Tạo chủng vi khuẩn escherichia coli biểu hiện tái tổ hợp cis-Prenyltransferase 1 có khả năng tổng hợp neryl pyrophosphate - La Ngọc Thùy Vân

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 224-230 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. TẠO CHỦNG VI KHUẨN Escherichia coli BIỂU HIỆN TÁI TỔ HỢP cis-PRENYLTRANSFERASE 1 CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP NERYL PYROPHOSPHATE La Ngọc Thùy Vân1, Lê Thị Kim Lan1, Khuất Lê Uyên Vy1, Đinh Minh Hiệp2, Eran Pichersky3, Nguyễn Thị Hồng Thương1* 1Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG HCM, *nththuong@hcmus.edu.vn 2Ban quản lý Khu nông nghiệp công nghệ cao, TP.HCM 3Trường Đại học Michigan, Ann Arbor, USA TÓM TẮT: Neryl pyrophosphate (NPP), còn gọi là neryl diphosphate (NDP), là dạng đồng phân cấu hình cis của genaryl pyrophosphate (GPP). Trước đây, các monoterpene synthase ở đa số các loài thực vật được chứng minh sử dụng GPP làm cơ chất để tổng hợp các monoterpene và dẫn xuất monoterpenoid. Tuy nhiên, năm 2009, Schilmiller và cộng sự đã xác định được một gen mới mã hóa cho phellandrene synthase (PHS), enzym này biểu hiện ở lông tiết của cà chua Solanum lycopersicum và xúc tác tổng hợp β-phellandrene từ cơ chất NPP. Nhóm nghiên cứu này cũng đã xác định được gen mã hóa cis-prenyltransferase 1 (CPT1) có khả năng xúc tác tổng hợp NPP từ dimethylallyl diphosphate (DMAPP) và isopentenyl diphosphate (IPP). Bởi vì tế bào E. coli có khả năng tổng hợp GPP nhưng không tổng hợp được NPP, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen CPT1 trong tế bào E. coli nhằm thu nhận chủng E. coli có khả năng tạo ra NPP. Khi biểu hiện đồng thời hai enzym CPT1 và PHS trong tế bào E. coli, cơ chất NPP được tổng hợp bởi CPT1 đã được sử dụng hiệu quả bởi phelandrene synthase PHS cho sự sinh tổng hợp β-phelandrene de novo. Những nghiên cứu sâu hơn về khả năng cải biến con đường trao đổi chất ở dòng tế bào E. coli biểu hiện tái tổ hợp CPT1 và các điều kiện để tối ưu hóa việc thu nhận sản phẩm sẽ mở ra hướng tiếp cận mới cho các nghiên cứu tổng hợp các monoterpene và dẫn xuất monoterpenoid có giá trị từ cơ chất mới NPP. Từ khóa: neryl pyrophosphate, cis-prenyltransferase 1, monoterpene synthase. MỞ ĐẦU Terpenoid bao gồm nhóm hợp chất tự nhiên đa dạng về mặt cấu trúc, được tổng hợp từ những đơn vị có 5 nguyên tử carbon là IPP và DMAPP thông qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) thường gặp ở vi khuẩn và thực vật hoặc con đường mevalonate (MEV) phổ biến trong các sinh vật eukaryote [1, 3]. IPP và DMAPP được kết hợp với nhau, với sự loại đi một nhóm phosphate, hình thành các chất trung gian có số nguyên tử carbon lớn hơn là geranyl diphosphate GPP (C10), farnesyl diphosphate FPP (C15), geranylgeranyl diphosphate GGPP (C20). Enzym xúc tác phản ứng này thuộc họ prenyltransferase. Sự kết nối đầu-đuôi của DMAPP với 1 đơn vị IPP được xúc tác bởi GDP synthase (còn gọi là GPP synthase) dẫn tới sự hình thành GPP, tiền chất tổng hợp monoterpene. Sự kết hợp của DMAPP với 2 đơn vị IPP sẽ tạo ra FPP, tiền chất để tổng hợp sesquiterpene; với 3 đơn vị IPP sẽ tạo ra GGPP, tiền chất để tổng hợp diterpene. GPP, FPP, và GGPP là những prenyldiphosphate có cấu hình trans. Enzym sử dụng cơ chất prenyldiphosphate để tổng hợp terpene thuộc họ enzym terpene synthase [1]. Hiện nay, các dự án giải mã trình tự bộ gen của một số loài thực vật quan trọng ứng dụng trong nông nghiệp và y dược đang được triển khai trên thế giới. Sự sẵn sàng của cơ sở dữ liệu trình tự bộ gen ở các loài này tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà nghiên cứu tìm kiếm, phân lập và khảo sát chức năng của các gen mới, đặc biệt các gen tham gia trong sự chuyển hóa hợp chất thứ cấp nói chung và hợp chất nhóm terpenoid nói riêng [4]. Trước đây, các terpene synthase được tìm thấy ở đa số các loài được chứng minh sử dụng trans-prenyldiphosphate làm cơ chất. Đến năm 2009, Schilmiller và cộng sự đã tìm thấy ở lông tiết cà chua S. lycopersicum một gen mới mã hóa cho một monoterpene synthase chủ yếu sử dụng NPP, đồng phân cấu hình cis của GPP, làm cơ chất tổng hợp nên β- phellandrene và enzym được đặt tên là phellandrene synthase (PHS). Cũng chính nhóm nghiên cứu này đã tìm ra gen cis-prenyltransferase 1 (CPT1) mã hóa cho enzym tổng hợp cơ chất NPP từ DMAPP và IPP [5]. Để xây dựng một danh mục các gen/enzym đáng tin cậy, các nhà nghiên cứu cần khảo sát đặc tính sinh hóa của các enzym được mã hóa bởi các cDNA, đa số được liệt kê trong các cơ sở dữ liệu bộ gen và sản phẩm phiên mã nhưng chưa được chú thích chính xác. Mặc dù các kỹ thuật phân tử và sinh hóa sử dụng trong khảo sát chức năng của các enzym tái tổ hợp được mã hóa bởi các cDNA tương ứng đã phát triển, những nghiên cứu này đôi khi bị hạn chế do chi phí cao của cơ chất và các chất chuẩn cần sử dụng để khảo sát hoạt tính terpene synthase. Ngoài ra, hầu hết các hợp chất terpenoid chỉ được tích lũy tự nhiên ở lượng rất nhỏ trong thực vật khiến cho việc chiết xuất các hợp chất terpenoid từ thực vật có giá thành cao, năng suất thấp, tiêu tốn nhiều nguồn vật liệu tự nhiên. Sự tổng hợp các hợp chất nhóm terpenoid bằng con đường tổng hợp hóa học thường không dễ dàng do chúng có nhiều tâm bất đối và tính chất đặc hiệu lập thể. Sự sinh tổng hợp terpenoid thông qua các phản ứng in vitro sử dụng enzym tinh sạch cũng rất tốn kém. Do đó, kỹ thuật cải biến con đường trao đổi chất nhằm tạo các tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lượng lớn terpenoid là một phương án thay thế tiềm năng. Tế bào E. coli có khả năng tổng hợp GPP nhưng không tổng hợp được NPP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cis-prenyltransferase 1 (CPT1) phân lập từ cà chua S. lycopersicum trong tế bào E. coli nhằm thu nhận chủng E. coli có khả năng tạo ra NPP. Đây là cơ sở cho việc mở rộng các nghiên cứu ứng dụng monoterpene synthase TPS để tổng hợp các monoterpene khác nhau từ cơ chất mới NPP thông qua kỹ thuật cải biến con đường trao đổi chất ở tế bào vi khuẩn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi sinh vật và vector Vector pACYCDuet-1 thuộc hệ thống vector Duet (Novagen) mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol. Plasmid pEXP5-NT-TOPO mang cDNA mã hóa phellandrene synthase (PHS) từ S. lycopersicum và plasmid pGEM-T mang cDNA mã hóa cis-prenyltransferase 1 (CPT1) từ S. lycopersicum được cung cấp bởi Giáo sư Eran Pichersky (Trường Đại học Michigan, Hoa Kỳ). Chủng E. coli TOP10 (Invitrogen) được dùng để nhân bản plasmid. Chủng E. coli BL21(DE3) (Invitrogen) được dùng để tạo dòng và biểu hiện protein mục tiêu với sự cảm ứng của IPTG. Tổng hợp đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI Đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai đầu so le tương hợp với hai đầu so le của vector pACYCDuet-1 (đã được cắt với hai enzym cắt giới hạn NdeI và XhoI) được tổng hợp theo phương pháp “sticky-end PCR” [6]. Plasmid pGEM-T chứa trình tự cDNA mã hóa CPT1 được sử dụng làm khuôn và các mồi được sử dụng có trình tự như sau: NdeI-CPT1-F (mồi xuôi 1): 5’-TATGGGT GCATTCAAAGGTATTC-3’; CPT1-R (mồi ngược 1): 5’-TCAATATGTGTGTCCACCAA AAC-3’; CPT1-F (mồi xuôi 2): 5’-TGGGTGCATTCAAAGGTATTC-3’; XhoI-CPT1-R (mồi ngược 2): 5’-TCGATCAATATG TGTGTCCAC-3’. Quy trình tổng hợp được sơ đồ hóa ở hình 1. Tạo dòng trình tự mã hóa CPT1 vào vector pACYCDuet-1 Vector pACYCDuet-1 được cắt mở vòng tạo đầu so le bằng hai enzym NdeI và XhoI. Đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI được chèn vào vector pACYCDuet-1 thông qua phản ứng nối được xúc tác bởi T4 DNA ligase trong 2 giờ ở 22oC. Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Các thể biến nạp E. coli TOP10/pACYCDuet-1-CPT1 được sàng lọc bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi NdeI-CPT1 và T7 Terminator. Dòng tế bào E. coli TOP10/pACYCDuet-1-CPT1 được nhân sinh khối và plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được tách chiết bằng StrataPrep Plasmid Miniprep Kit (Agilent Technologies). Trình tự mã hóa CPT1 trên vector pACYCDuet-1-CPT1 được giải mã với mồi T7 Terminator và so sánh với trình tự CPT1 đã biết để phát hiện các đột biến điểm có thể có trong quá trình PCR. Hình 1. Quy trình tổng hợp đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI bằng phương pháp “sticky-end PCR” [6]. Đoạn DNA được khoanh tròn có hai đầu so le tương hợp với đầu so le được tạo ra khi cắt vector pACYCDuet-1 với hai enzym cắt giới hạn NdeI và XhoI. Biểu hiện CPT1 và PHS trong tế bào E. coli BL21(DE3) Plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Để biểu hiện đồng thời CPT1 với PHS trong tế bào E. coli BL21(DE3), plasmid pEXP5-NT-TOPO-PHS được biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CPT1. Tế bào mang hai plasmid pACYCDuet-1-CPT1 và pEXP5-NT-TOPO-PHS được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 14-16 giờ ở 37oC trong môi trường LB lỏng có bổ sung 100 µg/µl ampicillin và 34 µg/µl chloramphenicol đến khi OD600 đạt giá trị 0,8 thì tiếp tục được cảm ứng với 0,4 mM IPTG ở 22oC trong 5-6 giờ. Dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) chỉ biểu hiện PHS được sử dụng làm đối chứng âm. Phương pháp xác định NPP gián tiếp thông qua sự thủy phân với alkaline phosphatase Ly tâm 15 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn biểu hiện pACYCDuet-1-CPT1 5000 vòng/phút trong 5 phút và thu tủa. Rửa tủa hai lần bằng 1,5ml đệm FastAP (10 mM Tris-HCl pH8; 5 mM MgCl2; 0,1 M KCl; 0,02% Triton X-100; 0,1 mg/ml BSA), sau đó phá màng tế bào bằng sóng siêu âm trong 1,5 ml đệm FastAP. Dịch sau khi phá màng tế bào được ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được thu nhận và ủ với alkaline phosphatase (Thermo Scientific) ở 37oC trong 1 giờ. Phản ứng được thực hiện trong ống thủy tinh (vial) nhỏ và kín để sản phẩm nerol được tạo ra trong phản ứng thủy phân không bị thất thoát. Phương pháp xác định thành phần các chất dễ bay hơi bằng kỹ thuật sắc ký khí (Gas Chromatography-GC) Nerol sinh ra từ sự thủy phân NPP với alkaline phosphatase hoặc monoterpene sinh ra trong dịch nuôi cấy vi khuẩn biểu hiện tái tổ hợp CPT1 và PHS được thu nhận bằng kỹ thuật chiết hexan và được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký khí. Hệ thống GC Agilent 6890N được sử dụng với cột HP innowax có chiều dài 30 m x 250 µm x 0,25 µm (chịu nhiệt độ cao nhất là 250oC) và đầu dò FID. Chương trình nhiệt độ chạy trong 31 phút như sau: nhiệt độ tiêm (giải hấp) 250oC, nhiệt độ đầu dò 250oC. Nhiệt độ đầu 50oC, tăng 15oC/1 phút đến 180oC, tăng 5oC/ 1 phút đến 240oC giữ trong 10 phút. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổng hợp đoạn DNA mang trình tự mã hóa CPT1 có hai đầu so le NdeI và XhoI Kết quả khuếch đại đoạn DNA chứa trình tự mã hóa CPT1 có gắn thêm trình tự nhận biết của enzym cắt giới hạn NdeI ở đầu 5’ hoặc XhoI ở đầu 3’ bằng kỹ thuật PCR cho thấy, ở giếng 1 xuất hiện một vạch DNA nằm dưới vạch 1000 bp của thang DNA chuẩn, với kích thước ~ 837 bp tương đương với kích thước trình tự mã hóa CPT1 (hình 2). Hình 2. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại đoạn trình tự mã hóa CPT1. 1, thang chuẩn DNA 1kb; 2,3: sản phẩm PCR1 với cặp mồi NdeI-CPT1-F và CPT1-R; 4,5: sản phẩm PCR2 với cặp mồi CPT1-F và XhoI-CPT1-R Hình 3. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli TOP10/pACYCDuet-1-CPT1 bằng PCR khuẩn lạc. 1, thang chuẩn DNA 1kb; 2-4, sản phẩm PCR khuẩn lạc của dòng tế bào E. coli TOP10 được biến nạp plasmid pACYCDuet-1-CPT1. Tạo dòng trình tự mã hóa CPT1 vào vector pACYCDuet-1 Đoạn CPT1 có hai đầu so le được chèn vào vector pACYCDuet-1 đã được cắt mở vòng với hai enzym cắt giới hạn NdeI và XhoI. Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli TOP10. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli TOP10 mang plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được thực hiện bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi xuôi CPT1-F và mồi ngược T7 Terminator (hình 3) cho thấy ở giếng 2, 3, và 4 xuất hiện một vạch DNA có kích thước tương đương với kích thước dự đoán là 948 bp, chứng tỏ khuẩn lạc được sử dụng thuộc dòng tế bào vi khuẩn E. coli TOP10 được biến nạp thành công plasmid pACYCDuet-1-CPT1. Kết quả giải trình tự gen CPT1 trong plasmid pACYCDuet-1-CPT1 (hình 4) và so sánh với trình tự gen CPT1 trong Genbank cho thấy trong quá trình tạo dòng gen CPT1 vào vector pACYCDuet-1 đã không xuất hiện đột biến nào làm thay đổi trình tự gen CPT1. Như vậy, trình tự mã hóa CPT1 từ S. lycopersicum đã được tạo dòng thành công vào vùng MCS1 của pACYCDuet-1. Tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện tái tổ hợp enzym CPT1 có khả năng tổng hợp NPP và tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện tái tổ hợp hai enzym CPT1 và PHS tổng hợp monoterpene trong môi trường nuôi cấy Sau khi được nuôi cấy cảm ứng với IPTG, dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được ly tâm và phần tủa chứa tế bào vi khuẩn được thu nhận. Tế bào vi khuẩn được huyền phù lại trong đệm Fast AP và được phá màng bằng sóng siêu âm. Sau khi ly tâm, dịch nổi được thu nhận và được ủ với alkaline phosphatase ở 37oC trong 1 giờ. Kết quả được mô tả ở hình 5 cho thấy, ở sắc ký đồ b tương ứng với dịch chiết hexan của dịch nổi sau xử lý với enzym alkaline phosphatase xuất hiện một đỉnh “peak” trùng lắp với peak chất chuẩn nerol ở sắc ký đồ a. Điều này chứng tỏ khi thủy phân dịch nổi với alkaline phosphatase, nerol được tạo ra. Nói cách khác, có sự hiện diện của NPP trong dịch nổi được chuẩn bị từ tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện tái tổ hợp protein CPT1. Hình 4. Kết quả giải trình tự plasmid pACYCDuet-1-CPT1 với mồi T7 Terminator. Đoạn trình tự được in đậm là trình tự mã hóa CPT1 được tạo dòng vào vector pACYCDuet-1. Mã khởi đầu ATG, mã kết thúc TGA. Hình 5. Sắc ký đồ mô tả sự hiện diện của nerol khi thủy phân dịch chiết tế bào (cell lysate) E. coli BL21(DE3) biểu hiện tái tổ hợp CPT1 với alkaline phosphatase a. Chất chuẩn nerol; b. Dịch chiết tế bào E. coli BL21(DE3)/pACYC Duet-1-CPT1 được xử lý với alkaline phosphatase. Tế bào E. coli BL21(DE3) mang hai plasmid pACYCDuet-1-CPT1 và pEXP5-NT-TOPO-PHS được nuôi cấy và cảm ứng với 0,4 mM IPTG ở 22oC trong 5-6 giờ. Dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) chỉ biểu hiện PHS được sử dụng làm đối chứng âm. Kết quả cho thấy ở sắc ký đồ mô tả thành phần monoterpene thoát ra từ dịch chiết hexan của dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện tái tổ hợp hai enzym CPT1 và PHS (hình 6B) xuất hiện một đỉnh “peak” trùng lắp với chất chuẩn β-phellandrene (hình 6A). Trong khi đó, ở sắc ký đồ mô tả thành phần monoterpene thoát ra từ dịch chiết hexan của dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) chỉ biểu hiện enzym PHS (hình 6C) không có sự hiện diện của đỉnh “peak” này. Enzym PHS là một monoterpene synthase chủ yếu sử dụng NPP làm cơ chất để tổng hợp β-phellandrene [5]. Sự vắng mặt của β-phellandrene trong dịch chiết hexan của dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) chỉ biểu hiện enzym PHS (hình 6C) đã chứng minh một cách gián tiếp khi không có sự biểu hiện của enzym CPT1 trong tế bào, tế bào E. coli BL21(DE3) không tổng hợp hoặc chỉ tổng hợp một lượng nhỏ không đáng kể cơ chất NPP của enzym PHS. Ngược lại, ở tế bào E. coli BL21(DE3) được biến nạp hai plasmid pACYCDuet-1-CPT1 và pEXP5-NT-TOPO-PHS, enzym CPT1 có khả năng sử dụng cơ chất nội sinh IPP và DMAPP có trong tế bào chủ để tổng hợp NPP và enzym PHS đã sử dụng NPP được tạo ra làm cơ chất để tổng hợp β-phellandrene (hình 6B, 7). Như vậy, kết quả thí nghiệm này cũng đã củng cố những nhận định được dự đoán từ kết quả của thí nghiệm được mô tả ở Hình 5, cho thấy NPP là sản phẩm được tạo ra bởi CPT1 tái tổ hợp. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện cDNA mã hóa enzym cis-prenyltransferase 1 (CPT1) phân lập được từ cà chua S. lycopersicum trong tế bào E. coli và dòng tế bào này có khả năng tổng hợp NPP. Khi tái tổ hợp và biểu hiện đồng thời hai enzym CPT1 và PHS trong tế bào E. coli, cơ chất NPP được tổng hợp bởi CPT1 đã được sử dụng hiệu quả bởi monoterpene synthase PHS cho sự sinh tổng hợp monoterpene de novo (hình 7). Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) trong khuôn khổ đề tài mã số C2014-18-21. Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn PTN Phân tích trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã hỗ trợ phân tích mẫu bằng kỹ thuật sắc ký khí. Hình 6. Sắc ký đồ mô tả kết quả phân tích thành phần monoterpene trong dịch chiết hexan bằng kỹ thuật sắc ký khí A: Chất chuẩn β-phellandrene; B: Dịch chiết hexan của dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) biểu hiện đồng thời CPT1 và PHS; C: Dịch chiết hexan của dịch nuôi cấy tế bào E. coli BL21(DE3) chỉ biểu hiện PHS. Hình 7. Con đường sinh tổng hợp monoterpene từ NPP trong tế bào E. coli BL21(DE3) được biến nạp vector mang trình tự mã hóa CPT1 (pACYCDuet-1-CPT1) và vector mang trình tự mã hóa PHS (pEXP5-NT-TOPO-PHS) G3P: glyceraldehyde-3-phosphate; DXP: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate; MEP, 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; IPP, isopentenyl pyrophosphate; DMAPP, dimethylallyl pyrophosphate; NPP, neryl pyrophosphate; CPT1: cis-prenyltransferase 1; PHS, phellandrene synthase. TÀI LIỆU THAM KHẢO Connolly J. D., Hill R. A, 1991. Dictionary of terpenoids. Chapman and Hall, London. Falara V., Akhtar T., Nguyen T. T. H., Spyropoulou E., Bleeker P., Schauvinhold I., Matsuba Y., Bonini M., Schilmiller A., Last R., Schuurink R., Pichersky E., 2011. The tomato (Solanum lycopersicum) terpene synthase gene family. Plant Physiology, 157(2): 770-789. Lombard J., Moreira D., 2011. Origins and early evolution of the mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis in the three domains of life. Molecular Biology and Evolution. 28 (1): 87-99 Michael T. P., Jackson S., 2013. The First50 Plant Genomes. The Plant Genome, Vol 6, Issue 2. Schilmiller A.L., Schauvinhold I., Larson M., Xu R., Charbonneau A.L., Schmidt A., Wilkerson C., Last R., Pichersky E., 2009. Monoterpenes in the glandular trichomes of tomato are synthesized via a neryl diphosphate intermediate rather than geranyl diphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106:10865-10870. Walker A., Taylor J., Rowe D., Summers D., 2008. A method for generating sticky-end PCR products which facilitates unidirectional cloning and the one-step assembly of complex DNA constructs. Plasmid, 59(3):155-162. HETEROLOGOUS EXPRESSION OF CIS-PRENYLTRANSFERASE 1 FOR PRODUCTION OF NERYL PYROPHOSPHATE IN Escherichia coli La Ngoc Thuy Van1, Le Thi Kim Lan1, Khuat Le Uyen Vy1, Dinh Minh Hiep2, Eran Pichersky3, Nguyen Thi Hong Thuong1 1VNUHCM, University of Science 2Management Board of Agricultural Hi-tech Park, HCMC 3University of Michigan, Ann Arbor, USA SUMMARY Neryl pyrophosphate (NPP), also known as neryl diphosphate (NDP), is the cis isomer of genaryl pyrophosphate (GPP). Previously, it has been shown that monoterpene synthases found in plants use GPP as a substrate for the synthesis of monoterpenes and monoterpenoids. However, in 2009, Schilmiller identified a new monoterpene synthase gene for phellandrene synthase (PHS) that is expressed in glandular trichomes of the cultivated tomato Solanum lycopersicum and uses NPP as a substrate to produce β-phellandrene as a main product. An mRNA for a cis-prenyltransferase (cis-prenyltransferase 1, CPT1) was also identified in these glands. It encodes an enzyme that uses DMAPP and IPP to produce NPP. E. coli has the ability to synthesize GPP but not NPP. In this study, we cloned and expressed CPT1 in E. coli for production of NPP followed by coupling with a monoterpene synthase such as PHS, which specifically uses NPP as a substrate to produce β-phelandrene. Further metabolic engineering of the pathway and in situ product recovery would make this engineered E. coli a potential production platform for many valuable monoterpenes and their derivatives. Keywords: cis-prenyltransferase, neryl pyrophosphate, monoterpene synthase. Ngày nhận bài: 22-10-2014