Tăng hệ số nhân nhanh chồi cây hoa salem tím (limonium sinuatum L. mill) bằng cách sử dụng kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và adenine trong nuôi cấy in Vitro - Nguyễn Thị Huyền Trang

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 219 TĂNG HỆ SỐ NHÂN NHANH CHỒI CÂY HOA SALEM TÍM (Limonium sinuatum L. Mill) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG KẾT HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ADENINE TRONG NUÔI CẤY IN VITRO Nguyễn Thị Huyền Trang*, Lê Thị Thủy Tiên Trường Đại học bách khoa, ĐHQG tp Hồ Chí Minh, nguyenthihuyentrang171@gmail.com TÓM TẮT: Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím (Limonium sinuatum L. Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân chồi. Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6 tuần tuổi. Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4 mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp giữa kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn. Sự hiện diện của GA3/adenine giúp tăng hiệu quả tạo chồi. Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10 mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Từ khóa: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA MỞ ĐẦU Salem có tên khoa học là Limonium sinuatum L. Mill, thuộc họ Bạch hoa đan (Plumbaginaceae). Chi Limonium có khoảng 150 loài hoang dã [3]. Salem xuất xứ từ Địa Trung Hải và đã có mặt ở Đà Lạt từ trước năm 1975. Vùng trồng hoa salem phổ biến tại Đà Lạt là Đa Thiện, Thái Phiên và nhiều nơi khác. Trên thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên cứu đối tượng này như nuôi cấy tế bào để khảo sát khả năng tái sinh [3], loại bỏ vi khuẩn ký sinh gây hoại tử ở lá trong vi nhân giống [9] hay tạo cây lai giữa 2 loại Limonium perezii và Limonium sinuatum [5]. Trong vài năm gần đây, một bộ phận nông dân tại Đà Lạt sử dụng các giống hoa đã bị thoái hóa, trong đó có salem, dẫn đến sản lượng thấp, màu sắc và độ bền kém. Bên cạnh đó, nguồn giống chưa được chủ động, cho nên, khi thị trường cần số lượng lớn thì sản xuất không đáp ứng được [8]. Phương pháp vi nhân giống là phương pháp hiệu quả không những tạo số lượng cây giống lớn, không những ổn định về mặt di truyền, mà còn nâng cao chất lượng cây giống. Xuất phát từ yêu cầu thực tế nhằm sản xuất một lượng lớn cây giống salem có chất lượng cao và ổn định, đề tài được thực hiện với mục đích khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự nhân chồi của cây salem in vitro, là giai đoạn quan trọng trong công tác vi nhân giống. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chồi của cây con in vitro được sử dụng để làm vật liệu thí nghiệm. Hạt giống tạo cây con là hạt giống hoa salem thương mại được cung cấp bởi công ty TNHH Hạt Giống Hoa Việt Nam, mã số: FVN STA011 Golf Dark Blue, Hoa Kỳ. Phương pháp Môi trường nhân chồi là môi trường Murashige và Skoog (1962) (MS) [6] bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose, 6 g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau. Các môi trường này được chỉnh về pH 5,8 trước khi hấp tiệt trùng ở 121ºC, 1 atm trong thời gian 15 phút. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Khử trùng hạt Hạt được khử trùng với dung dịch Javel thương mại 50% trong thời gian 7 phút. Môi Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien 220 trường gieo hạt là môi trường MS bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar. Khảo sát tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy cho sự tạo chồi Chồi của cây con 4; 6 và 8 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường nhân chồi là môi trường MS bổ sung 4 mg/l kinetin, 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Kết quả về độ tuổi sinh lý thích hợp nhất cho sự tạo chồi sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm khảo sát nhân chồi trong báo cáo này. Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi Mẫu cấy là chồi của cây con có tuổi sinh lý thích hợp là kết quả ở thí nghiệm trước được nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA (0; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4 mg/l) hoặc kinetin (0,5; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) nhằm tìm ra loại và nồng độ cytokinin thích hợp cho việc nhân chồi cây salem. Kết quả cytokinin thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi cây salem sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và auxin lên sự tạo chồi Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng trong thí nghiệm này là IBA; 2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2 mg/l kết hợp với loại cytokinin có nồng độ cảm ứng tạo chồi hiệu quả nhất thu được từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cytokinin. So sánh hiệu quả tạo chồi trên các môi trường khảo sát với môi trường chỉ bổ sung cytokinin riêng lẻ. Môi trường có kết quả tạo chồi cao nhất sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của GA3, adenine lên sự tạo chồi GA3 và adenine được bổ sung riêng lẻ vào môi trường MS có sự hiện diện của chất điều hòa sinh trưởng thực vật cảm ứng tạo chồi hiệu quả nhất từ các thí nghiệm trước. Nồng độ của các chất được khảo sát là: GA3 nồng độ 3; 5; 7 và 10 mg/l và Adenine nồng độ 5; 10; 15 và 20 mg/l. Phân tích và xử lý số liệu Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mẫu tạo chồi, số lượng chồi hình thành và hình thái chồi sau 4; 6 và 8 tuần nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 5 bình, mỗi bình chứa 3 mẫu cấy. Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm SPSS theo phương pháp Duncan ở mức ý nghĩa 0,05. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy cho sự tạo chồi Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thường được nhắc đến như thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, mẫu cấy. Trong đó, yếu tố mẫu cấy có thể chia làm hai nhóm: lựa chọn mẫu cấy và xử lý mẫu cấy. Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu. Trong báo cáo này, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nguồn mẫu là hạt, do đó độ tuổi sinh lý của mẫu cấy có thể sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả nhân chồi khi nuôi cấy. Ba độ tuổi sinh lý khác nhau được khảo sát và ghi nhận kết quả sau 4; 6 và 8 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin được trình bày trong bảng 1. Kết quả cho thấy, có sự khác biệt rõ rệt về khả năng tạo chồi giữa những mẫu cấy có độ tuổi khác nhau. Mẫu cấy 6 tuần tuổi có khả năng tạo chồi cao nhất với số lượng chồi trên một mẫu cấy ban đầu là 5,87 chồi sau 8 tuần nuôi cấy (hình 1b). Tỷ lệ tạo chồi của mẫu cấy 6 tuần tuổi cũng cao hơn so với mẫu cấy 4 và 8 tuần tuổi. Bảng 1. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đến hiệu quả nhân chồi Tuổi của mẫu cấy (tuần) Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/mẫu 4 tuần 13,33a* 1,13a 66,67a 2,53a 80,00a 5,27a 6 tuần 80,00b 2,67b 93,33b 4,20b 100,00b 5,87a 8 tuần 6,67a 1,07a 13,33c 1,33c 40,00c 2,13b Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 221 Quan sát hình thái mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin, chúng tôi nhận thấy mẫu cấy ban đầu không có sự gia tăng kích thước, các lá mới hình thành có kích thước đều nhau, chiều dài dưới 1 cm. Chồi mới xuất hiện ở nách lá và gốc của chồi ban đầu (hình 1a). Điều này chứng minh sự hiện diện của kinetin trong môi trường nuôi cấy có tác động ức chế hiện tượng ưu tính ngọn để kích thích sự hình thành và tăng trưởng của các chồi mới, tạo cụm chồi. Ở các mẫu cấy 8 tuần tuổi sau 8 tuần nuôi cấy, chồi ban đầu tiếp tục gia tăng chiều cao và tạo lá mới (hình 1c). Như vậy, ở nhóm mẫu cấy này hiện tượng ưu tính ngọn của chồi ban đầu không bị ức chế hoàn toàn, chồi mới hình thành chủ yếu ở nách lá. Đây có lẽ là nguyên nhân làm cho số lượng chồi mới hình thành thấp hơn so với mẫu cấy 4 và 6 tuần tuổi. Như vậy, mẫu cấy chồi từ cây con 6 tuần tuổi có tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi cao, số lượng chồi mới hình thành cũng cao hơn mẫu cấy 4 tuần và 8 tuần tuổi (hình 1a, b, c) nên được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nhằm tìm ra môi trường hiệu quả cho việc nhân giống cây hoa salem. Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi Bảng 2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi Cytokinin Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần BA (mg/l) Kinetin (mg/l) Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/mẫu - - 0,00a* 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,2 - 20,00b 1,20a 20,00b 1,27a 20,00c 1,27a 0,5 - 6,67a 1,07a 20,00b 1,20a 20,00c 1,20a 1 - 0,00a 1,00a 6,67a 1,07a 6,67ab 1,07a 2 - 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 3 - 6,67a 1,07a 6,67a 1,07a 6,67ab 1,07a 4 - 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a - 0,2 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a - 0,5 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a - 1 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 13,33bc 1,13a - 2 46,67de 2,13b 66,67c 3,00b 93,33d 3,93b - 3 53,33e 2,13b 73,33c 3,07b 93,33d 4,80bc - 4 86,67f 2,27b 86,67d 3,73b 100,00d 5,60c - 5 33,33c 2,07b 93,33d 3,60b 100,00d 5,73c Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan. Sau 8 tuần khảo sát trên môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA cảm ứng tạo chồi không hiệu quả. Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi trên một mẫu cấy cao nhất ở các môi trường có bổ sung 0,2 mg/l BA nhưng với tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi trung bình đều thấp (20,00% và 1,27 chồi/mẫu cấy), không có sự khác biệt về mặt thống kê so với mẫu đối chứng (hình 1i). Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy, kinetin có hiệu quả cao trong sự tạo chồi cây hoa salem. Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi tăng dần khi nồng độ kinetin tăng, đặc biệt trong khoảng nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Nghiệm thức bổ sung 1 mg/l kinetin cho kết quả tạo chồi thấp và tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi chỉ đạt 13,33%. Các nồng độ còn lại có hiệu quả tạo chồi cao hơn đặc biệt là kinetin nồng độ 5 mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi 100% sau 8 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên nồng độ kinetin 5 mg/l là nồng độ cao, có thể gây ra những biến dị không mong muốn, khi quan sát mẫu cấy cũng phát hiện có những biểu hiện bất thường về hình thái. Ở nghiệm thức sử dụng 4 mg/l kinetin, số lượng chồi tạo thành Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien 222 trên một mẫu cấy ban đầu là 5,60 chồi/mẫu cấy, khác biệt không có ý nghĩa với kinetin nồng độ 5 mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và tỉ lệ tạo chồi cũng đạt 100%. Trong nghiên cứu về nhân giống cây Limonium cavanillesii Erben của Amo-Marco et al. (1998) [1], kinetin là loại cytokinin có kết quả nhân chồi tốt nhất với khoảng nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Trong báo cáo này, tác giả cũng khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi của mẫu cấy và cho kết quả cao nhất trong khoảng nồng độ BA là 0,1 đến 0,5 mg/l nhưng kết quả này thấp hơn trên môi trường bổ sung kinetin nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Ở các nồng độ BA cao hơn mà tác giả khảo sát (1; 2; 5 mg/l) cho tỷ lệ tạo chồi và số chồi trung bình giảm. Tomoko Igawa et al. (2002) [3] cũng sử dụng BA trong nghiên cứu tái sinh cây từ nuôi cấy tế bào cây Limonium sinuatum Mill ở nồng độ 0,1 và 1,0 mg/l nhưng chồi chỉ hình thành mới trên môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 3,3% và số chồi mới hình thành trung bình là 0,3 chồi. Trong kết quả của Jeong et al. (2001) [4] khi khảo sát ảnh hưởng của một số cytokinin riêng lẻ và kết hợp với auxin lên sự tạo chồi của cây Limonium sinuatum cũng cho thấy BA riêng lẻ cảm ứng tốt hơn ở nồng độ thấp 1,11 µM (tương ứng 0,25 mg/l) và giảm dần khi tăng nồng độ BA lên. Ở nồng độ 8,88 µM BA (tương ứng 2 mg/l) thì không có chồi mới được hình thành. Báo cáo này cũng cho thấy BA không hiệu quả trong cảm ứng sự nhân chồi trên đối tượng này. Như vậy các báo cáo trên đều cho thấy với đối tượng là Limonium sinuatum thì BA riêng lẻ chỉ có thể cảm ứng tạo chồi ở nồng độ thấp nhưng không hiệu quả vì tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi hình thành đều ít và thấp hơn các chất cảm ứng khác cùng khảo sát. Điều này phù hợp với số liệu mà chúng tôi đã thu nhận được là BA không thích hợp để cảm ứng với đối tượng này, kinetin cảm ứng tạo chồi hiệu quả ở nồng độ 4 và 5 mg/l. Do đó chúng tôi chọn kinetin nồng độ 4 mg/l để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và auxin lên sự tạo chồi Bảng 3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa auxin và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi Kinetin (mg/l) Auxin (mg/l) Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần IBA 2,4-D NAA Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu 4 - - - 86,67a* 2,27ab 86,67bc 3,73c 100,00a 5,60d 4 0,05 - - 66,67b 2,67a 100,00a 4,07c 100,00a 5,27d 4 0,1 - - 66,67b 1,93ab 86,67bc 3,33c 100,00a 5,07d 4 0,2 - - 60,00bc 2,20ab 86,67bc 3,73c 93,33ab 4,93d 4 - 0,05 - 53,33cd 1,80ab 80,00cd 3,47c 93,33ab 5,20d 4 - 0,1 - 40,00ef 1,53b 73,33d 2,80c 86,67b 4,67d 4 - 0,2 - 33,33f 1,47b 80,00cd 2,80c 86,67b 4,53d 4 - - 0,05 46,67de 1,67b 86,67bc 3,87c 86,67b 4,20d 4 - - 0,1 53,33cd 1,87ab 93,33ab 3,40c 100,00a 4,73d 4 - - 0,2 60,00bc 2,20ab 80,00cd 3,40c 100,00a 4,47d Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 223 Auxin khi kết hợp với cytokinin sẽ giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Gaspar et al. (2003) [2] cho rằng các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ từ thấp đến trung bình. Do đó, các auxin trong thí nghiệm này được sử dụng ở nồng độ thấp nhằm khảo sát tác động của sự phối hợp giữa auxin và kinetin trên sự tạo chồi cây hoa salem. Sau 8 tuần khảo sát trên các môi trường bổ sung auxin với loại và nồng độ khác nhau, hiệu quả tạo chồi cao nhất lần lượt ở các nghiệm thức có 0,05 mg/l IBA (5,27 chồi/mẫu cấy), 0,05 mg/l 2,4-D (5,20 chồi/mẫu cấy) và 0,1 mg/l NAA (4,73 chồi/mẫu cấy) (bảng 3). Tuy nhiên, số lượng chồi tạo thành trung bình trên một mẫu cấy ban đầu ở các môi trường này đều thấp hơn môi trường chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ và các sự khác biệt này là không có ý nghĩa. Như vậy, khi kết hợp với 4 mg/l kinetin thì sự hiện diện của auxin không giúp nâng cao hiệu quả tạo chồi của cây hoa salem. IBA là loại auxin có độ bền không cao, sau 30 ngày ngoài sáng nồng độ IBA có thể giảm đi 60% [7]. Trong khi đó, khi quan sát nhận thấy mẫu cấy chồi cây salem có biểu hiện đáp ứng tạo chồi dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật sau 3 tuần nuôi cấy. Như vậy, mẫu cấy cần thời gian cảm ứng dài và trong khoảng thời gian này IBA có thể đã bị giảm hoạt tính nên tác động của IBA đến mẫu cấy không rõ rệt. Trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D, có sự hình thành các mô sẹo nhỏ ở cuống lá, nơi tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (hình 1e). Mô sẹo khi mới xuất hiện có màu trắng, sau đó bị nâu hóa. 2,4-D là một loại auxin mạnh, có vai trò quan trọng trong sự kích thích sự phân chia của tế bào tạo mô sẹo. Tuy vậy, số lượng mô sẹo hình thành trong thí nghiệm này ít do 2,4-D chỉ được sử dụng với nồng độ thấp. Về hình thái mẫu cấy, các chồi mới tạo thành ở tất cả các môi trường bổ sung auxin đều có kích thước lớn hơn các chồi được tạo thành trên môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Trong đó, chiều cao của chồi mới hình thành trên môi trường bổ sung NAA lớn hơn chồi trên môi trường có bổ sung IBA hay 2,4-D (Hình 1d, e, f). Ở nhiều loài thực vật, việc kết hợp auxin ở nồng độ thấp với cytokinin giúp nâng cao hiệu quả tạo chồi. Nhưng trong nghiên cứu này, với cả 3 loại auxin đã được tiến hành khảo sát là 2,4-D, NAA và IBA thì kết quả đều không có sự khác biệt hoặc thấp hơn so với khi sử dụng kinetin riêng lẻ. Tuy nhiên, việc sử dụng auxin kết hợp với kinetin giúp các chồi mới hình thành có kích thước lớn, dễ tách ra thành từng chồi riêng biệt để chuyển sang môi trường tạo rễ. Ảnh hưởng của GA3 lên sự tạo chồi Bảng 4. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa GA3 và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi Kinetin (mg/l) GA3 (mg/l) Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu 4 - 86,67a* 2,27a 86,67a 3,73c 100,00a 5,60d 4 3 26,67b 1,40b 100,00b 4,13c 100,00a 5,87d 4 5 33,33bc 1,53b 100,00b 4,27c 100,00a 6,27de 4 7 53,33d 1,73ab 93,33ab 4,00c 100,00a 6,53de 4 10 40,00cd 1,60ab 100,00b 4,73c 100,00a 7,80e Các chữ cái a,b,c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 05 theo phương pháp Duncan. Có nhiều kết quả khác nhau về tác động của GA3 trên các đối tượng mẫu cấy khác nhau. Mẫu cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát triển không cần đến sự hiện diện của gibberellin trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi bên cũng có thể gia tăng khi bổ sung thêm gibberellin. Ở một số loài thực vật, acid Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien 224 gibberellic riêng lẻ cũng có thể cảm ứng sự tạo chồi bất định như ở mô sẹo Ranunculus scleratus hay thay thế cho vai trò của auxin trong quá trình cảm ứng tạo chồi [7]. Trong thí nghiệm này, GA3 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy cùng với 4 mg/l kinetin nhằm khảo sát tác động hỗ trợ của gibberellin với kinetin trong sự cảm ứng tạo chồi ở cây hoa salem. Kết quả ghi nhận cho thấy môi trường cảm ứng tạo chồi với sự hiện diện của 4 mg/l kinetin và GA3 ở các nồng độ 3; 5; 7 và 10 mg/l đều cho hiệu quả tạo chồi cao hơn trên môi trường chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ (Bảng 4). Kết quả cao nhất trong thí nghiệm này là môi trường bổ sung 10 mg/l GA3 (7,80 chồi/mẫu cấy). Các chồi mới được tạo thành (Hình 1g) có kích thước lớn hơn so với chồi trên môi trường chỉ có kinetin (số liệu cụ thể không được đưa ra). Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy sự kết hợp giữa 4 mg/l kinetin và GA3 giúp tăng hệ số nhân chồi của cây hoa salem. Số lượng chồi mới hình thành tăng theo sự gia tăng nồng độ của GA3. Không chỉ thu được số lượng chồi lớn hơn trên mỗi mẫu cấy mà kích thước chồi mới hình thành cũng gia tăng, chồi khỏe, dễ tách thành chồi đơn. Ảnh hưởng của adenine lên sự tạo chồi Trong một số trường hợp, người ta thường phối hợp cytokinin với adenine để cảm ứng sự tạo chồi. Trong các thí nghiệm nuôi cấy Begonia, thuốc lá, cây du, Plumbago indica thì chỉ cần một mình adenine cũng đủ cảm ứng tạo chồi (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [7]. Bảng 5. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa adenine và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi Kinetin (mg/l) Adenine (mg/l) Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số lượng chồi/ mẫu 4 - 86,67a* 2,27a 86,67a 3,73bc 100,00a 5,60d 4 5 20,00b 1,60a 100,00b 4,93bc 100,00a 7,73de 4 10 66,67d 2,20a 100,00b 5,20b 100,00a 9,73e 4 15 46,67e 1,93a 100,00b 4,67bc 100,00a 7,60de 4 20 33,33b 1,60a 100,00b 3,53c 100,00a 5,53d Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan. Kết quả thí nghiệm cho thấy sự kết hợp giữa 4 mg/l kinetin với adenine giúp làm tăng hiệu quả tạo chồi so với chỉ sử dụng kinetin riêng lẻ (Bảng 5). Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt 100% ở tuần nuôi cấy thứ 6 với tất cả các nồng độ adenine khảo sát. Số lượng chồi được tạo mới cao hơn so với đối chứng khi kết hợp 4 mg/l kinetin với adenine nồng độ 5; 10 và 15 mg/l. Trong đó, nồng độ adenine thích hợp nhất là 10 mg/l với số lượng chồi trung bình hình thành từ một mẫu cấy ban đầu là 9,73 chồi. Nồng độ adenine cao hơn 10 mg/l làm giảm khả năng tạo chồi của mẫu cấy. Chồi mới hình thành có hình thái bình thường và kích thước lớn hơn so với đối chứng ở tất cả các nồng độ (hình 1h). Việc sử dụng kết hợp adenine với kinetin cho kết quả tạo chồi tăng cao có thể được giải thích qua vai trò là tiền chất trong con đường sinh tổng hợp cytokinin của adenine. Như vậy, việc bổ sung adenine vào môi trường kết hợp với kinetin làm tăng hiệu quả tạo chồi. KẾT LUẬN Như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được mẫu cấy thích hợp cho mục đích nhân chồi là chồi từ cây con in vitro 6 tuần tuổi. Ở các nồng độ kinetin khảo sát, kinetin nồng độ 4 mg/l thích hợp nhất cho sự tạo chồi. Sự hiện diện của các loại auxin IBA, 2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2 mg/l đều không làm tăng hiệu quả tạo chồi nhưng giúp gia tăng kích thước chồi mới tạo thành so với TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 225 môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Adenine và gibberellin đều có tác động kích thích sự tạo chồi khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy kết hợp với 4 mg/l kinetin. Không chỉ giúp nâng cao số lượng chồi mới, cả 2 chất này đều thúc đẩy sự tăng trưởng của chồi mới. Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới đã hỗ trợ trang thiết bị để hoàn thành đề tài này. Hình 1. Sự tạo chồi từ mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy (thang đo 1cm) a. Mẫu cấy 4 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; b. Mẫu cấy 6 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; c. Mẫu cấy 8 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; d. 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l IBA; e. 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l 2,4-D; f. 4 mg/l kinetin + 0,1 mg/l NAA; g. 4 mg/l kinetin + 10 mg/l gibberellin; h. 4 mg/l kinetin + 10 mg/l adenine; i. 0,2 mg/l BA. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amo-Marco J. B. and Ibanez M. R., 1998. Micropropagation of Limonium cavanillesii Erben, a threatened statice,from inflorescence stems. Plant Growth Regul., 24: 49-54. 2. Gaspar T., Kevers C., Faivre-Rampant O., Crèvecoeur M., Penel C., Gerppin H. and Dommes J., 2003. Changing concept in plant hormone action. In Vitro Cell Dev. Pl., 39(2):85-106. 3. Igawa T., Hoshina Y. and Mii M., 2002. Effcient plant regeneration from cell cultures of ornamental Statice, Limonium sinuatum Mill. In Vitro Cell Dev. Pl., 38: 157-162. 4. Jeong J. H., Murthy H. N. and Paek K. Y., 2001. High frequency adventitious shoot induction and plant regeneration from leaves of statice. Plant Cell Tiss Org., 65: 123-128. 5. Morgan E. R., Burge G. K., Seelye J. F., Hopping M. E. and Grant J. E., 1998. Production of interspecific hybrids between Limonium perezii (Stapf) Hubb. and Limonium sinuatum (L.) Mill. Euphytica., 102: 109-115. Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien 226 6. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and Bio-assays with tobacco tissue cultures. Phys Plant, 15: 473-497. 7. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006. Công nghệ tế bào. Nxb. Đại học quốc gia tp Hồ Chí Minh. 8. Phạm S., 2007. Những giải pháp mở rộng thị trường tiêu thụ sản phẩm hoa cắt cành ở Đà Lạt - Lâm Đồng: 333-339. Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa. Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Tsu-Hwie A. L., Nai-Wen H. and Rey-Yuh W., 2005. Control of leaf-tip necrosis of micropropagated ornamental Satice by elimination of endophytic bacteria. In Vitro Cell Dev. Pl., 41: 546-549. HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION OF DARK BLUE STATICE (Limonium sinuatum L. Mill) BY COMBINING PHYTOHORMONES WITH ADENINE IN IN VITRO CULTURE Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien Ho Chi Minh city University of Technology SUMMARY In the purpose of optimizing the micropropagation of dark blue Statice (Limonium sinuatum L. Mill), the appropriate age of explants, the effects of phytohormones, GA3 and adenine on Statice shooting were studied. MS medium (Murashige and Skoog, 1962) with 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l saccharose, 6 g/l agar was used in all experiments. The cultures were in 16h photoperiod, light intensity of 2800 lux and at a temperature of 25 ± 2ºC. The best suitable explants were shoots from six-week seedlings in vitro. In the influence of cytokinin, 4 mg/l kinetin was the best result for statice shooting (5.6 shoots per explant) after 8 weeks of culture. The number of shoots per explant on MS medium supplemented with 4 mg/l kinetin and auxin (IBA, NAA or 2,4-D) was lower than MS medium with 4 mg/l kinetin but the size of shoots was raised. The presence of GA3/adenine increased shoot sprouting. The combination of 4 mg/l kinetin with 10 mg/l GA3 or 10 mg/l adenine raised the number of shoots per explant (7.8 and 9.73 shoots per explant, respectively) after 8 weeks of culture. Keywords: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA Ngày nhận bài: 21-6-2012