tự amino acid giống với protein Rho ở người, chuột hơn so với tôm, sâu và ruồi giấm. Kết quả nghiên cứu phân lập đoạn gen Rho của chúng tôi là cơ sở quan trọng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các protein quan trọng này. KẾT LUẬN Chúng tôi đã tiến hành tạo dòng và xác định trình tự một phần đoạn gen Rho từ mô gan của tôm sú bị bệnh đốm trắng, trình tự đoạn gen Rho đã được đăng ký trên Genbank với mã số JN617867. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dich học cơ sở, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, 340 tr. [2]. Hoàng Thị Thu Yến, Kim Thị Phương Oanh, Trần Trung Thành, Phạm Anh Tuấn, Nông Văn Hải (2010), "Phân lập và xác định trình tự hoàn chỉnh cDNA mã hóa syntenin liên quan đến đáp ứng miễn dịch đối với bệnh đốm trắng ở tôm sú (Penaeus monodon)", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr. 155-163. [3]. Chimini G., Chavrier P. (2000), "Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment", Nat Cell Biol, 2(10), pp. 191-196. [4]. Chubb J. R., Wilkins A., Thomas G. M., Insall R. H. (2000), "The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement", J Cell Sci 113(4), pp. 709-719. [5]. Kondo M., Itami T., Takahashi Y., Fujii R., Tomonaga S. (1998), "Ultrastructural and cytochemical characteristics of phagocytes in kuruma prawn", Fish Pathol, 33, pp. 421-427. [6]. Pan D., He N., Yang Z., Liu H., Xu X. (2005), "Differential gene expression profile in hepatopancreas of WSSV-resistant shrimp (Penaeus japonicus) by suppression subtractive hybridization", Dev Comp Immunol, 29(2), pp. 103-112. [7]. Perkel J. M. (2009), "Shrimp study exposes mechanisms of innate immunity", J Proteome Res, 8(3), pp. 1107. [8]. Rattanachai A., Hirono I., Ohira T., Takahashi Y., Aoki T. (2004), "Molecular cloning and expression analysis of alpha 2-macroglobulin in the kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus", Fish Shellfish Immunol, 16(5), pp. 599-611. [9]. Tassanakajon A., Klinbunga S., Paunglarp N., Rimphanitchayakit V., Udomkit A., Jitrapakdee S., Sritunyalucksana K., Phongdara A., Pongsomboon S., Supungul P., Tang S., Kuphanumart K., Pichyangkura R., Lursinsap C. (2006), "Penaeus monodon gene discovery project: the generation of an EST collection and establishment of a database", Gene, 384, pp. 104-112. [10]. Vargas-Albores F., Yepiz-Plascencia G. (1998.), "Shrimp immunity: A review", Trends Comp Biochem Physiol, 5, pp. 195-210. Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 145 - 150 150 SUMMARY CLONING AND SEQUENCING OF GENE FRAGMENT ENCODING RHO PROTEIN RELATED TO MECHANISM OF PHAGOCYTOSIS IN PENAEUS MONODON Hoang Thi Thu Yen1*, Kim Thi Phuong Oanh2, Nong Van Hai2 1College of Sciences – TNU, 2Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology Rho protein, a member of the Ras small GTPase superfamily, has functions involved phagocytosis mechanism, a main immune mechanism in shrimp. In this study, we first isolated Rho gene from black tiger shrimp (P. monodon) infected WSSV. To amplify and sequence the Rho gene fragment, we designed primer pairs based on conserved amino acid sequences of Rho protein in some known species. Then, RT-PCR products were cloned in pCR2.1 vector and sequenced. The collected Rho gene had size of 272 bp, encoding 90 amino acids. Nucleotide sequence of the Rho gene was submitted to GenBank with accession number JN617867. Our research results had a great contribution to studying structure of complete Rho gene and elucidating the function of Rho. Key words: Black tiger shrimp, Penaeus monodon, immune related gene, Rho protein, phagocytosis, Ras small GTPase superfamily protein * Tel: 0912 896298, Email: yenhtt79@gmail.com