Tách dòng gen LTP (Lipid Transfer Protein) của cây đậu xanh (Vigna radiata L. wilczek)

52(4): 94 - 98 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 1 TÁCH DÒNG GEN LTP (Lipid transfer protein) CỦA CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata L. Wilczek) Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên), Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trần Thúy Liên, Nguyễn Thị Mai Lan (Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên) I. Mở đầu Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilcrek) là cây trồng cạn có vai trò quan trọng bởi hạt đậu xanh là thực phẩm giàu protein và trồng đậu xanh có tác dụng cải tạo đất. Với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt như hạn hán, nóng nắng kéo dài làm cho cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng suy giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và có thể cây bị chết, dẫn đến giảm năng suất, chất lượng hạt đậu xanh. Chính vì vậy, vấn đề tìm kiếm các chỉ thị phân tử của tính chống hạn và nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen nhằm tạo cây chuyển gen chịu hạn là rất cần thiết. Các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ,... giảm phức hợp CO2, protein và các axit nucleic [1], [2]. Sự tổng hợp và tích luỹ các chất trên diễn ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước, với hai chức năng là (i) sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng giữ nước và lấy nước vào tế bào và (ii) ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ của các chất đó. Chúng có thể thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức protein trong màng. Như vậy khả năng giữ nước của tế bào liên quan đến sự tăng áp suất thẩm thấu và độ bền vững của màng tế bào. LTP (Lipid transfer proteins) thuộc họ gen pathogenesis - relate, có khả năng tổng hợp protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tới màng. LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường [5], [10]. Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro các hợp tử cellulose xyloglucan của thành tế bào thực vật có thể được gây ra do các LTP; Mặc dù chưa có bằng chứng in vivo song khám phá này chắc chắn sẽ đem lại các câu hỏi thú vị về cơ chế mở rộng thành tế bào thực vật [7]. Những phân tử protein do gen LTP tổng hợp thường có nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa, và với sự có mặt của 8 phân tử cysteine làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [11]. Khi gặp những điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tăng tổng hợp nên các sản phẩm protein tăng cường vận chuyển phospholipid tới màng, tăng khả năng giữ nước của màng tế bào nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống stress hạn. Trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu về gen LTP ở các đối tượng thực vật, như Solanales lycopersicum L. [11], Zea mays L. [8], Papper [4], Triticum L. [6], Daucus carota L. [9], và Oryza satyva L. [12]. Trong bài báo này, chúng tôi công bố kết quả tách dòng gen LTP khuếch đại từ ADN hệ gen của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu Bảy giống đậu xanh do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu (Bảng 1). Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái của 7 giống đậu xanh nghiên cứu S TT Tên giống Màu thân mầm Màu vỏ hạt Khối lượng 1000 hạt (g) 1 DX208 Xanh Xanh bóng 75,30±0,015 2 Đỗ Quế Xanh Xanh mốc 44,20±0,025 3 DX14 Xanh Xanh mốc 65,86±0,040 4 DX04 Xanh Xanh bóng 66,31±0,015 5 V123 Xanh Xanh bóng 63,95±0,020 6 T135 Xanh Xanh mốc 50,54±0,032 7 PAEC3 Tím Vàng bóng 60,75±0,010 52(4): 94 - 98 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 95 Cặp mồi nhân gen LTP được chúng tôi thiết kế và đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Trình từ cặp mồi nhân gen LTP Mồi Trình tự mồi (5’-3’) LTPF ATGGCTAGCCTGAAGGTTGC LTPR TTACTTGATGTTAGCGCAGTT Phương pháp nghiên cứu - ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Gawel và Jarnet (1991) [3]. - Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR nhân gen LTP được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. - Sản phẩm PCR của gen LTP được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Gen được làm sạch bằng bộ Kit của hãng Bioneer và gắn trực tiếp vào vector pBT, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5. Tách plasmid mang gen LTP phục vụ cho đọc trình tự gen bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. III. Kết quả và thảo luận 1. Kết quả nhân gen LTP từ các giống đậu xanh Các giống đậu xanh trên đã được đánh giá khả năng chịu hạn kết quả cho thấy chỉ số chịu hạn tương đối giảm dần ở các giống như sau: DX208 > DX04 > T135> V123 > DX14 > Đỗ Quế > PaEC3. Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở trên, chúng tôi tiếp tục nhân gen để kiểm tra sự có mặt của gen LTP ở các giống đậu xanh này và đọc trình tự cũng như so sánh để tìm chỉ thị phân tử gen LTP cho đăc tính chịu hạn của cây đậu xanh. Do chưa có trình tự nucleotide của gen LTP phân lập từ DNA tổng số nên chúng tôi dựa vào cơ sở dữ liệu khai thác từ ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số AY300807 để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân và phát hiện sự có mặt của gen LTP ở các giống đậu xanh phục vụ cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống đậu xanh có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường. Để nhân được đoạn gen này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số. Tối ưu nhiệt độ và thành phần của phản ứng PCR (Bảng 3). Nhiệt độ gắn mồi thích hợp nhất cho nhân gen LTP là 560C. Bảng 3. Thành phần của phản ứng PCR nhân gen LTP STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O khử ion 12,5 2 Buffer PCR (10X) 2,5 3 Mg+2 (25 mM) 2,5 4 dNTP (25 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pMol) 2,0 6 Mồi ngược (10 pMol) 2,0 7 Taq polymerase (5 U/l) 0,5 8 DNA mẫu (50 ng) 1,0 Tổng 25,0 Đoạn gen LTP của 7 giống đậu xanh được nhân từ DNA tổng số bằng phương pháp PCR. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose (Hình 1). Hình 1 cho thấy, mỗi giống nhận được một đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 350 bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 1. Hình ảnh điện di kết qủa nhân gen LTP của 7 giống đậu xanh Ký hiệu: M. Marker 1kb 1.DX208; 2. Đỗ Quế; 3. DX14; 4. DX04; 5. V123; 6. T135; 7. PAEC3 Từ kết quả nhân gen ở trên chúng tôi lựa chọn 2 giống đậu xanh có chỉ số chịu hạn cao (DX208 và DX04) và hai giống đậu xanh có chỉ số chịu hạn thấp nhất (Đỗ Quế và PaEC3) để tiếp tục tách dòng gen. M 1 2 3 4 5 6 7 250 bp 350bp 52(4): 94 - 98 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 96 2. Kết quả tách dòng gen LTP Quá trình tách dòng được thực hiện theo các bước: (1) Gắn sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch vào vector tách dòng pBT (Hình 2); (2) Biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α. Sau khi biến nạp chủng E. coli DH5α được cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) có kháng sinh ampixilin (100mg/ml), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40mg/ml), ủ hộp lồng petri ở 370C trong 16 h. Kết quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng (Hình 3). Chọn khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang nuôi ở môi trường có LB lỏng (có bổ sung ampixilin 100mg/ml) qua đêm. Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn đem kiểm tra sản phảm chọn dòng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi pUC18, để xác định khuẩn lạc chứa mang gen mong muốn. Hình 2. Cấu trúc của vector tách dòng pBT 52(4): 3 - 12 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 4 Hình 3. Hình ảnh khuẩn lạc mang gen LTP Sản phẩm colony - PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromit 1 % và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình 4). Mồi pUC được thiết kế chung cho các vector tách dòng, nên khi kiểm tra sản phẩm PCR vừa Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR M. Marker 1 Kb dòng hóa thì kích thước của đoạn gen sẽ cao hơn 124 bp. Điều này có nghĩa là kích thước của đoạn gen vừa nhân khoảng 474 bp. Kết quả điện di ở hình 4 cho thấy, sản phẩm colony - PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả dương tính với cả 4 băng và đều đúng kích thước dự đoán. Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, chúng tôi tiếp tục ti ến hành tách plasmid. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromit 1 % và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím (Hình 5). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lượng và số lượng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotit. Hình 5. Kết quả điện di tách plasmid mang gen LTP IV. Kết luận 52(4): 3 - 12 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 5 - Đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhân gen LTP, tối ưu hóa thành phần của phản ứng PCR và nhiệt độ gắn mồi nhân đoạn gen LTP. - Đã khuếch đại thành công gen LTP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác tại Ngân hàng gen Quốc tế. Sản phẩm PCR được dòng hoá nhờ vector pBT. - Chọn được dòng vi khuẩn E. coli DH5α chứa vector tái tổ hợp và tách được plasmid mang đoạn gen LTP phục vụ việc xác định trình tự nucleotit. Tài liệu tham khảo [1]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội. [2]. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan giữa hàm lượng proline và tính chống chịu ở cây lúa”, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr. 85-95 [3]. Gawel T.J, Jarret R.L. (1991), Geneomic DNA isolation, [4]. Jung H.W., Hwang B.K. (2000), Isolation partial sequencing, and expression of pathogensis-related cDNA genes from pepper leaves infected by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Molecular Plant-Microbe Interactions 13, pp. 136-214. [5].Kader J.C. (1996), Lipid trans protein in plants, Annual Review of Plant Molercular Biology 47, pp. 627-654. [6]. Monia A., Garcia O.F. (1993), Developmetal and pathogen induced expression of three barley genes encoding lipid transfer protein, The Plant Journal, 4: 983-991. [7]. Nieuwland J., Feron R., Huisman BA., Fasolino A., Hilbers CW., Derksen J., Mariani C. (2005), Lipid transfer proteins enhance cell wall extension in tobacco. Plant Cell. ;17(7):2009-2019. [8] Sossountzov L., Ruiz A.L., Vignols F., Jolliot A., Aroundel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac E., Delseny M. (1991), Spatial and temporal expression of a maize lipid transfer protein gene. The Plant Cell, 3, pp. 923-933. [9]. Sterk P., Booij H., Schellekens G.A., Van Kammen A, De Vries S.C. (1991), Cell-speciffic expession of the carrot EP2 lipid transfer protein gene, The Plant Cell , 3: 907-921. [10]. Tassin S., Broekaert W.F., Marion D., Acland D.P., Ptak M., Vovelle F., Sonado P. (1998), Solution structure of Ace AMP1, a potent anti-microbial protein extraction from onion seeds. Structural analogies with plant nonspeciffic lipid transfer protein, Biochemistry, 37, pp. 3623-3637. [11]. Terres Schumann S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A. (1992), A probable lipid transfer protein is induced by NaCl in stems of tomato plants, Plant Molecular Biology, 105, pp.749-757. [12]. Vignols F., Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M. (1994), Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein, Gene, 142, pp. 420-426.