Tạo dòng và biểu hiện phân đoạn của gen DFNB59 mã hóa cho Pejvakin của người ở vi khuẩn Escherichia coli - Nguyễn Thị Kim Cúc

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76 70 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PHÂN ĐOẠN CỦA GEN DFNB59 MÃ HÓA CHO PEJVAKIN CỦA NGƯỜI Ở VI KHUẨN Escherichia coli Nguyễn Thị Kim Cúc1*, Kazutada Watanabe2, Manabu Toyoshima2, Yasushi Shimoda2 1Trường Đại học Nha trang, *kimcuc03@gmail.com 2Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản TÓM TẮT: DFNB59 (Deafness, autosomal recessive 59) là một gen được xác định nằm trên nhiễm sắc thể 2q31.1-q31.3, đột biến trên gen này có liên quan đến tật điếc không có hội chứng ở người. DFNB59 mã hóa cho pejvakin, một protein dài 352 amino acid. Pejvakin là protein có cùng nguồn gốc (paralog) với DFNA5, một protein thuộc họ gasdermin chưa rõ chức năng cũng liên quan đến tật điếc. Trong nghiên cứu này, plasmid tái tổ hợp pBluescript II SK mang gen mã hóa cho protein pejvakin của người (DFNB59) được sử dụng làm mạch khuôn cho việc khuếch đại phân đoạn gen f1DFNB59, phân đoạn gen này sau đó được tạo dòng vào plasmid pGEX-3X và biến nạp vào vi khuẩn vi khuẩn E. coli Top 10 để lưu giữ. Plasmid tái tổ hợp pGEX-3X mang f1DFNB59 từ các thể biến nạp E. coli Top 10 thành công sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E. coli BL21 để tiến hành biểu hiện protein đích dung hợp với Glutathione-S- Transferase (GST). Protein đích dung hợp với GST sau đó được tiến hành tinh sạch bằng phương pháp sắc lý ái lực với Glutathione. Protein thu được sau tinh sạch (hơn 40 kDa) phù hợp để sử dụng làm protein kháng nguyên cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin. Từ khóa: Gen DFNB59, protein pejvakin, protein dung hợp, mất thính giác, tật điếc. MỞ ĐẦU Khác với tật điếc có hội chứng (syndromic deafness), tật điếc không có hội chứng (nonsyndromic deafness) ở người liên quan đến việc mất thính giác mà không đi kèm với các biểu hiện bất thường khác [9, 11]. Phần lớn, tật điếc không có hội chứng được di truyền theo gen lặn có liên quan đến các đột biến của cả 2 alen trên một gen. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy, hơn 10 gen và locus có thể gây ra các mức độ mất hoặc giảm thính giác khác nhau ở người. Trong đó, các đột biến trên gen DFNB59 (PJVK) được xác định là nguyên nhân gây ra sự mất thính giác có hoặc không có đi kèm bệnh thần kinh thính giác [6, 7, 11]. Gen DFNB59 nằm trên nhiễm sắc thể 2q31.2, mã hóa cho protein pejvakin, một protein đóng vai trò trong dẫn truyền thần kinh [3]. Các đột biến trên gen này có thể gây ra sự mất thính giác ổn định hoặc tiến triển có hoặc không có kèm theo các rối loạn thần kinh thính giác (auditory neuropathy spectrum disorder) [1, 2, 3, 4, 5]. Gen DFNB59 gồm có 7 exon, dài 9,8 kb trong trình tự genome, và mã hóa cho một protein gồm 352 amino acid (khối lượng phân tử suy luận của protein này khoảng 39,9 kDa; điểm đẳng điện là 9,31). Việc xác định DFNB59 như là gen gây ra bệnh thần kinh thính giác (auditory neuropathy) đã được chứng minh và khẳng định bằng việc tìm ra các đột biến DFNB59 trong các đối tượng khiếm thính từ các họ 312, 700, 705 và 710 ở Iran. Các đột biến được phát hiện trong các cá thể khiếm thính này thường là sự thay thế của amino acid trên pejvakin của người chẳng hạn: ở họ 705 tương ứng với việc thay thế của arginine 183 với tryptophan (547C-T; R183W), ở họ 312 tương ứng với sự thay thế threonine 54 với isoleucine (161C-T; T54I) [3]. Các nghiên cứu của Delmaghani et al. (2006) [3] về các mô hình chuỗi dự đoán của pejvakin cho thấy có sự tồn tại của tín hiệu định vị nhân (các amino acid từ vị trí 249-258), có sự hiện diện của motif liên kết với kẽm và tương tác với DNA (các amino acid ở vị trí 305-331). So sánh pejvakin với protein DFNA5 cho thấy, 32% giống và 54% tương đồng với protein DFNA5 trên một đoạn trình tự dài 250 amino acid. Bên cạnh đó, các tổ chức exon ở gen DFNB59 và gen DFNA5 hoàn toàn tương đồng với nhau. Vì thế, pejvakin và protein DFNA5 đã được xác định là có chung nguồn gốc và pejvakin là một thành viên của họ protein gasdermin DFNA5. Nguyen Thi Kim Cuc et al. 71 Để sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin phục vụ cho những nghiên cứu về tật điếc do đột biến gen DFNB59 và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh, việc tạo dòng và biểu hiện toàn bộ trình tự gen mã hóa cho protein pejvakin (cDNA DFNB59) là rất cần thiết. Tuy nhiên, việc biểu hiện toàn bộ trình tự gen DFNB59 (full-length DFNB59) ở E. coli với các hệ thống vector biểu hiện gen như pET- DEST42, pET-15b và pGEX-3X đã được thực hiện đều không thành công. Một trong những nguyên nhân được kể đến có thể do protein được biểu hiện gây độc với tế bào E. coli. Từ lý do trên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn một phân đoạn của gen DFNB59 (dài 362 bp tính từ vị trí nucleotide 150 đến nucleotide vị trí 512 của trình tự gen DFNB59, mã hóa cho protein khoảng 13 kDa) để tiến hành tạo dòng gen, đồng thời biểu hiện và tinh sạch protein đích dung hợp GST cho mục đích làm kháng nguyên trong sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các chủng vi khuẩn E. coli Top 10 và BL21 (Invitrogen) được sử dụng làm tế bào vật chủ cho tạo dòng và biểu hiện gen được nuôi cấy trong môi trường Luria Bertani (LB) (Merck). Các tế bào E. coli sau biến nạp sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB có chứa ampicillin (100 µg/ml), sau đó cấy trên đĩa thạch LB có chứa ampicillin (LB-Amp) và cảm ứng biểu hiện gen bằng 0,1 mM IPTG (isopropyl--D-thio- galacto-pyranoside). Plasmid tái tổ hợp pBluescript II SK/DFNB59 (cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Neurobioengineering, Trường đại học Công nghệ Nagaoka, Niigata, Nhật bản) được sử dụng để thu nhận phân đoạn gen f1DFNB59; pGEX- 3X (BioLabs, Anh) được sử dụng cho việc biểu hiện gen. Các enzyme giới hạn EcoRI, BamHI, PstI, SacI, HindIII, NdeI (Toyobo, Nhật Bản) được sử dụng để mở vòng plasmid và kiểm tra vector tái tổ hợp. PCR khuếch đại phân đoạn gen f1DFNB59 Dựa vào trình tự gen của phân đoạn gen f1DFNB59 (dài 362 bp tính từ nucleotide ở vị trí 150 đến nucleotide ở vị trí 512 trên trình tự gen DFNB59 trong Ngân hàng Gen (NCBI), cặp mồi BamHI-NdeI/F (5’-GCGGATCC ATATGT TTGCTGCTGCTACCAAG -3’) và EcoRI/R (5’-CGGAATTCATTTGGTCACGACACCAA -3’) được thiết kế để dùng cho phản ứng PCR. Thành phần phản ứng PCR gồm: 10 µM cho mỗi loại mồi, 2 mM mỗi loại dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 10x KOD plus buffer, 25 mM MgSO4, mạch khuôn pBluescript II SK/DFNB59, KOD plus polymerase (Roche, Appied science, Đức). PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (Thermal cycler) với 35 chu kỳ: giai đoạn 1 nâng nhiệt đến 94oC trong 15 giây; giai đoạn 2 hạ nhiệt xuống 52oC trong 30 giây; giai đoạn 3 nâng nhiệt đến 68oC trong 1 phút. Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%. Phương pháp tạo dòng f1DFNB59 vào pGEX-3X ở E. coli Top 10 Tất cả các thao tác với DNA sử dụng trong tạo dòng được thực hiện theo mô tả của Sambrook & Russell (2001) [10]. Đoạn gen f1DFNB59 sau khi được khuếch đại bằng phương pháp PCR và vector pGEX-3X được xử lý các enzyme giới hạn BamHI/EcoRI với H- buffer và ủ ở 37oC trong 5 giờ. Sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ được điện di trên gel agarose và tinh sạch từ gel bằng bộ kit QIA quick Gel Extraction (Qiagen). Phản ứng nối f1DFNB59 vào pGEX-3X/BamHI/EcoRI được thực hiện bởi T4 DNA ligase (Toyobo, Nhật Bản) ở 16oC trong 1 giờ. Sản phẩm nối sau đó được biến nạp vào E. coli BL21 và trải trên môi trường thạch LB-Amp. Các khuẩn lạc được chọn lọc dựa trên kiểu hình kháng ampicillin và được kiểm tra bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn (sử dụng 3 cặp enzyme BamHI/EcoRI, NdeI/EcoRV và HindIII/PstI) trên các plasmid thu được. Các tế bào E. coli Top 10 có mang plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 sẽ được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp từ các vi khuẩn E. coli được biến nạp Các thể biến nạp từ một khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong 5 ml môi trường LB-Amp ở 37oC trong 16 giờ. Các tế bào được thu bằng cách li tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút ở TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76 72 nhiệt độ phòng, hòa cặn với 400 µl STET buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, và 5% Triton X-100 v/v). Thêm vào 40 µl Lysozyme giữ trong 3 phút, đun sôi trong 1 phút, làm lạnh, sau đó li tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, thu dịch nổi và loại bỏ cặn. Thêm vào 350 µl Isopropanol, li tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi và làm khô trong 5 phút. Thêm 400 µl Ethanol 70%, li tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi. Làm khô cặn trong 15 phút và hòa tan trong 50 µl TE buffer (Tris- EDTA buffer). Phương pháp biểu hiện protein đích dung hợp GST ở E. coli Các plasmid tái tổ hợp pGEX- 3X/f1DFNB59 tách chiết từ các tế bào E. coli Top 10 đã được khẳng định mang pGEX- 3X/f1DFNB59 được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 và trải trên môi trường thạch LB-Amp. Các khuẩn lạc được chọn lọc dựa trên kiểu hình kháng ampicillin. Các tế bào E. coli BL21 có mang plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 sẽ được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (100 µg/ml) và chloramphenicol (30 µg/ml) ở 37oC trong 16 giờ, sau đó 50 µl dịch nuôi cấy sang 5 ml môi trường LB-Amp ở 37oC trong 3 giờ. Sự biểu hiện gen được cảm ứng bằng cách thêm isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) đến nồng độ cuối cùng đạt 0,1 mM. Tế bào vi khuẩn sau đó được phá vỡ bằng phương pháp sonication để kiểm tra khả năng biểu hiện gen và tính hòa tan của protein dung hợp bằng phương pháp SDS-PAGE. Phương pháp tinh sạch protein dung hợp GST (Glutathione S-transferase) Protein dung hợp GST được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dịch protein (lọc qua màng 0,45 µm) được gắn vào cột sepharose ở 4oC trong 2 giờ. Sau đó li tâm ở 1.000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ dịch nổi. Tiến hành rửa cột bằng PBS (Phosphate Buffered Saline) lạnh 4 lần ở 4oC trong 3 phút và li tâm loại PBS ở 1.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu 5 phân đoạn protein bằng phương pháp rửa giải (elution) với 1 ml Glutathione Elution buffer tương ứng với 5 lần rửa giải. Các cột sepharose sau khi sử dụng được rửa sạch và bảo quản trong ethanol 20% ở 4oC để sử dụng cho các lần tinh sạch sau. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tạo dòng E. coli Top 10 mang plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR của gen f1DFNB59 trên gel agarose. Thang chuẩn DNA (M), đối chứng âm (giếng 1), sản phẩm PCR (giếng 2) Để tách phân đoạn gen f1DFNB59, đoạn gen 362 bp được khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp pBluescript II SK/DFNB59 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu BamHI-NdeI/F và EcoRI/R đã được thiết kế có chứa các vị trí cắt của enzyme giới hạn tương ứng BamHI và EcoRI. Kết quả của phản ứng PCR thu được băng sản phẩm có kích thước khoảng 362 bp tương ứng với kích thước của f1DFNB59 (giếng 2, hình 1). Sản phẩm PCR f1DFNB59 và vector pGEX-3X được xử lý enzyme cắt giới hạn BamHI và EcoRI trước khi tiến hành phản ứng nối bởi T4-DNA ligase. Sản phẩm nối sau đó được biến nạp vào E. coli Top 10 và trải trên đĩa thạch LB-Amp để chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59. Plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 được tách chiết và kiểm tra bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn. Nguyen Thi Kim Cuc et al. 73 f1DFNB59-pGEX-3X.070112.nuc 5314 bp ApaLI 18 SspI 164 Csp45I 654 BamHI 934 NdeI 939 HindIII 1279 EcoRI 1306 BspHI 1564 BspHI 1669 SspI 1702 ApaLI 1837 PstI 2263 BspHI 2677 ApaLI 3083 ApaLI 3993 ApaI 4220 EcoRV 4461 HpaI 4517 f1DFNB59 1 Hình 2. Sơ đồ cắt enzyme giới hạn của vector tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 (pGEX-3X mang phân đoạn gen f1DFNB59) Hình 3. Kiểm tra pGEX-3X/f1DFNB59 bằng enzyme cắt giới hạn. Thang chuẩn DNA (M), pGEX-3X/f1DFNB59 cắt bởi PstI và HindIII (giếng 1), pGEX- 3X/f1DFNB59 cắt bởi NdeI và EcoRV (giếng 2) Dựa trên bản đồ cắt enzyme giới hạn của pGEX-3X/f1DFNB59 (hình 2), hai phản ứng cắt enzyme giới hạn tương ứng với việc sử dụng hai cặp enzyme PstI/HindIII và NdeI/EcoRV được chọn để kiểm tra sự chèn của f1DFNB59 trong vector tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 (hình 3). Các enzyme giới hạn này đều cắt 1 điểm duy nhất trên vector tái tổ hợp pGEX- 3X/f1DFNB59 và mỗi cặp enzyme được chọn đều có 1 điểm cắt trên vector và 1 điểm cắt trên đoạn chèn f1DFNB59. Kết quả của phản ứng cắt pGEX- 3X/f1DFNB59 bởi PstI/HindIII (cắt ở vị trí nucleotide 2263 và vị trí nucleotide 1279) cho ra 2 băng sản phẩm với kích thước tương ứng là 984 bp và 4330 bp (giếng 1, hình 3). Với phản ứng cắt pGEX-3X/f1DFNB59 bởi NdeI/EcoRV (cắt ở vị trí nucleotide 939 và vị trí nucleotide 4461) cũng cho ra 2 băng sản phẩm với kích thước tương ứng là 3.522 bp và 1.792 bp (giếng 2, hình 3). Các kết quả này cho thấy phân đoạn gen f1DFNB59 đã được chèn đúng trong vector tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 của các thể biến nạp được kiểm tra. Kết quả biểu hiện protein dung hợp GST ở vi khuẩn E. coli BL21 Việc biểu hiện toàn bộ cDNA DFNB59 (full-length DFNB59, 1.059 bp) ở vi khuẩn E. coli BL21 với các hệ thống vector biểu hiện pET-DEST42, pET-15b và pGEX-3X đã được tiến hành nhưng đều không thành công. Một trong các nguyên nhân được phân tích có thể do protein được biểu hiện (pejvakin) là protein độc đối với vi khuẩn E. coli. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến hành biểu hiện một phân đoạn của gen DFNB59 thay vì biểu hiện toàn bộ trình tự DFNB59. Việc biểu hiện một phân đoạn protein của pejvakin vẫn đảm bảo được mục đích của việc sử dụng protein đích làm kháng nguyên cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin. Bên cạnh đó, hệ thống vector dung hợp pGEX-3X ngoài việc làm tăng cường sự biểu hiện và tính tan của protein dung hợp, còn giúp cho quá trình tinh sạch các protein dung hợp được dễ dàng hơn, đồng thời làm tăng khối lượng phân tử của các protein đích, từ đó làm tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các protein dung hợp được sử dụng làm kháng nguyên. Vì vậy, vector pGEX-3X được lựa chọn để biểu hiện protein đích được mã hóa bởi phân đoạn gen f1DFNB59 có đuôi dung hợp GST ở vi khuẩn E. coli BL21. Việc biểu hiện gen được tiến hành bằng việc bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 0,1 mM trong dịch huyền phù vi khuẩn E. coli BL21 mang pGEX-3X/f1DFNB59. Các mẫu huyền dịch vi khuẩn được thu ở các thời TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76 74 điểm trước khi cảm ứng IPTG và sau khi cảm ứng IPTG 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ để khảo sát khả năng biểu hiện gen. Đồng thời tính tan của protein sau khi biểu hiện cũng được kiểm tra trong các mẫu dịch nổi và cặn tế bào bằng phương pháp SDS-PAGE (hình 4). Hình 4. Kết quả SDS-PAGE của các protein ở vi khuẩn E. coli BL21/pGEX-3X-f1DFNB59 sau khi cảm ứng IPTG. Thang chuẩn protein (M), E. coli BL21/pGEX-3X-f1DFNB59 không được cảm ứng IPTG (giếng 1), E. coli BL21/pGEX-3X-f1DFNB59 được cảm ứng IPTG sau 1 giờ (giếng 2), sau 2 giờ (giếng 3), sau 3 giờ (giếng 4), protein ở dịch nổi (giếng 5), protein ở cặn tế bào (giếng 6). Khối lượng phân tử suy luận của protein đích được mã hóa bởi phân đoạn gen f1DFNB59 khoảng 14,5 kDa. Protein đích sau khi biểu hiện được dung hợp với GST (26 kDa) có khối lượng phân tử khoảng hơn 40 kDa. Kết quả phân tích SDS-PAGE trên hình 4 cho thấy, protein đích dung hợp GST (ở tất cả các giếng) đã được biểu hiện với băng protein có kích thước khoảng hơn 40 kDa, kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước dự đoán của protein đích. Bên cạnh đó việc cảm ứng biểu hiện bằng IPTG cũng cho thấy lượng protein được tổng hợp tăng dần từ mẫu không cảm ứng (giếng 1) đến mẫu cảm ứng (giếng 2) và tăng dần theo thời gian sau khi cảm ứng (giếng 2-4). Kết quả kiểm tra tính tan của protein được biểu hiện cho thấy lượng protein đích tập trung chủ yếu trong dịch nổi sau khi phá vỡ tế bào (giếng 5), trong khi ở cặn tế bào có lượng protein đích không đáng kể (giếng 6). Điều này chứng tỏ protein đích đã được biểu hiện và có tính tan tốt, đặc điểm này rất thuận lợi cho việc tách chiết và tinh sạch protein. Kết quả tinh sạch protein đích dung hợp GST Hình 5. SDS-PAGE của protein dung hợp GST tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực (Glutathione Sepharose 4B). Thang chuẩn protein (M), mẫu trước khi tinh sạch (giếng 1), mẫu sau khi gắn (binding) vào cột (giếng 2), mẫu sau khi rửa cột (giếng 3), các phân đoạn (1- 5) của dịch protein sau khi rửa giải tương ứng với các giếng 4-8. Việc sử dụng đuôi Glutathione-S-transferase (GST) ái lực dựa trên ái lực mạnh của GST với các hạt gel được bao bọc bởi glutathione đã được mô tả bởi Smith & Johnson (1988) [12]. GST là một họ của các protein cytosolic với đa chức năng ở các sinh vật eukaryote. Các dạng đồng đẳng của GST thường không tìm thấy ở vi khuẩn, vì vậy, các protein nội bào của vi khuẩn không cạnh tranh vị trí gắn với protein dung hợp GST trong cột tinh sạch [12]. Để đánh giá khả năng tinh sạch protein đích dung hợp GST bằng phương pháp sắc ký ái lực Glutathione, các mẫu trước và sau khi gắn vào cột tinh sạch và các phân đoạn protein tinh sạch sau khi rửa giải được kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE. Kết quả tinh sạch trên hình 5 Nguyen Thi Kim Cuc et al. 75 cho thấy protein đích dung hợp GST (khoảng hơn 40 kDa) hiện diện ở mẫu trước khi tinh sạch (giếng 1) đã được gắn rất hiệu quả vào cột sắc ký Glutathione, thể hiện ở mẫu sau khi gắn và mẫu rửa cột không thấy có sự hiện diện của băng protein đích (giếng 2, 3). Lượng protein đích sau khi rửa giải được tập trung chủ yếu ở phân đoạn 1 (giếng 4) và phân đoạn 2 (giếng 5), các phân đoạn 3-5 chứa lượng protein đích không đáng kể (giếng 6-8). Tuy nhiên, ngoài băng protein đích, vẫn còn có sự hiện diện của các băng protein tạp khoảng 37 kDa và 50 kDa (giếng 4, giếng 5). Đây có thể là nhược điểm của phương pháp tinh sạch sử dụng Glutathione Sepharose 4B. KẾT LUẬN Đã tạo được dòng vi khuẩn E. coli Top 10 mang plasmid tái tổ hợp pGEX-3X/f1DFNB59 và biểu hiện thành công protein đích dung hợp GST ở vi khuẩn E. coli BL21, đồng thời xác định được phương pháp tinh sạch sử dụng Glutathione Sepharose 4B có hiệu quả trong việc tinh sạch protein đích dung hợp GST. Kết quả này bước đầu chuẩn bị được nguồn nguyên liệu (protein kháng nguyên) cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin. Lời cảm ơn: Công trình này được thực hiện trong khuôn khổ của dự án “Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng pejvakin”. Các thí nghiệm được thực hiện tại Lab Neuroengineering, Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Niigata, Nhật Bản. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Borck G., Rainshtein L., Hellman-Aharony S., Volk A. E., Friedrich K., Taub E., Magal N., Kanaan M., Kubisch C., Shohat M., Basel-Vanagaite L., 2012. High frequency of autosomal-recessive DFNB59 hearing loss in an isolated Arab population in Israel. Clin. Genet., 82(3): 271-276. 2. Collin R. W. J., Kalay E., Oostrik J., Caylan R., Wollnik B., Arslan S., den Hollander A. I., Birinci Y., Lichtner P., Strom T. M., Toraman B., Hoefsloot L. H., Cremers C. W. R. J., Brunner H. G., Cremers F. P. M., Karaguzel A., Kremer H., 2007. Involvement of DFNB59 mutations in autosomal recessive nonsyndromic hearing impairment. Hum. Mutat., 28: 718-723. 3. Delmaghani S., del Castillo F. J., Michel V., Leibovici M., Aghaie A., Ron U., Van Laer L., Ben-Tal N., Van Camp G., Weil D., Langa F., Lathrop M., Avan P., Petit C., 2006. Mutations in the gene encoding pejvakin, a newly identified protein of the afferent auditory pathway, cause DFNB59 auditory neuropathy. Nat. Genet., 38: 770-778. 4. Ebermann I., Walger M., Scholl H. P., Charbel I. P., Lüke C., Nürnberg G., Lang-Roth R., Becker C., Nürnberg P., Bolz H. J., 2007. Truncating mutation of the DFNB59 gene causes cochlear hearing impairment and central vestibular dysfunction. Hum. Mutat., 28(6): 571-577. 5. Hashemzadeh C. M., Simpson M. A., Farrokhi E., Dolati M., Hoghooghi R. L., Amani G. S., Crosby A. H., 2007. Novel mutations in the pejvakin gene are associated with autosomal recessive non- syndromic hearing loss in Iranian families. Clin. Genet., 72(3): 261-263. 6. Hilgert N., Smith R. J., Van C. G., 2009. Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: Which ones should be analyzed in DNA diagnostics? Mutat. Res., 681(2-3): 189-196. 7. Irshad S., Shahzad B., Yaqoob S., 2012. A review on autosomal recessive non- syndromic hearing impairment. Basic Sciences of Medicine, 1(3): 12-18. 8. Piatto V. B., Secches L. V., Arroyo M. A. S., Lopes A. C. P., Maniglia J. V., 2009. Nonsyndromic Deafness-Molecular Update. The Open Biology Journal, 2: 80-90. 9. Sadaf N., 2012. Genetics of nonsyndromic recessively inherited moderate to severe and progressive deafness in humans, hearing loss. Dr. Sadaf Naz (Ed.), ISBN: 978-953- 51-0366-0, InTech. 10. Sambrook J., Russell D. W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p.1-170. TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 70-76 76 11. Santarelli R., 2010. Information from cochlear potentials and genetic mutations helps localize the lesion site in auditory neuropathy. Genome Med. , 2(12):91. 12. Smith D. B., Johnson K. S., 1998. Single- step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene., 67(1): 31-40. A STUDY ON CLONING AND EXPRESSION OF A FRAGMENT OF DFNB59 GENE ENCODING HUMAN PEJVAKIN IN Escherichia coli Nguyen Thi Kim Cuc1 , Kazutada Watanabe2, Manabu Toyoshima2, Yasushi Shimoda2 1Nha Trang University 2Nagaoka University of Technology, Japan SUMMARY DFNB59 is a newly identified gene on chromosome 2q31.1q31.3. The mutations on DFNB59 involved human nonsyndromic deafness. DFNB59 encodes pejvakin, a 352-residue protein. Pejvakin is a paralog of DFNA5, a protein of unknown function of the gasdermin family also involved deafness [3]. In this research, pBluescript II SK was used as the template for amplification of the fragment f1DFNB59. This fragment was then cloned in pGEX-3X and transformed to E. coli Top 10 for storage. The recombinant plasmids pGEX-3X containing f1DFNB59 from transformations of E. coli Top 10 was transformed to E. coli BL21 for expression of the GST-fusion protein. This GST-fusion proteins was purified by affinity chromatography using immobilized Glutathione. The protein (>40 kDa) obtained after purification can be used as an antigen for production of monoclonal antibodies against pejvakin. Keywords: DFNB59 gene, GST-fusion protein, nonsyndromic deafness, pejvakin proteins. Ngày nhận bài: 15-7-2013