Tài liệu Thực tập vi sinh (dành cho Y2)

m và mở ống nghiệm - Cầm ống nghiệm có vi khuẩn ở tay trái; giữ ống nằm ngang hoặc nghiêng 450. Tay phải cầm vòng cấy như cầm bút. Hơ đầu vòng cấy nóng đỏ trên ngọn đèn cồn. - Mở nút gòn/nắp ống nghiệm bằng cách cặp vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải. - Sát trùng miệng ống nghiệm đã mở nút bằng cách xoay trên ngọn lửa. Đưa vòng cấy vào, lấy ra một lượng nhỏ vi khuẩn để cấy hoặc làm phết nhuộm. - Hơ nóng lại đầu ống nghiệm rồi đậy lại và đặt lên giá ống nghiệm. - Sau khi làm phết, đốt đầu vòng cấy để diệt hết vi khuẩn còn sót lại. Đặt thẳng đứng vòng cấy đã vô trùng vào giá. 6 Hình 2: Cách lấy vi khuẩn từ canh thang VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN 1. Kim cấy và vòng cấy: - Kim cấy và vòng cấy làm bằng sợi dây kim loại chrome/platin. - Phải đốt vòng/kim cấy trước và sau khi lấy vi khuẩn. Phải để vòng/kim cấy đứng thẳng trong ngọn lửa đèn cồn, từ phần nguội kéo dần ra phần nóng của ngọn lửa. 2. Các ống môi trường: - Phải hơ nóng miệng ống sau khi mở và trước khi đậy nút ống nghiệm. Nút phải được kẹp ở ngón tay út, tránh chạm vào vật khác. Khi mở nút ống nghiệm, nghiêng đi một góc khoảng 45 0 để tránh các vi khuẩn từ môi trường bên ngoài rơi thẳng vào ống nghiệm. - Việc lấy vi khuẩn từ ống môi trường luôn thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. 3. Đĩa Petri: Môi trường thạch cấy đựng trong đĩa Petri. Khi cấy chỉ hé nắp, không được mở toang hết nắp đĩa Petri. 7 I. Mục tiêu: BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ 1) Nhuộm Gram: Thực hiện được kỹ thuật. Lý giải được kết quả. 2) Chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn: Quán triệt tầm quan trọng của việc rửa tay. 3) Kháng sinh đồ: Thực hiện kỹ thuật định tính và đo được sự nhạy cảm kháng sinh. II. CHUẨN BỊ TIÊU BẢN VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM 1. Chuẩn bị lam kính: Miếng lam kính dùng để phết vi khuẩn phải sạch và khô. Hơ qua ngọn đèn cồn và để nguội. Tránh chạm các ngón tay vào mặt kính. 2. Cách gắn vi khuẩn vào miếng lam: - Vẽ trên lam kính một vòng tròn đường kính 2 cm. - Lấy một vòng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng rồi trải mỏng trong diện tích của vòng đã vẽ. Nếu lấy vi khuẩn từ môi trường đặc thì phải nhỏ 1 giọt nước lên lam trước khi cho vi khuẩn vào và trải đều. - Để khô ở ngoài không khí. - Cố định phết vi khuẩn bằng cách hơ qua ngọn lửa. III. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Đây là phương pháp nhuộm cơ bản trong vi khuẩn học. Nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm kép vì cách nhuộm này dùng 2 loại phẩm nhuộm tương phản màu sắc, đó là tím Gentian và đỏ Safranin. Giúp phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm. 1. Nguyên tắc: Dùng cồn ethanol tẩy màu hợp chất “Tím Gentian – Iode”. Vi khuẩn Gram dương không bị mất màu tím. Vi khuẩn Gram âm bị cồn tẩy màu nên bắt màu nhuộm thứ nhì là đỏ Safranin. 2. Vật liệu: 2.1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli. 2.2. Lam kính 2.3. Bộ thuốc nhuộm Gram gồm: * Tím gentian * Lugol * Ethanol 950 * Đỏ Safranin 3. Kỹ thuật: Làm phết vi khuẩn theo hướng dẫn trên. - Phủ phẩm tím Gentian lên phết vi khuẩn 30 giây. - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa. - Phủ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn 30 giây. - Rửa nước. - Tẩy ethanol 10 giây. - Rửa nước. - Phủ Safranin lên phết vi khuẩn 30 giây. - Rửa nước. Thấm khô lam tiêu bản. - Nhỏ một giọt dầu soi lên phết nhuộm. Quan sát qua kinh hiển vi với vật kính dầu. Ghi nhận kết quả quan sát vi thể. Sau khi xem, cho lam tiêu bản vào thố đựng nước sát trùng. IV. CHỨNG MINH SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN 1. Vật liệu: Đĩa thạch dinh dưỡng (Nutrient agar, NA); bút lông. 2. Kỹ thuật: Ghi tên nhóm, tổ, ngày tháng ở mặt ngoài đáy đĩa thạch. 2.1. Mở nắp 1 đĩa NA. Đặt ở trên bậu cửa sổ / mặt bàn / bồn rửa, trong vòng 15 phút. 8 2.2. Ở 1 đĩa NA khác, vạch 1 đường bên ngoài mặt đáy đĩa để chia đôi thành 2 phần A và B. Ấn nhẹ 1 ngón tay lên mặt thạch: phần A là dấu ngón trước khi rửa tay; phần B là dấu của cùng ngón ấy sau khi rửa tay. 2.3. Đậy nắp đĩa NA. Đặt ngược đĩa thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ 370C. 24 giờ sau đọc kết quả. 3. Đọc kết quả: Quan sát vi khuẩn mọc trên NA bằng mắt trần. Đếm số khúm vi khuẩn mọc. Ghi kết quả đĩa NA đặt trong không khí và đĩa NA cấy dấu ngón tay. Các loài vi khuẩn thường tạo nên loại khuẩn lạc khác nhau về: - Hình dạng: bờ viền, bề mặt. - Kích thước: đường kính (mm). - Màu sắc; độ trong/đục. Sự khác nhau có thể tượng trưng cho những loài vi khuẩn khác nhau. Kết luận: có bao nhiêu loài vi khuẩn hiện diện trên đĩa thạch? V. KHÁNG SINH ĐỒ Kháng sinh đồ là phương pháp tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh. Có 2 phương pháp chính: - Định tính: phương pháp đĩa giấy tẩm kháng sinh khuếch tán trên thạch theo Kirby-Bauer. - Định lượng: tìm nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn (MIC, minimum inhibitory concentration). Kháng sinh đồ theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch 1. Nguyên tắc: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Vòng vô khuẩn (không có vi khuẩn mọc) thể hiện vi khuẩn bị ức chế bởi thuốc kháng sinh. Kích thước đường kính vòng vô khuẩn khác nhau tùy thuộc loại vi khuẩn và loại kháng sinh, phản ánh 3 mức độ: nhạy cảm, trung gian, đề kháng. Trường hợp không có vòng ức chế, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh. 2. Vật liệu: 2.1. Đĩa kháng sinh: Là những đĩa giấy đường kính 6mm được tẩm một hàm lượng dung dịch kháng sinh theo tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh được cất giữ trong các ống có chứa chất chống ẩm, ở nhiệt độ từ 2 – 80C. Khi chuẩn bị dùng thì lấy ra để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Có rất nhiều loại kháng sinh. Các tiêu chí lựa chọn kháng sinh thử nghiệm được hướng dẫn chi tiết. Các tiêu chí chính là: - Chọn kháng sinh đại diện cho nhóm có cùng hoạt phổ. - Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm. - Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn. - Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng kháng sinh từng vùng miền. 2.2. Môi trường: Thường dùng môi trường Muller Hinton Agar (MHA). Chỉnh pH của môi trường từ 7,2 đến 7,4. Môi trường được chế vào đĩa Petri với bề dày của thạch là 4 mm. 2.3. Dung dịch chuẩn độ đục: Kích thước mầm cấy phải đạt được là từ 1x108 CFU/mL đến 2x108 CFU/mL (Colony Forming Unit). Ta có thể dùng quang phổ kế hoặc so sánh độ đục của ống vi khuẩn với độ đục 0,5 của ống McFarland để chuẩn hóa kích thước mầm cấy. Dung dịch chuẩn độ đục McFarland là dung dịch muối BaSO4. 2.4. Chuẩn bị mầm cấy: Vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococcus aureus hoặc Escherichia coli đã được thuần khiết. Chọn 3 – 4 khúm cấy vào ống có chứa 2 – 5 ml môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) hoặc BHI (Brain Heart Infusion). Chỉnh độ đục của ống vi khuẩn. Dùng ngay trong vòng 15 phút sau khi chuẩn độ đục. 2.5. Vật liệu khác: que gòn vô khuẩn, kẹp nhỏ, thố nước sát trùng. 9 3. Kỹ thuật: 3.1. Dùng que gòn tẩm canh cấy khuẩn, ép que lên thành trong ống nghiệm cho ráo. 3.2. Hé nắp đĩa thạch MHA, trải đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách vừa đánh nhẹ vừa xoay que gòn lên khắp mặt thạch 3 lần. Để đảm bảo trải đều vi khuẩn, xoay đĩa thạch mỗi lần 600, đánh và xoay que gòn khắp mặt thạch từ trái qua, từ trên xuống. Bước cuối là kéo que gòn vòng theo rìa mặt thạch. Bỏ que gòn vào thố nước sát trùng. 3.3. Chờ mặt thạch khô (khoảng 10 phút). 3.4. Hơ kẹp qua lửa, để nguội rồi gắp một đĩa kháng sinh, đặt nhẹ lên mặt thạch. Các đĩa kháng sinh phải cách mép hộp thạch khoảng 1,5 cm và cách nhau khoảng 2 cm. Ấn nhẹ cho đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch. Không chạm kẹp vào thạch. 3.5. Đậy nắp và đem đĩa MHA ủ ở 350C trong 18-24 giờ. 3.6. Thực hành: - Nhóm làm kháng sinh đồ với S aureus: đặt đĩa kháng sinh Penicillin, Cefoxitin, Imipenem, Amikacin, Azithromycin, Cotrim. - Nhóm làm kháng sinh đồ với E coli: đặt Ampicillin, Amoxicillin-clavulanate, Imipenem, Ceftriaxone, Amikacin, Cotrim (= trimethoprim-sulfamethoxazole). 4. Đọc kết quả kháng sinh đồ: 4.1. Xung quanh đĩa kháng sinh không có vòng vô khuẩn. Kết luận: Vi khuẩn đề kháng với loại kháng sinh đó. 4.2. Xung quanh đĩa kháng sinh có một vòng vô khuẩn, là nơi dưới tác động của kháng sinh vi khuẩn không mọc được. Trong trường hợp này, ta đo đường kính vòng vô khuẩn rồi so sánh với đường kính chuẩn theo bảng hướng dẫn. Có 3 mức độ ảnh hưởng của kháng sinh đối với vi khuẩn thử nghiệm:  Nhạy cảm (S, susceptible); Trung gian (I, intermediate); Đề kháng (R, resitant). 4.3. Bảng hướng dẫn theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm của Mỹ (CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute 2017): - Đối với Staphylococcus aureus: Tên kháng sinh S I R Penicillin 10 IU ≥ 29 mm - ≤ 28 mm Cefoxitin 30 mcg ≥ 22 - ≤ 21 Ciprofloxacin 5mcg ≥ 21 16-20 ≤ 15 Azithromycin 15 mcg ≥ 18 14-17 ≤ 13 Amikacin 30 mcg ≥ 17 15-16 ≤ 14 Cotrim 1,25/23,75 mcg ≥ 16 11-15 ≤ 10 - Đối với Escherichia coli: Tên kháng sinh S I R Ampicillin 10 mcg ≥ 17 mm 14-16 ≤ 13 mm Amox-clav 20/10 mcg ≥ 18 14-17 ≤ 13 Imipenem 10 mcg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Ceftriaxone 30 mcg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Amikacin 30 mcg ≥ 17 15-16 ≤ 14 Cotrim 1,25/23,75 mcg ≥ 16 11-15 ≤ 10 10 Mục tiêu học tập: BÀI 2: CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG 1) Phân biệt được tụ cầu khuẩn và liên cầu khuẩn. 2) Định danh được tụ cầu vàng và tụ cầu không sinh coagulase thường gặp. 3) Phân biệt được liên cầu A, liên cầu B, phế cầu. CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP 1.1. STAPHYLOCOCCI (Tụ cầu khuẩn)  Vi thể: Staphylococci hình cầu, đường kính khoảng 1m, nhuộm màu Gram dương, xếp thành đám giống hình chùm nho.  Tăng trưởng: Mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng (NA: Nutrient Agar), canh thang dinh dưỡng (NB: Nutrient Broth).  Môi trường Mannitol Salt Agar (MSA) là môi trường chọn lọc của Staphylococci vì có chứa 7,5% NaCl ức chế các vi khuẩn thường trú khác.  Chủng Staphylococci gồm có ít nhất 30 loài, trong đó có 4 loài thường gặp trên lâm sàng là: S aureus, S epidermidis, S saprophyticus, S haemolyticus. 1.2. STREPTOCOCCI (Liên cầu khuẩn)  Vi thể: Streptococci có hình cầu hay hơi bầu dục, nhuộm màu Gram dương, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau. Ngoài ra vi khuẩn có thể đứng l hay thành đôi một.  Tăng trưởng: Streptococci mọc trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng như thạch máu cừu (BA: blood agar), thạch nâu (CA: chocolate agar), canh tim óc hầm (BHI: Brain Heart Infusion) trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2.  Tiêu huyết β, hoặc α, hoặc . 1.3. Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus, phế cầu khuẩn)  Vi thể: Gram dương, hình mũi giáo, xếp thành đôi một, có khi xếp thành chuỗi ngắn.  Tăng trưởng: Điều kiện nuôi cấy tương tự các Streptococci. Gây tiêu huyết  trên thạch máu cừu. Dễ bị ly giải bởi các chất hoạt động bề mặt như muối mật. Nhạy cảm với optochin (Taxo P). 11 Mahon et al., 2013 THỰC HÀNH 1. THỬ NGHIỆM CATALASE 1.1 Nguyên tắc Enzyme catalase biến hydrogen peroxide thành nước và khí oxy.Thử nghiệm này giúp phân biệt Staphylococci với Streptococci. catalase H2O2 2H2O + O2 1.2 Cách tiến hành  Trên lame: Lấy vài khúm vi khuẩn đặt trên lame, sau đó nhỏ H2O2 3% lên vi khuẩn.  Đọc kết quả: Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn thử nghiệm catalase dương tính, cầu khuẩn này là Staphylococci. Nếu không có sủi bọt  thử nghiệm catalase âm tính, cầu khuẩn này là Streptococci.  Lưu ý: Vì hồng cầu có thể làm thử nghiệm catalase dương giả, do đó khi lấy vi khuẩn trên thạch máu nên tránh tiếp xúc với môi trường. 2. THỬ NGHIỆM COAGULASE 2.1 Nguyên tắc Enzyme coagulase hiện diện dưới hai dạng: dạng liên kết (clumping factor) và dạng tự do (free coagulase), khi tiếp xúc huyết tương gây hiện tượng đông huyết tương. Đây là thử nghiệm quan trọng để phân biệt Staphylococcus aureus với các loài Staphylococci khác. 2.2 Cách tiến hành  Trên lame: tìm coagulase liên kết. 12  Nhỏ một giọt nước cất vô trùng trên lame, lấy vài khúm vi khuẩn trộn với giọt nước để tạo huyền dịch vi khuẩn. Sau đó nhỏ một giọt huyết tương bên cạnh rồi trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn.  Đọc kết quả: trong vòng 10 giây, nếu xuất hiện những hạt lợn cợn  thử nghiệm coagulase dương tính. Lưu ý:  Nếu để lâu trên 10 giây, phản ứng dương tính giả có thể xảy ra.  Làm thử nghiệm với vi khuẩn mọc ở môi trường có nồng độ muối cao như MSA có thể cho phản ứng dương tính giả.  Thử nghiệm coagulase trên lame âm tính đều phải tiến hành tìm coagulase tự do.  Trong ống nghiệm: tìm coagulase tự do.  Lấy hai ống nghiệm có chứa 0,5 mL canh cấy S aureus và S epidermidis. Nhỏ lần lượt 0,5 mL huyết tương người/thỏ (pha loãng 1:5) vào hai ống nghiệm trên, trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Đem ủ cách thủy 35oC/4 giờ.  Đọc kết quả: Sau 1-4 giờ nếu có hiện tượng đông huyết tương  thử nghiệm coagulase dương tính. - Staphylococcus aureus: làm đông đặc huyết tương. - Staphylococcus epidermidis: không làm đông đặc huyết tương. Lưu ý: Nếu sau 4 giờ không thấy huyết tương đông phải ủ tiếp ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18 giờ. 3. THỬ NGHIỆM LÊN MEN MANNITOL 3.1 Nguyên tắc S aureus có khả năng lên men đường mannitol. Trên môi trường MSA (Mannitol Salt Agar), acid sinh ra sẽ làm đổi màu chất chỉ thị phenol red từ đỏ sang vàng. 3.2 Cách tiến hành  Lấy vi khuẩn S aureus từ ống NA, vạch zig-zag lên mặt nghiêng ống thạch MSA thứ nhất. Chú ý không làm rách mặt thạch.  Lấy vi khuẩn S epidermidis từ ống NA, vạch zig-zag lên mặt nghiêng ống thạch MSA thứ nhì. Không làm rách mặt thạch.  Đem ủ 35oC/18 – 24 giờ. 3.3 Đọc kết quả  Ống MSA 1 chuyển sang màu vàng  S aureus lên men đường mannitol.  Ống MSA 2 vẫn giữ màu đỏ  S epidermidis không lên men đường mannitol. 4. THỬ NGHIỆM PHÂN LOẠI TIÊU HUYẾT CỦA STREPTOCOCCI 4.1 Cách tiến hành: Dùng vòng cấy lấy vi khuẩn Streptococci vạch 3 chiều lên hộp thạch máu, đem ủ 35oC/24 giờ trong bình nến. 4.2 Đọc kết quả  Tiêu huyết : hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết sáng, trong, bao quanh khúm vi khuẩn trên thạch máu.  Tiêu huyết : hồng cầu bị ly giải không hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh lên màu xanh.  Tiêu huyết : hồng cầu không bị ly giải nên không có vòng tiêu huyết. 5. THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM VỚI BACITRACIN (TAXO A) 5.1 Nguyên tắc Streptococcus tiêu huyết  nhóm A (Streptococcus pyogenes) nhạy cảm với bacitracin. Thử nghiệm này phân biệt nhóm A với Streptococcus tiêu huyết  thuộc các nhóm khác. 13 5.2 Cách tiến hành Dùng que gòn vô trùng lấy vi khuẩn Streptococcus tiêu huyết  trong canh cấy trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt lên đó đĩa Taxo A là đĩa giấy tẩm 0,04 đơn vị bacitracin. Ủ 35 o C/18-24 giờ trong bình nến. 5.3 Đọc kết quả Xung quanh đĩa giấy tẩm kháng sinh bacitracin có vòng vô khuẩn  thử nghiệm Taxo A dương tính. Kết luận vi khuẩn là Streptococcus pyogenes. 6. THỬ NGHIỆM CAMP (Christie, Atkins và Munch – Peterson) 6.1 Nguyên tắc Streptococci tiêu huyết  nhóm B (Streptococcus agalactiae) tiết ra yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với -lysin của S aureus. 6.2 Cách tiến hành  Cấy một đường thẳng dòng vi khuẩn S aureus có sinh -lysin.  Sau đó vạch một đường cấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  (không phải nhóm A) thẳng góc với đường cấy S aureus nhưng cách 1-2 mm.  Ủ 35oC/18 giờ. Hoặc 35oC/6 giờ trong bình nến. 6.3 Đọc kết quả Nếu thấy vùng tiêu huyết của S aureus ở nơi tiếp cận Streptococci rộng hơn, sáng hơn, có dạng cánh cung/vảy cá  thử nghiệm CAMP dương tính. Đó là do yếu tố CAMP của Streptococcus agalactiae làm gia tăng vùng tiêu huyết của S aureus. 7. THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM OPTOCHIN (TAXO P) 7.1 Nguyên tắc Pneumococcus nhạy cảm với optochin, thử nghiệm này được áp dụng để phân biệt Pneumococcus với các Streptococci tiêu huyết  khác (ví dụ Streptococcus viridans). 7.2 Cách tiến hành Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  trong canh cấy trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa Taxo P là đĩa giấy tẩm 5 g optochin. Ủ 35oC/18 giờ trong bình nến. 7.3 Đọc kết quả Xung quanh đĩa optochin xuất hiện vòng vô khuẩn với đường kính  14 mm  thử nghiệm Taxo P dương tính. Kết luận: Streptococcus pneumoniae. Lưu ý: Nếu đường kính vòng vô khuẩn < 14 mm cần tiến hành làm thử nghiệm tan trong muối mật để xác định Pneumococcus. 14 Mục tiêu học tập: 1) Liệt kê được tính chất dùng phân biệt Họ Vi khuẩn đường ruột với những trực khuẩn Gram âm khác. 2) Nhận định được khúm lên men hoặc không lên men lactose trên thạch phân lập Mac Conkey. 3) Thực hiện được thử nghiệm oxidase, xác định tính di động, khả năng lên men đường, đọc phản ứng IMViC của trực khuẩn Gram âm. VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROBACTERIACEAE) A. ĐẠI CƢƠNG I. TÍNH CHẤT: Đây là những vi khuẩn tìm thấy trong ruột người và động vật, có ở trong đất và cây cối. Một số là ký sinh, số khác là hoại sinh. Vi khuẩn đường ruột có tính chất chung sau: - Trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. - Đa số di động nhờ tiên mao (flagella) xung quanh thân, một số không di động (Shigella, Klebsiella). - Lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không). - Khử nitrate thành nitrite. - Không sản xuất enzyme oxidase. Những vi khuẩn đường ruột thường gây bệnh cho người là: 1. Các nhóm E coli gây tiêu chảy: - EPEC (enteropathogenic E coli): chủ yếu gây bệnh ở tr em. - ETEC (enterotoxigenic E coli): gây bệnh do tiết độc tố ruột loại dễ bị hủy bởi nhiệt (LT) và loại bền với nhiệt (ST). - EIEC (enteroinvasive E coli): gây bệnh do xâm lấn tế bào. - EHEC (enterohemorrhagic E coli): gây bệnh do tiết độc tố verotoxin. - EAEC (enteroadherent E coli): có khả năng bám dính bề mặt niêm mạc ruột. 2. Shigella: Gây bệnh lỵ trực khuẩn, có bốn nhóm: - Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga. - Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga-like toxin). - Nhóm C: S boydii: không tiết độc tố. - Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga. 3. Salmonella: Có trên 2200 týp huyết thanh khác nhau. Việc xác định týp dựa vào công thức kháng nguyên O, H và K. Hiện nay, dựa vào nghiên cứu DNA, người ta chia Salmonella làm 2 loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori. Salmonella enterica có 6 phụ loài (subspecies). Phụ loài I, còn gọi là Salmonella enterica subsp. enterica, có 3 tác nhân gây bệnh quan trọng: - Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi gây sốt thương hàn. - Salmonella enterica subsp. enterica serotype Choleraesuis gây nhiễm khuẩn huyết và áp-xe khu trú ở các cơ quan nội tạng. - Salmonella enterica subsp. enterica serotype Paratyphi gây sốt phó thương hàn. 4. Yersinia: - Y pestis: gây bệnh dịch hạch. - Y enterocolitica: nhiễm khuẩn tiêu hóa, triệu chứng giống Shigella. - Y pseudotuberculosis: nhiễm khuẩn huyết, viêm hạch màng treo ruột. BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM 15 II. CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG CHO TRỰC KHUẨN GRAM ÂM 1. Môi trƣờng vận chuyển: Dùng để chuyên chở bệnh phẩm, chứa rất ít chất dinh dưỡng (chỉ có muối đệm) chỉ đủ để vi khuẩn sống nhưng không phát triển. Loại thường dùng là Cary- Blair. 2. Môi trƣờng phân lập: - Môi trường không ngăn chận: không chứa bất cứ chất ức chế nào. Ví dụ: thạch máu (BA), thạch dinh dưỡng (NA), canh thang BHI. - Môi trường phân biệt có chọn lọc: tùy theo thành phần ức chế có trong môi trường, được phân biệt thành:  Môi trường phân biệt - chọn lọc ít. Ví dụ: thạch MC (MacConkey), thạch EMB (Eosin Methylene Blue).  Môi trường phân biệt - chọn lọc vừa. Ví dụ: thạch SS (Salmonella-Shigella), thạch Deoxycholate-Citrate, Hektoen Enteric.  Môi trường phân biệt - chọn lọc cao. Ví dụ: thạch Brilliant Green Bile Lactose 3. Môi trƣờng phong phú: Dùng để tăng sinh loại vi khuẩn cần tìm. Ví dụ: canh GN (Gram negative), canh Selenite F 4. Môi trƣờng xác định tính chất sinh hóa cơ bản của vi khuẩn: Một số môi trường được sử dụng gồm: KIA (Kligler’s iron agar), TSI (triple sugar iron agar), SIM, MR-VP, citrate, Phản ứng định danh đơn giản trực khuẩn Gram âm: IMViC = Indole, MR, VP, Citrate. Kết quả cấy trực khuẩn Gram âm vào KIA, TSI Kligler s iron agar (KIA) là môi trường có 2 đường: glucose và lactose. Môi trường còn chứa đỏ phenol làm chất chỉ thị pH để xem có sự lên men hay không, và sulfate sắt để tìm H2S làm đen môi trường. Nồng độ glucose bằng 1/10 nồng độ lactose. Nồng độ acid rất thấp được sinh ra bởi glucose, do đó, ở phần thạch nghiêng (slant) sẽ bị oxid hóa mau chóng, và nếu lactose không được lên men thì thạch nghiêng sẽ trở lại tính kiềm (đỏ). Trái lại, dưới trương lực oxygen thấp của phần thạch đứng (butt), tác dụng acid được duy trì và không trở lại tính kiềm. Do đó, một ống có phần thạch đứng acid (vàng) và phần thạch nghiêng kiềm (đỏ) là dấu hiệu chỉ có sự lên men glucose mà thôi. Nếu lactose được sử dụng thì cả hai phần thạch đứng và nghiêng đều vàng cả. Sự sản xuất gas từ glucose được ghi nhận bởi bọt khí, hay đôi khi bởi sự bể nát cột thạch. Pseudomonas và những loài không lên men đường mọc được trên mặt thạch nhưng không làm biến màu ống môi trường. Môi trường TSI (Triple Sugar Iron) chỉ khác KIA ở chỗ có thêm đường saccharose (sucrose). Sucrose có nồng độ như lactose, nghĩa là gấp 10 glucose; sự sử dụng sucrose cũng giống lactose, được ghi nhận bởi sự acid hóa ở phần thạch đứng và thạch nghiêng. Môi trường này giúp ta tìm ra những vi khuẩn lên men lactose chậm (nhiều ngày), vì người ta thấy rằng đa số vi khuẩn đường ruột lên men lactose chậm đều lên men sucrose sau một ngày. Thử nghiệm tìm H2S, indole, di động Môi trường sử dụng là ống SIM, là 1 loại thạch mềm (bán lỏng, semisolid). - Sinh hydrogen sulfite (H2S): vi khuẩn nào khử được sulfite thì sử dụng hợp chất chứa lưu huỳnh (thiosulfate) tạo ra H2S. Chất này phản ứng với ion sắt trong môi trường thành kết tủa FeS màu đen. - Sinh indole: vi khuẩn có enzyme tryptophanase khử tryptophan trong peptone của môi trường tạo ra sản phẩm có gốc indole. Sản phẩm này kết hợp nhân benzene của thuốc thử thành phức chất quinone màu đỏ. - Tính di động: vi khuẩn di động làm đục hết môi trường; loài không di động chỉ mọc theo đường kim cấy. 16 Phản ứng MR (methyl red) Phân biệt mức độ lên men đường glucose của vi khuẩn. - Vi khuẩn lên men glucose mạnh tạo nên sản phẩm cuối cùng là phức hợp acid bền, làm môi trường chuyển sang pH acid < 4,4 khiến cho thuốc thử methyl red có màu đỏ. Kết luận: MR dương tính. - Vi khuẩn lên men glucose yếu thì tính acid không đủ làm đỏ thuốc thử; khi pH > 6 methyl red có màu vàng. Kết luận: MR âm tính. Phản ứng VP (Voges-Proskauer) Giúp phát hiện sản phẩm trung gian acetoin tạo ra trong quá trình lên men glucose. Với thuốc thử cho vào, acetoin bị oxid hóa thành diacetyl rồi kết hợp với thuốc thử thành phức hợp màu đỏ: phản ứng dương tính. Phản ứng VP âm tính nếu chỉ có màu thuốc thử. Thử nghiệm citrate Giúp nhận biết khả năng vi khuẩn sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất. Vi khuẩn sử dung citrate thì cũng sử dụng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Môi trường nuôi có chứa sodium citrate và muối ammonium. Cả 2 khả năng đều làm kiềm hóa môi trường, biến chất chỉ thị màu bromothymol blue từ xanh lục thành xanh dương. Phản ứng citrate dương tính: màu xanh dương. Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu xanh lục vì vi khuẩn không mọc. B. THỰC HÀNH 1. Nhuộm Gram 1 trực khuẩn đường ruột mọc trên đĩa thạch MC. 2. Thực hiện phản ứng oxidase. a. Nguyên tắc: thử nghiệm cytochrome oxidase dùng một số thuốc nhuộm như p- phenylenediamine dihydrochloride để làm chất tiếp nhận electron thay thế oxygen. Ở thế khử, thuốc nhuộm không màu, tuy nhiên, khi có sự hiện diện của cytochrome oxidase và oxygen khí trời thì p-phenylenediamine bị oxid hóa và thành lập indophenol blue. b. Cách làm: dùng vòng cấy lấy 1 khúm vi khuẩn rồi trải lên 1 đĩa giấy oxidase đã tẩm dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%. c. Đọc kết quả: Phản ứng dương: đĩa giấy có màu tím đen trong khoảng 10 - 20 giây. Phản ứng âm: không có sự đổi màu. 3. Lý giải phản ứng ống thạch KIA, ống SIM. 4. Đọc phản ứng dãy sinh hóa cơ bản của E coli, Shigella sonnei, Proteus mirabilis hoặc Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa. 5. Cho biết chất ức chế trong thành phần môi trường phân biệt-chọn lọc thường dùng: MC, EMB, SS. 17 BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM Mục tiêu: 1/ Mô tả kỹ thuật thích đáng để thu thập các loại bệnh phẩm khác nhau. 2/ Ghi nhớ những bệnh phẩm không dùng nuôi cấy kỵ khí. 3/ Biết cách bảo quản và chuyển các loại bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm. 4/ Thực hiện đúng đắn các kỹ thuật đơn giản lấy và gởi bệnh phẩm máu, đàm, mủ, phân, nước tiểu đến xét nghiệm vi sinh. MỞ ĐẦU Phẩm chất của bệnh phẩm quyết định thông tin chẩn đoán. Hậu quả của việc thu thập và chuyển bệnh phẩm không đúng cách:  không phân lập được tác nhân gây bệnh  phân lập vi khuẩn tạp nhiễm hoặc vi khuẩn thường trú cho thuốc không đúng. HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM  Lấy bệnh phẩm lúc bệnh ở giai đoạn cấp tính và trước khi cho kháng sinh là tốt nhất.  Cẩn thận không làm nhiễm bề mặt vật chứa và phiếu xét nghiệm.  Vật chứa phải thích hợp, đã tiệt trùng, có nút/nắp đậy, không được rò rỉ.  Tránh tạp nhiễm vi khuẩn thường trú. Dùng dụng cụ và kỹ thuật vô khuẩn để không đưa vi sinh vật bên ngoài vào cơ quan khi làm những thủ thuật can thiệp. Vùng da lành: lau sạch trước với cồn 70o vùng da rộng, sau đó bôi povidone iodine khoảng 3cm tập trung ở chỗ chích rút bệnh phẩm (máu, ổ áp xe). Chờ khô thuốc sát trùng mới lấy bệnh phẩm. Lau lại với cồn sau khi lấy bệnh phẩm.  Lấy đủ chất thử.  Ghi nhãn lọ bệnh phẩm: họ tên, tuổi bệnh nhân; số nhập viện; ngày giờ lấy chất thử; khoa gửi bệnh phẩm. Ghi phiếu xét nghiệm: như trên + loại chất thử; chẩn đoán; yêu cầu xét nghiệm; tên bác sĩ yêu cầu. CHỌN LỰA CHẤT THỬ Vết phỏng, Loét do nằm lâu, Loét do dãn tĩnh mạch, Ap xe quanh hậu môn, Tổn thương hoại tử, Tổn thương nha chu: tốt nhất là mẫu mô/mẫu sinh thiết, dịch hút, nếu dùng que gòn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ. Không nuôi cấy: chất tiết mở thông đại tràng, sản dịch, chất nôn, đầu ống thông Foley. Không nuôi cấy kỵ khí: phết ngoáy mũi hầu, họng dịch súc rửa phế quản-phế nang (không bảo vệ) chất hút qua nội khí quản hay mở thông khí quản đàm ho khạc phết niệu đạo nước tiểu do tiểu bình thường hoặc đặt ống thông phân hay bệnh phẩm trong trực tràng sản dịch, phết âm hộ, phết cổ tử cung dịch tuyến tiền liệt, tinh dịch. Chọn vị trí thích hợp để lấy bệnh phẩm cấy kỵ khí. Tốt nhất là mẫu mô/mẫu sinh thiết, đặt trong môi trường chuyên chở kỵ khí. Hoặc dùng ống tiêm rút dịch, cho vào ống nghiệm chân không hay môi trường chuyên chở kỵ khí. Nếu dùng que gòn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ rồi cắm ngay vào môi trường chuyên chở kỵ khí. 18 HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM 1. Máu : a. Thời gian và số lần: Sốt thường theo sau nhiễm khuẩn huyết 30 – 90 phút, vì thế thời gian lấy máu tốt nhất là lúc xuất hiện cơn lạnh run; hoặc ngay sau khi bắt đầu tăng thân nhiệt. Riêng đối với những trường hợp sốt liên tục (như viêm nội tâm mạc, viêm nội mạch, nhiễm trùng không kiểm soát được, giai đoạn sớm của sốt thương hàn, nhiễm brucella) thì thời điểm lấy máu không quan trọng. Cấy máu một lần hiếm khi là đủ. Ít nhất nên cấy máu 2 lần để loại trừ hay xác định chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. Cấy máu nhiều hơn 3 lần không cung cấp thêm nhiều thông tin hơn. Nếu đủ điều kiện mỗi lần lấy máu nên cấy hiếu khí và kỵ khí. + Nhiễm khuẩn huyết cấp tính: 2-3 lần ở những vị trí khác nhau. + Viêm nội tâm mạc cấp tính: 3 lần cách nhau 1-2 giờ ở những vị trí khác nhau. + Viêm nội tâm mạc bán cấp: như viêm nội tâm mạc cấp tính. Nếu sau 24 giờ 3 mẫu đầu âm tính thì cấy thêm 3 mẫu khác. + Viêm nội tâm mạc đã dùng kháng sinh trước khi nhập viện 1–2 tuần: 2 mẫu máu mỗi ngày trong 3 ngày. b. Lượng máu: tỉ lệ máu/môi trưòng 1/5 – 1/10.  Tr nhỏ và tr em 1-5 mL  Người lớn 10-30 mL Có thể dùng canh cấy tự chế 50 mL mỗi chai (tryptic soy broth hay brain heart infusion, thêm 0,025% Sodium Polyanethol Sulfonate) hoặc chai cấy máu bán sẵn. Lưu ý: SPS có thể ức chế vài cầu khuẩn như meningococcus, gonococcus, Chai cấy máu bán trên thị trường như Bactec, Bact/Alert ngoài môi trường nuôi cấy bổ dưỡng còn chứa chất hấp phụ kháng sinh đã dùng. c. Cách lấy máu: Sát trùng da chỗ lấy máu đúng cách. Sát trùng nắp cao su chai cấy máu. Chờ khô. Chích lấy máu tĩnh mạch hay động mạch. 2. Hệ thần kinh trung ƣơng: a. Dịch não tủy: Do bác sĩ chuyên khoa chọc hút giữa đốt sống lưng L3- L4 hoặc L4-L5. Đảm bảo thao tác vô trùng. Rút 5 mL dịch não tủy cho vào 3-4 lọ và gởi lọ đục nhất đến xét nghiệm vi sinh ngay. Các lọ kia để thử sinh hóa và tế bào. Nếu được lượng dịch không đủ, bác sĩ điều trị phải cân nhắc theo thứ tự ưu tiên của xét nghiệm. Xử lý mẫu quá ít thường dẫn đến kết quả âm giả và điều này có hại hơn là chọc hút lại cho có đủ thể tích.  1mL để cấy vi khuẩn, virus.  2 mL để cấy vi nấm và vi khuẩn lao. b. Áp xe não, mô sinh thiết: Lấy mẫu khi phẫu thuật. Phải có cấy kỵ khí. 3. Đƣờng tiêu hóa: a. Phân: Lấy khoảng 1mL phân hay cỡ hạt bắp vào lọ khô, sạch hay lọ vô trùng có nắp đậy. Chọn chỗ phân dính cả đàm nhầy lẫn máu, nếu có. Trường hợp không gửi ngay được: < 1 giờ, giữ ở nhiệt độ phòng. < 24 giờ, giữ ở 4oC. Nếu lâu hơn, cho phân vào môi trường chuyên chở để ở nhiệt độ phòng. Không gửi cấy phân nếu bệnh nhân đã nằm viện trên 3 ngày và không có chẩn đoán viêm dạ dày-ruột. Nên nghĩ đến viêm ruột do Clostridium difficile khi bệnh nhân nội trú tiêu lỏng hoặc phân mềm > 5 lần trong 24 giờ. b. Ngoáy trực tràng: Cho đầu que gòn vào qua khỏi cơ thắt hậu môn 1 cm, xoay que gòn để lấy mẫu ở các khe hậu môn. Không dùng ngoáy trực tràng để soi tươi tìm vi khuẩn dịch tả. 19 c. Hút dịch dạ dày. - Nước súc rửa dạ dày để tìm vi khuẩn lao: Làm thủ thuật sáng sớm sau khi thức dậy. Luồn ống thông dạ dày đã bôi trơn qua miệng hay mũi xuống tới dạ dày và rửa với 25– 50 mL nước cất vô trùng để lạnh. - Hút tá tràng tìm Giardia, ấu trùng giun đũa và ấu trùng giun lươn. e. Sinh thiết thực quản (Candida, CMV, HSV), dạ dày (H. pylori), tá tràng, ruột non (Giardia, Cryptosporidium, Microsporidium), trực tràng (E. histolytica, B. coli, HSV). 4. Sinh dục nữ: Chủ yếu để định bệnh lây qua đường tình dục, như N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, , liên cầu nhóm B, nấm Candida. Nếu nghĩ nhiễm khuẩn không do những tác nhân trên thì cần phải cấy kỵ khí. a. Dịch ối: Hút qua thủ thuật chọc ối / mổ lấy thai / ống thông tử cung. b. Nang Bartholin: sát trùng da và hút qua ống tuyến. c. Cổ ngoài: Không dùng chất bôi trơn khi đặt mỏ vịt. Lau sạch chất tiết và chất nhày. Xoay que gòn vô trùng để lấy chất tiết từ cổ trong. Nếu không thấy chất tiết thì đưa que qua ống cổ trong tử cung. d. Nội mạc: Lấy chất hút qua cổ tử cung hay sinh thiết nội mạc bằng đường nội soi. Gửi cấy kỵ khí. e. Âm đạo: Dùng mỏ vịt không bôi trơn hoặc dùng nước cất vô trùng rửa sạch chất tiết, dùng 2 que vô trùng lấy chất tiết ở niêm mạc vòm âm đạo để cấy và soi. f. Niệu đạo: Chỉ lấy bệnh phẩm sau khi bệnh nhân đi tiểu trên 1. 5. Sinh dục nam: a. Mào tinh hoàn: dùng kim và ống tiêm để chọc hút. b. Tuyến tiền liệt: Rửa quy đầu với xà bông và nước. Xoa tuyến qua đường trực tràng. Lấy chất tiết bằng ống nghiệm hoặc que gòn vô trùng. Đồng thời lấy nước tiểu ngay trước và sau khi xoa tuyến. c. Niệu đạo: Lấy bệnh phẩm sau khi bệnh nhân đi tiểu 2 giờ hay hơn. Đưa que lấy bệnh phẫm niệu-sinh dục vào trong niệu đạo 2-4 cm. Xoay và giữ trong 2 giây rồi rút ra. d. Tổn thương sinh dục: sang thương dương vật và âm hộ Rửa sạch bề mặt bằng nước muối sinh lý. Cạo sang thương cho đến khi xuất hiện thanh dịch. Dùng gạc lau dịch và chất cặn. An nền sang thương cho đến khi dịch trong chảy ra. Hút dịch với kim cỡ 25-27. Dùng que vô trùng chà mạnh nền sang thương (tìm Herpesvirus, Haemophilus ducreyi). 6. Mắt: có thể do bác sĩ chuyên khoa lấy mẫu. a. Lưu ý: Lấy mẫu tìm virus và Chlamydia trước khi bôi tê tại chỗ. Tìm Chlamydia, dùng que alginate calcium. Tìm virus, dùng que gòn/đầu Dacron (không dùng que có cán bằng gỗ). Cấy lên môi trường thích hợp và làm phết tại giừơng rồi gửi ngay đến phòng xét nghiệm. b. Kết mạc: Lấy mẫu cả bên lành để phân biệt vi khuẩn gây bệnh với vi khuẩn thường trú. 20 Dùng 2 que đã thấm nước muối sinh lý vô trùng lăn trên 2 kết mạc. Cấy ngay lập tức lên thạch máu / thạch nâu. Làm phết trên lam. c. Cạo kết mạc: Bôi gây tê tại chỗ. Dùng dao bay Kimura vô trùng. Cấy và làm phết. d. Cạo giác mạc: Thực hiện như làm phết kết mạc. Bôi tê tại chỗ. Giữ mí mắt mở. Cạo nhiều chỗ loét. Cấy ngay và làm phết nhuộm. e. Dịch nội nhãn: dùng kim hút. Cấy ngay và làm phết nhuộm. 7. Đƣờng hô hấp: Liên hệ với phòng xét nghiệm trước khi thu thập bệnh phẩm vì cần cách xử lý và môi trường đặc biệt nếu để tìm Corynebacterium diphtheriae, Arcanobacterium haemolyticum, Bordetella pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Legionella, Chlamydia, Mycoplasma. 7a. Đƣờng hô hấp dƣới: 7a1. Đàm khạc: dặn bệnh nhân súc miệng với nước. Hướng dẫn bệnh nhân nghiệm pháp hít thở 3 thì: hít sâu-thở chậm; hít sâu-thở mạnh; hít sâu-ho. Nếu cần, giúp long đàm bằng cách vỗ lưng bệnh nhân. Trường hợp bệnh nhi/người không tự ho được, phải hút đàm. Bệnh phẩm tốt: mỗi quang trường < 10 tế bào vảy,  25 bạch cầu đa nhân trung tính, đọc ở vật kính x10 (tương đương độ phóng đại x100). 7a2. Đàm gây ho: chải sạch niêm mạc miệng, lưỡi, lợi; súc kỹ với nước. Hít khoảng 25 mL nước muối ưu trương (3-10%) qua khí dung kế. 7a3. Hút từ thủ thuật mở thông khí quản / ống nội khí quản. 7a4. Bệnh phẩm từ nội soi phế quản: do bác sĩ chuyên khoa lấy. Rửa, chải phế quản. Súc rửa phế quản-phế nang. Sinh thiết qua phế quản. Súc rửa phế quản-phế nang: + Bơm vào từng lượt 5-20 mL nứơc muối không chứa chất kìm khuẩn. + Hút nước muối vào vật chứa trước khi bơm lượt khác. Giữ các lượt nước muối ở cùng vị trí chung trong một lọ. Chải phế quản: Bác sĩ điều trị luồn ống thông 2 nòng (nòng ngoài đậy bằng nút Carbowax) vào ống nội soi phế quản. Bàn chải được đưa qua khỏi đầu nòng trong để gom chất tiết (0,001- 0,01 mL) từ tiểu phế quản xa. Cho bàn chải vào vật chứa có 1 mL nước muối vô trùng / dung dịch lactate Ringer. Sinh thiết qua phế quản: lấy bệnh phẩm bằng kìm qua kênh sinh thiết của ống nội soi phế quản. Cho bệnh phẩm vào lọ có một ít nước muối sinh lý. 7a5. Chất hút ở phổi: dùng kim và ống tiêm dưới hướng dẫn của kỹ thuật chụp cắt lớp. 7a6. Sinh thiết phổi: lấy lúc mổ khoảng 1-3 cm2 mô, đựng trong lọ vô trùng không có formalin. Tìm nấm ở phổi tốt nhất bằng mô sinh thiết / chất hút. Hoặc thu thập 3 mẫu đàm 3-5 mL vào sáng sớm. 7b. Đƣờng hô hấp trên: - Miệng: lấy hết chất tiết và cặn bã trên bề mặt sang thương bỏ đi; dùng que gòn thứ nhì chà mạnh trên sang thương, tránh chỗ mô lành. - Phết mũi: que gòn thấm nước muối sinh lý lấy chất nhày trong lỗ mũi (đưa vào 2 cm). Tìm người lành mang MRSA và streptococci. - Súc mũi: cấy virus. Ngửa cổ bệnh nhân. Nhỏ nước muối sinh lý vào mỗi lỗ mũi. Hút lấy nước rửa. - Ngoáy mũi-hầu: tìm N. meningitidis và B. pertussis. Đưa que alginate calcium vào trong vùng hầu sau qua đường mũi. Xoay que 5 giây. Cấy ngay lập tức/ cho vào môi trường chuyên chở. - Hút mũi-hầu: tìm Streptococcus nhóm A, N. meningitidis, C. diphtheriae và B. pertussis. - Chất hút xoang: rút bằng ống tiêm chất hút từ xoang hàm, trán, nơi khác. - Dịch chọc màng nhĩ: để chẩn đoán nhiễm khuẩn tai giữa chỉ khi nào điều trị thất bại. + Lau sạch tai ngoài với chất tẩy nhẹ. 21 + Dùng ống tiêm hút chất thử qua trống tai. + Nếu trống vỡ, lấy chất tiết bằng que vô trùng qua mỏ vịt. - Họng: tìm Streptococcus nhóm A, N. gonorrhoeae, A. haemolyticum. Đè lưỡi. Lấy mẫu bằng que gòn ở vùng hầu sau, hạch hạnh nhân và vùng viêm loét. Tránh má, lưỡi, tiểu thiệt và môi. 8. Các dịch vô trùng khác: như dịch ổ bụng, nước báng, mật, khớp, màng ngoài tim, màng bụng, màng phổi và bao khớp. Tìm vi khuẩn: 1-5 mL. Tìm vi khuẩn lao, vi nấm: > 10 mL. 9. Da và mô mềm: - Phỏng: sinh thiết mô sâu và lấy nhiều chỗ. - Vết thương nông: dùng kim lấy chất hút ở chỗ sâu nhất của sang thương tốt hơn que gòn. - Nấm da: rửa sạch vùng nhiễm bằng nước vô trùng. Cạo bề mặt da ở bờ sang thương. Không rút máu. - Loét / nốt nổi cục: + Sát trùng da, bỏ cặn bã.  Nạo đáy chỗ loét hay nốt nổi cục. 10. Vết thƣơng sâu: - Vết cắn / chấn thương: hút mủ vết thương. - Xương: lấy bệnh phẩm khi mổ. - Vết thương sâu / Ap xe: dùng kim hút phần sâu nhất của sang thương, tránh tạp nhiễm bề mặt vết thương. 11. Nƣớc tiểu: + Rửa lỗ tiểu với xà phòng và nước. Lấy nước tiểu giữa dòng lần tiểu đầu tiên sáng sớm. + Rút nước tiểu trên xương mu. + Nội soi bàng quang:  Bệnh nhân uống nhiều nước đến khi bàng quang đầy.  Rửa sạch lỗ tiểu với xà phòng và nước.  Luồn ống nội soi bàng quang.  Lấy 5-10 mL nước tiểu. Ghi nhãn “nước tiểu lấy qua ống thông”.  Dùng nước muối sinh lý kích thích bàng quang. Hút nước rửa và ghi nhãn “nước rửa bàng quang”.  Đưa ống thông đến giữa 2 niệu đạo hay đến 2 bể thận.  Mở khóa ống nội soi. Bỏ đi 5-10 mL đầu tiên. Lấy 4 mẫu kế tiếp ở 2 bên (5-10 mL mỗi mẫu). Ghi nhãn: nước tiểu thận trái / thận phải 1, 2, 3, 4. 12. Những chất thử khác: 12a. Ống thông tĩnh mạch: lấy 5 cm đầu xa của ống thông. 12b. Nha khoa: viêm họng Vincent, viêm quanh chóp, viêm nha chu, viêm lợi. + Lau sạch bờ lợi và bề mặt răng trên lợi. + Lấy chất thử ở sang thương dưới lợi bằng dụng cụ nạo cao răng. CHUYỂN BỆNH PHẨM Tốt nhất là gởi bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm ngay lập tức. Hoặc càng sớm càng tốt. Nếu không gửi ngay được, giữ bệnh phẩm ở 2-8oC. Ngoại trừ:  chai cấy máu, để ở 35-37oC.  bệnh phẩm tìm Neisseria, tìm vi khuẩn kỵ khí: để ở nhiệt độ phòng.  dịch não tủy tìm vi khuẩn: để ở nhiệt độ phòng.  phân: cấy vi khuẩn, cho vào môi trưòng chuyên chở. tìm ký sinh trùng, cho vào chất bảo quản. 22 Môi trƣờng chuyên chở Giữ ở 4oC Giữ ở nhiệt độ phòng Không cần chất bảo quản Mô tử thiết, Rửa phế quản, Thông tĩnh mạch, Dịch não tủy tìm virus, Sinh thiết phổi, Dịch màng tim, Đàm, Nước tiểu thông / giữa dòng Dịch não tủy tìm vi khuẩn, Dịch khớp Cấy trực tiếp lên môi trường Cạo giác mạc, Cấy máu, Bordetella spp., Bệnh phẩm tìm lậu cầu, Dịch kính Môi trường chuyên chở Stuart’s, Amies, Cary-Blair Sinh thiết vết phỏng, Bệnh phẩm tai ngoài, Bệnh phẩm tìm Campylobacter spp., Shigella spp., Vibrio spp., Yersinia spp. Tủy xương, Que cổ tử cung, Que kết mạc, Que tai trong, Bệnh phẩm cơ quan sinh dục, Que mũi-hầu, Bệnh phẩm hô hấp trên, Bệnh phẩm tìm Bordetella spp., Corynebacterium spp., Neisseria spp., Salmonella spp. Chuyên chở kỵ khí Dịch bụng, Dịch ối, túi cùng, Mật, Tổn thương sâu, Mô phẫu thuật, Chất hút ở phổi, xoang, nội khí quản, Nước tiểu rút trên xương mu, Bệnh phẩm tìm Actinomyces spp. 23 Mục tiêu: BÀI 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG 1/ Phân biệt được các hóa chất dùng thanh khử trùng theo công dụng. 2/ Biết sử dụng hóa chất và cơ chế tác động của chúng để thanh trùng phù hợp. 3/ Biết cách sử dụng lò hấp ướt, tủ an toàn sinh học và tia cực tím. I. ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ Sự thanh trùng / phƣơng pháp khử trùng / kỹ thuật vô khuẩn: chỉ chung việc áp dụng các biện pháp tiệt trùng và tẩy uế để chống lại tình trạng nhiễm trùng hay nguy cơ lây nhiễm. Sự tiệt trùng (sterilization): tiến trình tiêu diệt hay loại bỏ mọi dạng sống của vi sinh vật trong một chất liệu hay trên một đồ vật. Sự tẩy uế (disinfection): tiến trình làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh đến mức chúng không còn nguy hại. Chất sát trùng (antiseptic): tác nhân hóa học dùng ngoài da để diệt vi sinh vật hay ức chế sự tăng trưởng của chúng mà không gây hại mô sống. Chất tẩy uế (disinfectant): tác nhân hóa học dùng diệt trùng trên đồ vật. Hầu hết chất tẩy uế không diệt được nha bào. Chất làm sạch (sanitizer): tác nhân hóa học đặc biệt dùng rửa sạch dụng cụ nhà bếp để làm giảm số lượng vi khuẩn sao cho đáp ứng các tiêu chuẩn y tế công cộng. Quá trình làm sạch có thể đơn giản đề cập đến việc rửa thật kỹ chỉ với xà phòng hay chất tẩy. Chất kìm khuẩn (bacteriostatic agent): tác nhân ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn. Chất diệt mầm bệnh (germicide): tác nhân giết vi sinh vật nhanh chóng; có chất giết được một số vi sinh vật này nhưng chỉ ức chế tăng trưởng số vi sinh vật khác. Chất diệt khuẩn (bactericide): tác nhân giết các vi khuẩn. Hầu hết không giết được nha bào. Chất diệt virus (viricide): tác nhân bất hoạt virus. Chất diệt vi nấm (fungicide): tác nhân giết vi nấm. Chất diệt nha bào (sporocide): tác nhân giết được nha bào của vi khuẩn và bào tử vi nấm. II. TÁC ĐỘNG BẤT LỢI CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG LÊN VI SINH VẬT Các yếu tố môi trường tác động sự tăng trưởng của vi sinh vật gồm 3 loại: vật lý, hóa học, sinh học. 1. Qui luật tác động: Về mặt tử suất, vi sinh vật bị xử lý bởi những tác nhân kháng trùng đều tuân theo cùng những qui luật làm giảm thiểu số lượng của chúng bởi các yếu tố tự nhiên. Quan sát ảnh hưởng của nhiệt, ở một nhiệt độ nào đó, nếu 20% dân số vi khuẩn chết trong phút đầu tiên thì sẽ có 20% dân số sống sót chết vào phút thứ nhì. Chúng ta rút ra qui luật thứ nhất “Một tỉ lệ nhất định vi sinh vật chết trong một khoảng thời gian nhất định”. Tổng số vi sinh vật hiện diện lúc bắt đầu việc tẩy uế có ảnh hưởng đến thời gian cần thiết để loại bỏ chúng. Qui luật thứ nhì “Số lƣợng vi sinh vật càng ít, thời gian cần thiết để đạt tính vô trùng càng ngắn”. Vận dụng qui luật này, chúng ta thường phải rửa sạch sẽ đồ vật trước khi đưa tiệt trùng. Những tác nhân kháng trùng ảnh hưởng một cách khác biệt trên các loài vi sinh vật khác nhau. Hơn nữa, ảnh hưởng này còn khác biệt ở những giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cùng một loài vi sinh vật. Giai đoạn nhạy cảm nhất của hầu hết vi sinh vật chính là thời kỳ tăng trưởng lũy thừa. Từ thực tế này, chúng ta xác định qui luật thứ ba “Vi sinh vật nhạy cảm khác nhau đối với các yếu tố kiểm soát tăng trƣởng của chúng”. 24 2. Cơ chế tác động: Tác động bất lợi của các yếu tố môi trường thường gây tổn hại các cấu trúc quan trọng cho sự sống của tế bào, dẫn đến phá hủy chức năng hoạt động làm cho tế bào chết. Chỉ những tế bào vi sinh vật có thể thay đổi sinh lý hay di truyền để thích nghi thì mới sống sót được. Các tác hại được thể hiện như sau: 1/ Phá hủy thành tế bào. 2/ Thay đổi tính thấm của màng tế bào. 3/ Thay đổi tính keo của nguyên sinh chất (biến tính protein). 4/ Kìm hãm hoạt tính enzyme. 5/ Phá hủy các quá trình sinh tổng hợp. III. CÁC PHƢƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG 1. Các phƣơng pháp hóa học: Hóa chất tiệt trùng thông thường nhất là ethylene oxide, được dùng dưới dạng khí để tiệt trùng đồ vật dễ bị hủy bởi nhiệt. Formol và hơi hydrogen peroxide vẫn được dùng tiệt trùng màng lọc không khí của tủ an toàn sinh học. Gluteraldehyde, diệt nha bào trong vòng 3-10 giờ, dùng cho những y cụ như dụng cụ nội soi vì không ăn mòn thấu kính, kim loại, hay cao su. Peracetic acid, hiệu quả đối với chất hữu cơ, cũng được dùng tiệt trùng bề mặt dụng cụ phẫu thuật. Việc sử dụng gluteraldehyde hay peracetic acid được gọi là quá trình tiệt trùng lạnh. Chúng giết vi sinh vật bằng cách làm biến tính protein và acid nucleic. Chúng diệt được tất cả vi sinh vật và nha bào. Nhóm hóa chất này dùng để tiệt trùng dụng cụ không chịu nhiệt. Sau khi tiệt trùng, cần loại bỏ cho hết hóa chất trước khi sử dụng. 2. Các phƣơng pháp vật lý: Gồm: thiêu đốt, nhiệt ẩm, nhiệt khô, lọc, bức xạ ion hóa (gamma). Sức nóng không những là một tác nhân diệt trùng phổ biến và hiệu quả nhất mà còn r tiền và dễ kiểm soát nhất. Sức nóng diệt trùng bằng cách làm biến tính các enzyme của vi sinh vật. Khi sử dụng phương tiện này chúng ta phải lưu ý đến nhiệt độ thấp nhất và thời gian tối thiểu giết tất cả vi sinh vật. Trong kỹ nghệ đóng hộp người ta còn tính cả giá trị D tức là số phút mà 90% dân số vi khuẩn bị giết chết ở nhiệt độ cho sẵn. -Thiêu đốt là biện pháp thường dùng nhất để xử lý chất thải nhiễm trùng. Vật liệu nguy hiểm bị thiêu thành tro ở nhiệt độ 870-980 oC. Tuy nhiên hạn chế của biện pháp này là sự hiện diện của kim loại nặng trong tro và khí độc thải ra. Hình 1: Lò hấp ướt -Nhiệt ẩm (hơi nước dưới áp suất) dùng tiệt trùng rác nguy hiểm và đồ vật chịu nhiệt. Dụng cụ của phương pháp này là lò hấp ướt (Hình 1). Hơi nước bão hòa dưới áp suất 1 atmosphere, tức 15 psi (pounds per square inch) khiến cho các enzymee và protein cấu trúc bị biến tính không hồi phục. Môi trường cấy, chất lỏng, dụng cụ thường được hấp trong 15-20 phút ở 1210C (2500F). Chất thải nhiễm trùng được hấp ở 1320C (270 0 F) trong 30 - 60 phút. Nhiệt ẩm là phương pháp vật lý tiệt trùng đơn giản nhất và nhanh nhất. -Trong khi đó, sức nóng khô giết vi sinh vật do tác dụng oxid hóa. Sức nóng khô cần thời gian tiếp xúc lâu hơn (1 giờ rưỡi-2 giờ) và nhiệt độ cao hơn (160-1800C). Lò sấy dùng cho mục đích này để tiệt trùng thủy tinh, chất dầu, bột. 25 Hình 2: Màng lọc -Lọc tiệt trùng dùng cho các dung dịch kháng sinh, hóa chất độc, chất đồng vị phóng xạ, vaccine và carbohydrate vốn không bền với nhiệt. Chất lỏng được lọc qua màng cellulose acetate hay cellulose nitrate với máy hút chân không (Hình 2). Không khí được lọc bởi màng lọc tiểu hạt không khí công suất cao (HEPA = high-efficiency- particulate-air) được thiết kế để loại bỏ các vật thể lớn hơn 0,3 m khỏi phòng bệnh cách ly, phòng mổ và tủ an toàn sinh học (Hình 3). Hình 3: Tủ an toàn sinh học cấp 2 -Bức xạ tác động khác nhau phụ thuộc vào độ dài sóng, cường độ và thời gian. Bức xạ ion hóa được dùng cho những thiết bị vi sóng và phóng xạ là các tia gamma ngắn và giàu năng lượng, làm ion hóa nước tạo ra gốc hydroxyl tác dụng lên thành phần hữu cơ của tế bào như DNA khiến tế bào chết. Chúng tiệt trùng vật dụng một lần như ống tiêm nhựa, ống thông, găng trước khi đưa vào sử dụng. IV. CÁC PHƢƠNG PHÁP TẨY UẾ 1. Các phƣơng pháp hóa học: Hóa chất được dùng để hủy diệt mọi dạng sống gọi là hóa chất tiệt trùng (chemical sterilants) nhưng khi dùng trong một thời hạn ngắn hơn thì là chất tẩy uế. Chất tẩy uế sử dụng cho mô sống (da) được gọi là chất sát trùng. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của chất tẩy uế như: - Loại vi sinh vật và số lượng của chúng - Nhiệt độ và pH - Nồng độ hóa chất - Lượng chất hữu cơ hiện diện (máu, mủ, nhày) - Bề mặt chất cần tẩy uế - Thời gian tác động 26 - Loại nước được cung cấp (cứng hay mềm). Những hóa chất tẩy uế khử trùng bằng cách làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và làm mất hoạt tính các enzymee thiết yếu cho sự sống của vi sinh vật. Chúng diệt được vi khuẩn ở dạng dinh dưỡng và đa số virus nhưng không diệt hết nha bào. Chúng ta dùng các hóa chất này để tẩy uế giường bệnh, tường, nền nhà, chăn mền, quần áo; sát trùng da, khử trùng nước. Những chất tẩy uế thông dụng gồm có: - Chất cồn: ethanol và isopropanol không diệt được nha bào và bay hơi nhanh. Do đó, chúng được dùng làm chất sát trùng da rất tốt ở nồng độ 70% hay dùng như chất tẩy uế nhiệt kế và nút cao su lọ thuốc tiêm. - Aldehyde: formaldehyde, gluteraldehyde. Chúng không thường dùng làm chất tẩy uế bề mặt vì hơi của chúng gây kích thích khó chịu. - Halogen: đặc biệt là chlorine và iodine. Nước uống, nước hồ bơi, nước cống thì được tẩy uế bằng dung dịch chlorine. Chlorine dùng dưới dạng sodium hypochlorite (NaOCl, thuốc tẩy); được khuyến cáo lau chùi mặt bàn vấy máu với nồng độ 1:10. Iodine pha thành phức hợp với cồn hay với một polymer trung tính như povidone dùng làm chất sát trùng da trước khi lấy máu hay phẫu thuật. - Kim loại nặng: nitrat bạc vẫn dùng nhỏ mắt tr sơ sinh phòng ngừa nhiễm lậu cầu. Riêng kim loại nặng chứa thủy ngân không còn được dùng do độc tính của thủy ngân đối với môi trường. - Phức hợp nhôm hóa trị 4 được dùng tẩy uế bàn làm việc hay các bề mặt khác trong phòng thí nghiệm. - Tuy nhiên, chất hữu cơ, như máu, có thể bất hoạt kim loại nặng hay phức hợp nhôm hóa trị 4 nên hạn chế tính năng của chúng. - Ozone được dùng xử lý nước uống và một số dụng cụ y tế. - Cuối cùng, các dung dịch phenol, dẫn xuất của carbolic acid, là chất tẩy uế thông dụng trong phòng thí nghiệm. Thêm chất tẩy (detergent) vào các dung dịch, chúng ta được một sản phẩm vừa dùng lau rửa vừa tẩy uế ở nồng độ 2-5%. 2. Các phƣơng pháp vật lý: Ba phương pháp tẩy uế vật lý là: - Đun sôi 1000C trong 15 phút, tiêu diệt vi khuẩn dạng dinh dưỡng. - Thanh trùng theo phương pháp Pasteur: đun nóng đến 630C trong 30 phút hoặc 720C trong 15 giây để diệt vi sinh vật gây nhiễm thực phẩm mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng, mùi vị. Ngày nay sữa được tiệt trùng bằng cách ngược lại, sử dụng nhiệt độ thật cao (UHT) trong thời gian thật ngắn (ví dụ 1400C trong 3 giây). - Dùng bức xạ không ion hóa như tia cực tím. Tia cực tím có độ dài sóng dài và năng lượng thấp, làm hư hại DNA bằng cách tạo cầu nối giữa 2 thymin cạnh nhau. Chúng không xuyên thấu tốt và vi sinh vật cần phải cho tiếp xúc trực tiếp trên bề mặt. Tia cực tím để tiệt trùng không khí, phòng mổ, các chế phẩm y tế và nước uống. (Hình 4) 27 Hình 4: Vùng bức xạ BÀI 6: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN Theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất đối với chế phẩm nhà trường mua được. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Kỹ thuật thực tập vi sinh - khoa Y, Đại học Y Dược TpHCM 2/ Textbook of diagnostic microbiology, 4th ed., 2013. Eds: Connie R. Mahon et al., Saunders Elsevier, U.S.A.